Summary
Syftet med denna studie var att efterlikna den infödda tre skiktad arkitektur i kärlväggen. För att åstadkomma detta var electrospinning anställd med hjälp av en 3-1 (input-output) munstycke och blandningar av polycaprolactone, elastin och kollagen.
Abstract
Under hela infödda artär, kollagen och elastin spelar en viktig roll, vilket ger en mekanisk stomme, förebygga kärl brista och främja återvinning i pulserande deformationer. Målet med denna studie var att efterlikna strukturen för infödda artär genom att tillverka ett mångsidigt electrospun kanal bestående av poly (caprolactone) (PCL) med tillägg av elastin och kollagen med blandningar av 45-45-10, 55-35 - 10 och 65-25-10 PCL-ELAS-COL att demonstrera mekaniska egenskaper som tyder på infödda arteriella vävnaden, medan resterande främjar vävnadsregenerering. Hela ympar och enskilda skikten analyserades med enaxlig dragprovning, dynamisk efterlevnad, suturer behålla och brast styrka. Överensstämmelse Resultaten visade att ändringar i mitten / mediala lagret förändrats totalt transplantat beteende med hela transplantat följs värden mellan 0,8 till 2,8% / 100 mmHg, medan enaxlig Resultaten visade en genomsnittlig modul rad 2,0 till 11,8 MPa. Både modul och efterlevnad av data som visas värden inom intervallet infödda artär. Matematisk modellering har genomförts för att visa hur förändringar i lager styvhet påverkar den totala perifera väggen stress, och som en konstruktion stöd för att uppnå den bästa mekaniska kombination av material. Sammantaget visade resultaten att ett transplantat kan utformas för att efterlikna en tri-skiktad struktur genom att ändra lageregenskaper.
Protocol
- Före electrospinning, kollagen, från 6 månaders nötkreatur läderhuden, måste utvinnas med hjälp av en ättiksyra baserad process. Detta utvinns kollagen renas sedan genom en efterföljande serie upplösningar, nederbörd och dialysbehandlingar. När kollagen är frystorkad kan electrospinning processen börja.
- Tre material hopade: polycaprolactone (PCL), elastin (ELAS) och kollagen (COL). Dessa material kommer att var för sig löst i 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol (HFP, TCI Amerika) i koncentrationer på 100 mg / ml, 200 mg / ml och 70 mg / ml.
- Materialen blandas i fem olika skintillationsflaskor på volymetriska förhållandet mellan 98-2-0 PCL-ELAS-COL (intima), 45-45-10, 55-35-10 och 65-25-10 PCL-ELAS-COL (media) och 70-0-30 PCL-ELAS-COL (adventitia).
- För enaxlig dragprovning och enskilda skikt provning av överensstämmelse, var varje material individuellt electrospun, medan flera lager vaskulära transplantat för burst, suturer behålla och provning av överensstämmelse var electrospun från en 3 till 1-konfiguration. Enaxlig dragprovning ställningar var platt och rektangulär (2,5 cm bred x 10,2 cm lång x 0,3 cm tjock) sedan två dorn mm diameter används för att electrospin enskilda lager och flera lager kneg var för små för stansning prover.
- För både enskilda och multi-layer electrospinning var polymerlösningar laddas i en plast 3 ml Becton Dickinson spruta med en 18 gage trubbig spets nål, och placeras på en sprutpump vid en bestämd apotek takt. Individuella electrospinning skattesatser har fastställts till 4 ml / timme, medan flera lager electrospinning räntor har varierat beroende på övergång och lager. Flöden och volymer var som sådan: Intima var electrospun med en hastighet av 4 ml / tim och en volym på 0,5 ml följt av en övergång kombinerar både intimans och mediala sprutor för 0,2 ml 2 ml / timme vardera. Den intimans sprutan var då avstängd och mediala lagret fick spinn för 0,6 ml 4 ml / h följt av en övergång mellan media och adventitia för 0,2 ml av polymer lösning på 2 ml / timme vardera. Slutligen var media stoppas och adventitia fick spinn för 0,4 ml 4 ml / timme.
- Samtliga prover var tvärbunden i 50 mm EDC i 18 timmar innan någon test 1.
- Enaxlig dragprovning utfördes på sex prover från en electrospun ark hydrerad i PBS i 24 timmar. "Dog-bone" formade prover stansas ut från electrospun mattor och testade på en MTS Bionix 200 testsystem med en 100 N lastcell och en förlängning hastighet av 10,0 mm / min. Peak stress, modul och töjning vid brott har beräknats med hjälp TestWorks version 4.
- Sutur behålla Testet utfördes på sex 2 mm innerdiameter tubulär prover från sex olika electrospun transplantat, indränkt i PBS i 24 timmar vid 37 ° C, på en MTS Bionix 200 testsystem med en 50 N lastcell (MTS Systems Corp) och en förlängning hastighet av 150,0 mm / min i enlighet med rakt över som beskrivs i American National Standards Institute 2. 5-0 kommersiella PDS II violetta monofilamentgarn sutur placerades 2 mm från slutet av provet och förlängts till suturen hade dragit igenom transplantat. Topplast spelades in i gram-kraft, genom att TestWorks version 4.
- Sprickmotstånd tester utfördes på sex prover från sex olika electrospun ympkvistar. Burst rör, 2-3 cm i längd, var släckt i PBS, monteras över 1,5 mm nipplar anslutas till enheten, och säkras med 2-0 silke sutur. Air infördes i systemet, vilket ökar trycket i en takt av 5 mmHg / s tills rören sprack 2. Resultaten redovisas som trycket i mmHg där rören spruckit.
- Dynamisk efterlevnad bestämdes för sex 2 mm innerdiameter tubulära transplantat tas från sex olika electrospun transplantat vid en längd av 3 cm under simulerade fysiologiska förhållanden. Både enskilda lager och flera lager rörformiga konstruktioner var electrospun och testades under samma förhållanden. De prover testades i en intelligent Tissue Engineering via mekanisk stimulering (artiklar) Bioreaktor utvecklats av Technologies Vävnadstillväxt fylld med PBS vid 37 ° C. Den bioreaktor som en 1Hz förändring cykliska trycket på insidan av transplantat, där tre olika trycknivåer för 90/50, 120/80 och 150/110 mmHg systoliskt / diastoliskt undersöktes 2, 3.
Representativa resultat
När electrospinning protokollen genomförs korrekt bör slutprodukten bli en mjuk, sömlösa rör med något inledande tecken på delaminering mellan skikten. När enaxlig dragprov, brast hållfasthetsprovning, suturer tester behålla och tester efterlevnad genomförs bör tyder resultaten på att den mediala skiktet styvheten ökar med minskad mängd elastin, bör den tillhörande mekaniska egenskaper visar en styvare rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiska delen av denna studie är electrospinning processen. När du använder en 3-1 input-output-munstycke, övergripande och ladda förlust kan förekomma. Om detta skulle inträffa, kommer spänningen i samband med polymer som snurrar minskar orsakar svetsade, "våta" fibrer och skapa delaminering mellan de tre skikten. Därför konsekvent elektrisk potential är avgörande för att erhålla ett idealiskt flera lager rör.
Efterlevnad obalans är en av de främsta orsakerna till transplantat ocklusion på liten diameter nivå. Utveckla ett mångsidigt vaskulära transplantat ger möjlighet att skräddarsy ympa egenskaper mot något som skulle kunna imitera den naturliga biomekanik och arkitektur av infödda artär. Som steg i bearbetningen ett mångsidigt vaskulära graft framsteg i framtiden kommer våra labb undersöka eventuella begränsningar som delaminering av lagren, medan ställningen genomgår nedbrytning utöver tillräcklig porstorlek för cellulära infiltration. För att testa detta kommer både acellulärt och cellulära in vitro nedbrytningen studier utföras under statisk och dynamisk kultur. Dessa tester kommer att bestämma både flyttande kapacitet ställningar och hur de kommer på ett effektivt sätt försämras under fysiologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Flera författare har USA och internationella patent gäller teknik som presenteras i detta manuskript, och denna teknik har licensierats till organogenesen, Inc.
Acknowledgments
Vi vill tacka American Heart Association Mid-Atlantic Affiliate (0555407U, GLB) för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | ||
| Elastin | Elastin Products Company | ||
| Collagen | |||
| Acetic Acid | Fisher Scientific | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | ||
| TRIS | Fisher Scientific | ||
| 6 L Avanti J-HC Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol | TCI America | ||
| 3 ml Becton Dickinson Syringe | |||
| CZE1000R Rack Mount Power Supply | Spellman | ||
| High-Pressure Syringe Pump | Cole-Parmer | ||
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide | Pierce, Thermo Scientific | ||
| 70 % ethanol | Sigma-Aldrich | ||
| ImageTool 3.0 software | Shareware provided by UTHSCSA | ||
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| MTS Bionix 200 testing system | MTS Systems Corp. | ||
| TestWorks version 4 | |||
| Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation (ITEMS) Bioreactor | Tissue Growth Technologies |
References
- McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization. Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).
- Cardiovascular implants - Vascular graft protheses. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).
- McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomater. , (2010).
