Neste vídeo, demonstramos as técnicas experimentais usadas para fabricar compliant, matriz extracelular (ECM) substratos revestidos adequado para cultura de células, e que são passíveis de microscopia de força de tração e observando os efeitos da rigidez ECM no comportamento de células.
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Artigo de método
Preparação de Matrizes Reclamação para Quantificar contração celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A regulação da adesão celular à matriz extracelular (ECM) é essencial para a migração celular e remodelação ECM. Aderências focais são conjuntos macromoleculares que o casal o citoesqueleto de actina F-contrátil ao ECM. Esta conexão permite a transmissão de forças mecânicas intracelular através da membrana celular ao substrato subjacente. Trabalho recente mostrou as propriedades mecânicas do ECM regular de adesão focal e F-actina morfologia, bem como numerosos processos fisiológicos, incluindo a diferenciação celular, divisão, proliferação e migração. Assim, o uso de substratos de cultura de células tem se tornado um método cada vez mais prevalente para controlar com precisão e modular as propriedades mecânicas ECM.
Para quantificar as forças de tração em aderências focal em uma célula aderente, compatível substratos são usados em conjunto com imagens de alta resolução e técnicas computacionais em um método denominado microscopia de força de tração (TFM). Esta técnica se baseia em medições da magnitude local e direção de deformações do substrato induzida pela contração celular. Em combinação com alta resolução da microscopia de fluorescência de proteínas fluorescentes marcados, é possível correlacionar organização do citoesqueleto e remodelação com as forças de tração.
Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para a preparação de duas dimensões, matrizes compatíveis com a finalidade de criar um substrato de cultura celular com um bem caracterizados, rigidez ajustável mecânica, que é adequado para medir a contração celular. Estes protocolos incluem a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida, revestimento de proteínas em gel de ECM como, células de revestimento em gel, e de alta resolução da microscopia confocal usando uma câmara de perfusão. Além disso, oferecemos uma amostra representativa de dados demonstrando localização e magnitude das forças de celulares utilizando protocolos citados TFM.
Protocolo
1. Ativando a superfície lamela
- Lamelas (# 1.5, 22x40 mm) são limpos usando uma série de lavagens e sabão de etanol em um protocolo previamente descrito (Waterman-Storer, 1998) para limpar e remover o pó.
- Lamínulas lugar em um rack de aço inoxidável titular, de tal forma que as lamínulas são espaçadas e não tocar.
- Em química coifa (luvas de borracha nitrílica e óculos de proteção recomendado), diluir a força total de 3 aminopropyltrimethoxysilane em isopropanol para uma concentração final de 2% (2ml silano / 100 ml de isopropanol) para encher um prato de vidro quadrado (~ 350 ml de volume). Devido à reatividade com plástico, use um copo....
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Discussão
O procedimento descrito aqui para a instalação de uma microscopia de força de tração (TFM) experimento, juntamente com a implementação de rotinas de monitoramento computacional (Sabass et al., 2008), permite a quantificação das forças celulares com resolução de micro-escala espacial. Para otimizar o protocolo experimental, é fundamental para formar um substrato de gel puro e uniforme, com revestimento uniforme do ligante ECM. Discutimos potenciais armadilhas abaixo:
Não uniforme da sup.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao laboratório de Ulrich Schwarz para software de monitoramento computacional usado em quantificação das forças de tração celular (Sabass et al., 2008). Este trabalho foi financiado por um Prémio Carreira Burroughs Wellcome e Prêmio NIH Director da Pioneer (DP10D00354) para ML Gardel e cientista médico Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (5 GM07281 T32) para inverno SP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropiltrimetoxissilano | Aldrich | 28, 177-8 | |
| Acrylamida 40% | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Bis-acrylamida 2% | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Persulfato de amônio | Fisher Scientific | BP179 | |
| Microesferas fluorescentes de 40 nm | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| Câmara de imagem confocal (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| Centrífuga para lamínulas | Caseira | NA | |
| Lâmpada ultravioleta CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| Grade de aço inoxidável | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acrilol-X, SE (6-((acrilol)amino)hexanoico) | Invitrogen | A-20770 | |
| Hidrazina hidratada | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| Periodato de sódio | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-4 | |
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Colágeno | BD Biosciences | 354236 | |
| Lâminas de cobertura (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| Glutaraldeído | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| Ácido acético | Acros Organics | 64-19-7 |
Referências
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer
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