Summary
sialidase परख एक साधारण तकनीकी दृष्टिकोण है कि माइक्रोबियल संक्रमण और जीना मैक्रोफेज की कोशिका की सतह पर रिसेप्टर स्तर पर भड़काऊ रोगों में भागीदारी के TLR सेंसरों के उपन्यास आणविक तंत्र (ओं) को स्पष्ट करेंगे.
Protocol
1. जमे हुए बृहतभक्षककोशिका कक्ष Resurrecting
- -80 से जमे हुए कोशिकाओं resurrecting से पहले डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, एक संस्कृति बाँझ फ़िल्टर Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और 5 μg / एमएल plasmocin के साथ पूरक का उपयोग मध्यम तैयार की जरूरत है. Plasmocin एक एंटीबायोटिक समाधान को समाप्त करने के लिए और सेल संस्कृतियों के mycoplasma प्रदूषण को रोकने के हमारे अनुसंधान में इस्तेमाल किया है.
- जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी के लिए, एक 4 एमएल, सुसंस्कृत माध्यम से एक 25 सेमी एक बाँझ biohazard रोकथाम हुड में 2 सेल संस्कृति फ्लास्क 1 एमएल कहते हैं.
- जब -80 ° सी फ्रीजर से जमे हुए कोशिकाओं की शीशी ले रहे हैं, वे जल्दी से बाँझ डाकू, जो के बारे में 2-3 मिनट लेता में हाथ वार्मिंग से thawed.
- जैसे ही कोशिकाओं thawed रहे हैं, वे जल्दी से वातानुकूलित माध्यम का उपयोग कर एक 1ml बाँझ विंदुक युक्त कुप्पी में स्थानांतरित कर रहे हैं.
- फ्लास्क कोशिकाओं से युक्त एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रखा जाता है.
- कोशिकाओं के विकास और एक दैनिक आधार पर पालन करने के लिए जाँच की जब तक वे एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 75% से 90% मिला हुआ हो.
- सेल संस्कृति ऊष्मायन के दौरान 12 मिमी परिपत्र गिलास स्लाइड उन्हें कवर biohazard रोकथाम कैबिनेट में 1 घंटे के लिए एक बड़ा गिलास पेट्री डिश में 70% इथेनॉल में द्वारा निष्फल कर रहे हैं, शराब बाद में और निकाल दिया जाता है reusage लिए भंडारित किया, और गीला कांच पक्षों बाँझ फ़िल्टर कैबिनेट में हवा का प्रवाह एक यूवी के तहत 24 घंटे के लिए या जब तक वे सूख रहे हैं उजागर करने के लिए.
2. Sialidase परख के लिए चढ़ाना कक्ष
- कोशिकाओं चढ़ाना से पहले, एक एकल बाँझ परिपत्र गिलास स्लाइड ध्यान में एक अच्छी तरह से एक बी.डी. फाल्कन के 24 ढक्कन के साथ अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति इलाज polystyrene प्लेट रखा गया है एक निष्फल ज्वलंत पूर्ण घुमावदार, 4 ", दाँतेदार, स्टेनलेस स्टील forcep का उपयोग 75% संगम पर कक्षों की एक फ्लास्क के लिए, हम आमतौर पर संस्कृति की थाली के 12 कुओं का उपयोग करें.
- पक्षपाती बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं के लिए, DMEM वातानुकूलित माध्यम बाँझ रोकथाम कैबिनेट में एक 5 एमएल बाँझ पिपेट का उपयोग कर कुप्पी से निकाल दिया जाता है. पक्षपाती कोशिकाओं 1x बाँझ Tris के साथ एक बार धो खारा 7.4 पीएच किसी भी सीरम युक्त मध्यम निकालने के लिए, और कैल्शियम मध्यम मुक्त फॉस्फेट (CMF) के 1 एमएल जोड़ने buffered 7.4 पीएच पर्याप्त करने के लिए कोशिकाओं को कवर पर खारा buffered. कोशिकाओं लगभग 10 मिनट के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में रखा जाता है या जब तक कोशिकाओं फ्लास्क में बंद लिफ्ट शुरू. फ्लास्क धीरे हो या हिल सकता है किसी भी शेष पक्षपाती कोशिकाओं को ढीला करने के लिए हिल.
- कुप्पी में 1 एमएल निलंबित कोशिकाओं के DMEM वातानुकूलित माध्यम की 3 एमएल जोड़ने. निलंबित कोशिकाओं का 0.5 एमएल लो और sterilely उन्हें ऊतक सुसंस्कृत 12 मिमी परिपत्र गिलास स्लाइड युक्त थाली को हस्तांतरित. लगभग 0.5 x 10 6 कोशिकाओं परिपत्र गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं .
- टिशू कल्चर प्लेट युक्त कोशिकाओं 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस 5% में 24 घंटे के लिए सीओ 2 के क्रम में कोशिकाओं के लिए परिपत्र गिलास स्लाइड का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए.
3. Sialidase परख
1. नियंत्रण बनाना
- एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस (पाले सेओढ़ लिया: 1 अंत, 1slide, 25 x 75 x 1 मिमी) और नियंत्रण कैबिनेट या प्रयोगशाला बेंच में अनुक्रमिक क्रम में मिश्रण निम्नलिखित यौगिकों से जोड़ने के लिए: 1 μL 4-MUNANA DAKO + 1 μL और अंत + Tris के 3 μL खारा 7.4 पीएच (टीबीएस) buffered.
- से एक ही कोशिकाओं से युक्त मीडिया को हटाने के बाद, धीरे से 4 "अच्छी तरह से कोने करने के लिए forcep के साथ परिपत्र गिलास स्लाइड लिफ्ट ध्यान forcep के साथ कांच स्लाइड हटाने और कोशिकाओं पर मिश्रण समाधान पर सामना करना पड़ रहा के साथ स्लाइड जगह. खुर्दबीन स्लाइड.
- तत्काल, एक महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी जो यूवी फ़िल्टर के लिए सेट किया गया है और फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा करने के लिए एक डिजिटल कैमरा है microcope स्लाइड ले.
- चरण विपरीत के तहत खुर्दबीन फोकस है जब तक आप कक्षों देख सकते हैं और तब फ्लोरोसेंट मोड के लिए स्विच कर सकते हैं. 1 मिनट, 2 मिनट और 3 मिनट में फ्लोरोसेंट के तहत कक्षों की तस्वीरें ले लो. चरण विपरीत के तहत कोशिकाओं के एक एकल तस्वीर ले लो.
2. सकारात्मक टेस्ट बनाना
- 1 μL 4-MUNANA DAKO + 1 μL + LPS के 2 μL + टीबीएस के एक μL: अनुक्रमिक क्रम में एक और खुर्दबीन स्लाइड पर निम्नलिखित यौगिकों स्पॉट.
- 3.1.2 के लिए 3.1.4 कदम ऊपर दोहराएँ.
3. सकारात्मक टेस्ट एक साथ बनाना neuraminidase अवरोध करनेवाला Tamiflu के साथ
- अन्य खुर्दबीन स्लाइड पर निम्न अनुक्रमिक क्रम में निम्न यौगिकों स्पॉट: 1μL DAKO + 4 MUNANA 1μL + 2 LPS की μL + Tamiflu के एक μL.
- Tamiflu सांद्रता 1x Tris में पूर्व तैयार buffered खारा 7.4 पीएच, परिपत्र गिलास स्लाइड पर जीवित कोशिकाओं के साथ संपर्क में यौगिकों के अंतिम एकाग्रता 5 की एक कमजोर पड़ने कारक होगा.
- 3.1.2 के लिए 3.1.4 कदम ऊपर दोहराएँ.
4. अवरोध करनेवाला के एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए Sialidase गतिविधि के 50% (50 आईसी) को बाधित करने की जरूरत
- कोशिकाओं के आसपास के फ्लोरोसेंट यों के लिए, छवियों ImageJ 1.38x RBG को मापने के लिए प्लगइन का विश्लेषण के साथ विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं. 50 कोशिकाओं के आसपास के प्रतिदीप्ति के यादृच्छिक स्थान रीडिंग ले लो और कुल प्रतिदीप्ति का मतलब की गणना.
- 50 आईसी लॉग इन इकाइयों के रूप में परिवर्तित (जैसे, लॉग एनजी एमएल /) x-अक्ष पर y-अक्ष nonlinear प्रतिगमन का उपयोग पर मतलब प्रतिदीप्ति के खिलाफ अवरोध करनेवाला एकाग्रता की एक साजिश से उत्पन्न होता है.
5. सफलता के लिए गोपनीयता
- सुनिश्चित करें कि संस्कृति में कोशिकाओं mycoplasma संदूषण से मुक्त कर रहे हैं. हम नियमित रूप से एक संस्कृति माध्यम में Plasmocin का उपयोग करने के लिए इस के लिए नियंत्रण.
- कृत्रिम neuraminidase सब्सट्रेट, 4-MUNANA, इस्तेमाल किया जा हौसले से तैयार करना चाहिए. तैयार सब्सट्रेट sialidase परख के लिए एक सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यदि सेल लाइन कोशिका की सतह पर एक कम रिसेप्टर अभिव्यक्ति है, एक उत्तेजना के लिए ligand के एक उच्च खुराक का उपयोग कर सकते हैं.
- हम यह भी अनुभव किया है कि 6 बार के लिए passaged कोशिकाओं उनके रिसेप्टर phenotype खो सकता है. हौसले से पुनर्जीवित कोशिकाओं सुसंस्कृत होना चाहिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
देखें प्रतिनिधि के परिणाम में संलग्न के साथ sialidase परख की एनिमेटेड प्रोटोकॉल PowerPoint फ़ाइल है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
नव विकसित परख का उपयोग करने के लिए रहते बृहतभक्षककोशिका 2 कोशिकाओं में sialidase गतिविधि का पता लगाने, हम ligand प्रेरित sialidase गतिविधि में में रहते हैं sialidase गतिविधि बीएमसी-2 एक खुराक निर्भर तरीके के रूप में अच्छी तरह से जीने में बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं डीसी 2.4 वृक्ष के समान कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 के स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं, मानव WT और 1140F01 और WG0544 प्रकार मैं sialidosis fibroblast कोशिकाओं. Tamiflu (oseltamivir फास्फेट) की तरह neuraminidase inhibitors 50 0.0194 के एक आईसी सुक्ष्ममापी के साथ बीएमसी-2 कक्षों neuraminidase अवरोध करनेवाला (दाना 2 - डिओक्सी -2, 3 - dehydro के लिए 19.17 सुक्ष्ममापी की एक 50 आईसी की तुलना में रहते हैं thymoquinone प्रेरित sialidase गतिविधि हिचकते DN-acetylneuraminic एसिड) 5. हम यह भी सूचित किया है कि विशिष्ट विरोधी Neu1, -2 और 3 एंटीबॉडी जैसे अन्य अनुप्रयोगों बीएमसी 2 रहते हैं और मानव में TQ प्रेरित sialidase गतिविधि का कोई निषेध THP-1 बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं है, लेकिन विरोधी Neu4 एंटीबॉडी पूरी तरह से इस गतिविधि ब्लॉक. वहाँ sialidase गतिविधि का एक आवेदन करने के लिए एक जोरदार sialidase TQ के साथ जुड़े गतिविधि का पता लगाने के रहते प्राथमिक अस्थि मज्जा (बी एम) बृहतभक्षककोशिका एक माध्यमिक Neu1 कमी (NeuI केडी) के साथ एक चूहों पर नहीं Neu4 पीटा WT और hypomorphic cathepsin से ली गई कोशिकाओं का इलाज किया है ( Neu4 को) 1,2,5 चूहों. इसके अलावा, काली खांसी (PTX) विष, जी प्रोटीन युग्मित (GPCR) रिसेप्टर और मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) galardin और piperazine की व्यापक रेंज inhibitors के Gαi प्रोटीन की एक विशिष्ट अवरोध करनेवाला के लिए बीएमसी-2 जीना लागू THP-1 और प्राथमिक बी.एम. बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं को पूरी तरह TQ प्रेरित sialidase 5 गतिविधि ब्लॉक. ये वही निरोधात्मक प्रभाव GM1 ganglioside विशिष्ट हैजा विष सबयूनिट (CTXB) बी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से CTX के साथ, tyrosine kinase अवरोध करनेवाला K252a, और व्यापक रेंज GPCR अवरोध करनेवाला suramin के साथ नहीं मनाया जाता है. एमएमपी 9 के विशिष्ट अवरोध करनेवाला, विरोधी एमएमपी 9 एंटीबॉडी और विरोधी Neu4 एंटीबॉडी एमएमपी-3 पूरी तरह से ब्लॉक TQ प्रेरित में रहते हैं sialidase गतिविधि के विशिष्ट अवरोध करनेवाला नहीं है, लेकिन THP-1 कोशिकाओं जिस पर Neu4 और एमएमपी-9 व्यक्त सेल सतह 5.
साथ में ले ली है, sialidase परख के लिए ligand प्रेरित रिसेप्टर ligand की प्रकृति पर निर्भर करता है Neu1 या Neu4 तरह sialidases शामिल सक्रियण के आणविक तंत्र को शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ligand प्रेरित sialidase ligand बाध्य रिसेप्टर द्वारा मध्यस्थता गतिविधि का तेज़ी से पता चलता है कि NGF TrkA, BDNF TrkB और टॉल की तरह रिसेप्टर्स की तरह ग्लाइकोसिलेटेड रिसेप्टर्स कोशिका की सतह झिल्ली पर ligand बाध्य रिसेप्टर के एक आणविक संगठनात्मक मंच से जुड़े एक संकेतन प्रतिमान फार्म Gαi प्रोटीन, एमएमपी 9 और Neu1 या Neu4 sialidase. Ligand बाध्यकारी संबंधित रिसेप्टर्स GPCR झिल्ली Gαi प्रोटीन और MMP-9 सक्रियण के माध्यम से संकेत के माध्यम से sialidase गतिविधि लाती है. Neu1 या Neu4 और MMP-9 कोशिका की सतह पर रिसेप्टर के साथ परिसर में पार बात sialidase की एक तेजी से सक्रियण करने के लिए सक्षम बनाता है एक कार्यात्मक रिसेप्टर पैदा करने में रिसेप्टर संघ सियालिक एसिड steric hinderance हटायें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
एसआरए और पी.जे. पहले लेखक के रूप में समान रूप से योगदान दिया.
Acknowledgments
मिसेज के लिए अनुदान के द्वारा आंशिक समर्थन प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान, एआरसी के लिए हैरी Botterell फाउंडेशन, और गारफील्ड केली कार्डियोवास्कुलर अनुसंधान और विकास कोष से है. एसआरए रानी के विश्वविद्यालय के अनुसंधान पुरस्कार और रॉबर्ट जे विल्सन फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है. पी.जे. रानी ग्रेजुएट पुरस्कार और रॉबर्ट जे विल्सन फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है. एजी और एसए रानी ग्रेजुएट पुरस्कार के प्राप्तकर्ता हैं. एस एफ विज्ञान और प्रौद्योगिकी (OGSST) में ओंटारियो ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता था. एजी रानी फ्रेंकलिन ब्रेकन ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता है. SA रानी रुपये McLaughlin ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के प्राप्तकर्ता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (Oseltamivir Phosphate) | Hoffmann-La Roche AG |
References
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R. Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase. Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).
- Woronowicz, A. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase. Glycobiology. 17, 10-24 (2007).
- Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling. Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).
- Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9. Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).
- Seyrantepe, V. Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1. Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).
