Transgene wormen worden vaak gebruikt in C. elegans Onderzoek. Beschreven is een eenvoudige, maar effectieve, protocol om transgenen te introduceren in wormen met behulp van biolistische bombardement met DNA-gecoate gouddeeltjes. De inspanning betrokken en de resultaten van bombardement gunstig in vergelijking met micro-injectie voor het genereren van transgene dieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Het aantal laboratoria met behulp van de vrij levende nematode C. elegans groeit snel. De populariteit van deze biologische model wordt toegeschreven aan een snelle generatietijd en korte levensduur, makkelijk en goedkoop onderhoud, volledig gesequenced genoom, en het aanbod van RNAi middelen en mutant dieren. Bovendien, de analyse van de C. elegans genoom onthulde een grote overeenkomst tussen wormen en hogere gewervelde dieren, wat suggereert dat het onderzoek in wormen kunnen een belangrijke aanvulling op studies uitgevoerd geheel muizen of gekweekte cellen. Een krachtig en belangrijk onderdeel van worm onderzoek is de mogelijkheid om transgene dieren te gebruiken om gen-lokalisatie en functie te bestuderen. Transgene dieren kunnen worden gemaakt ofwel via micro-injectie van de worm kiembaan of door het gebruik van biolistische bombardement. Bombardement is een nieuwere techniek en is minder bekend een aantal laboratoria. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om transgene wormen genereren door biolistische bombardement met gouddeeltjes met behulp van de Bio-Rad PDS-1000-systeem. In vergelijking met DNA micro-injectie in de hermafrodiet kiembaan, dit protocol is het voordeel dat er geen speciale vaardigheden van de operator met betrekking tot het identificeren van worm anatomie of het uitvoeren van micro-injectie. Verdere meerdere transgene lijnen worden meestal verkregen uit een bombardement. Ook in tegenstelling tot micro-injectie, biolistische bombardement produceert transgene dieren met zowel extrachromosomaal arrays en geïntegreerde transgenen. De mogelijkheid om geïntegreerde transgene lijnen te krijgen kan voorkomen dat het gebruik van mutagene protocollen aan buitenlandse DNA integreren. Concluderend kan biolistische bombardement een aantrekkelijke methode voor het genereren van transgene dieren, met name voor de onderzoekers niet geïnteresseerd in het investeren van de tijd en inspanning die nodig is om te worden bedreven in het micro-injectie.
Protocol
Overzicht
Traditioneel transgene wormen werden gegenereerd door microinjecting transgen DNA in de C. elegans kiembaan 1,2,3,4. Hoewel succesvol, deze aanpak vereist gespecialiseerde apparatuur en de ontwikkeling van ervaring met worm anatomie en de micro-injectie techniek. Meer recent biolistische bombardement is ontwikkeld als een alternatieve benadering die DNA-gecoate gouddeeltjes gebruikt om vreemd DNA te introduceren in de geslachtscellen 5,6. Deze aanpak vergt minder tijdsinvestering in termen van de praktijk om succesvol te worden.
De biolistische bombardement van C. ele....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Biolistische bombardement is een eenvoudige methode om vreemd DNA te introduceren in vele organismen, met inbegrip C. elegans 1,5,6,7,16. Het vertrouwt op gouddeeltjes het vormen van een complex met DNA in de aanwezigheid van CaCl 2. Kationische polyaminen, zoals spermidine, beschermen DNA van nuclease degradatie in vivo. Omdat spermidine is een labiel molecule, is het belangrijk om het op te slaan in kleine porties bij -20 ° C, en de oplossing te maken vlak voor het uitvoeren van het bomb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door zaad middelen van de universiteit van Pittsburgh en de NIH subsidie AG028977 naar ALF
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gouddeeltjes | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Midiprep-kit | Qiagen | 12143 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamine | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| PDS-1000/He Hepta System | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Scheurdisk | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nystatine | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomycine | MP Biomedicals | 100556 |
Referenties
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
