在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

摘要

我们将演示如何研究单个点突变对离子通道功能的影响。

摘要

我们将演示如何研究在离子通道中引入点突变的功能效应。我们研究的是G蛋白门控内向整流钾通道（简称GIRK通道），这类通道在调节神经元兴奋性方面具有重要作用。哺乳动物体内存在四种不同的GIRK通道亚单位（GIRK1–GIRK4），本实验聚焦于GIRK2，因其可形成同源四聚体。激活不同类型的G蛋白偶联受体（GPCR），如毒蕈碱型受体（M2R），可导致GIRK通道的激活。此外，酒精也可直接激活GIRK通道。我们将展示如何通过特异性改变GIRK通道cDNA中的一个或多个核苷酸，实现单个氨基酸的突变。该突变后的cDNA序列将在细菌中扩增并纯化，随后通过DNA测序确认点突变的存在。将野生型与突变型GIRK通道的cDNA转染至培养的人胚肾HEK293T细胞中 体外最后，将采用全细胞膜片钳电生理技术研究异源表达的野生型或突变型GIRK通道中的宏观钾电流。在本实验中，我们将检测GIRK2通道中L257W突变对M2R依赖性和酒精依赖性激活的影响。

方案

1. 定点突变

我们使用编码GIRK2 cDNA的哺乳动物表达质粒pcDNA3.1，并根据制造商说明书，利用Stratagene（Agilent Technologies）的Quikchange XL II定点突变试剂盒引入点突变。

引物序列可使用以下网站提供的在线引物设计程序轻松生成：
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

注意：我们使用标准的 Eppendorf 1.5 mL 离心管替代方案中所述的 BD 14 mL 管。然而，使用经 β-巯基乙醇预处理的 XL10-Gold 超感受态 E. coli、30 秒热激时间以及 NZY⁺（或 NZYM⁺）培养基，对于成功进行定点突变至关重要。如有可能，在引入突变的同时设计一个额外的同义突变以产生新的限制性酶切位点，将有助于后续对突变菌落的筛选。

2. 质粒小提、DNA 测序与质粒大提

2.1 使用Qiagen质粒小提试剂盒进行质粒提取及测序。

挑取单个细菌菌落，在含有氨苄青霉素（AMP）的LB肉汤中培养。按照试剂盒说明书纯化cDNA。若在上述第1步中引入了限制性酶切位点，则可通过简单的限制性酶切鉴定来确认突变是否成功引入。DNA自动测序在体外完成，对于确认cDNA中突变的存在以及评估是否存在任何非预期突变至关重要。此步骤非常重要。我们使用位于pcDNA3.1质粒多克隆位点两侧的T7启动子正向引物和BGH反向测序引物，对整个GIRK编码序列进行测序。

注意：必须仔细检查测序色谱图，以确保测序数据质量足够高。高质量的色谱图表现为尖锐、不重叠的峰，且背景噪音较低。

2.2 Qiagen 大提纯。

我们遵循制造商的说明。

注意：我们在实验中包含此步骤，以提高cDNA的纯度，我们发现这对高效的转染至关重要。

3. HEK293T 细胞的培养与转染

所有这些步骤都应在无菌的组织培养罩内进行。

3.1 细胞培养

HEK293T细胞易于培养（37°C、5% CO₂的湿化培养箱），具有快速增殖、高转染效率以及适用于全细胞膜片钳电生理记录等优点，因此使用起来十分方便。HEK293T细胞表达SV40大T抗原，可确保pcDNA3.1质粒的附加体复制。

HEK293T 细胞在含 L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清（FBS）的低糖 DMEM 培养基中培养。传代细胞时，向汇合度为 90–95% 的 HEK293T 细胞加入 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，待细胞从培养皿上脱落后再加入含 FBS 的新鲜培养基以终止酶活性。将约 1 × 10⁵ 个细胞/孔接种至 12 孔细胞培养板中，每孔加入 1 mL 无抗生素的培养基。（1 × 10⁵ 个细胞约为从长满的 T25 培养瓶中加入 10 mL 培养基重悬后所得细胞悬液的 350 μL）。

3.2 转染

转染前，HEK细胞需在培养皿中贴壁培养8–24小时。使用Invitrogen Lipofectamine 2000试剂，将0.2 μg通道cDNA、0.4 μg M2R受体cDNA和0.04 μg YFP cDNA共转染至细胞中。注意：我们使用少量YFP cDNA以标记成功转染的细胞（呈现绿色荧光的细胞通常同时表达GIRK通道和M2受体）。不同克隆所需cDNA的浓度需根据实际情况进行优化调整。

3.3 转染细胞的荧光观察

将12孔板放置在倒置荧光显微镜的载物台上，观察细胞的YFP表达情况。与明场差分干涉（DIC）图像进行比较，记录绿色荧光细胞的大致数量。由此可估算转染效率。

3.4 24 孔板和多聚赖氨酸包被盖玻片的准备

将12 mm的玻璃盖玻片（Warner，CS-12R）用Radiacwash振荡清洗过夜，随后用去离子水冲洗，并在95%乙醇中振荡过夜。将清洗后的盖玻片保存在70%乙醇中，直至使用。

将盖玻片放入盛有乙醇的培养皿中，用镊子夹起盖玻片并在火焰上烧去乙醇，然后放入无菌24孔板的一个孔中。

每孔加入 250 μL 多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液 [0.2 mg/mL]，将盖玻片置于 PDL 溶液中，在超净台内浸泡过夜。用 Parafilm 封膜包裹 24 孔板以防止蒸发。

次日早晨，吸除PDL溶液，并用无菌水洗涤2次。将培养板打开，在生物安全柜中晾干，然后盖上盖子。包被有盖玻片的24孔板可用无菌铝箔包裹，于室温下保存数周。

3.5 将转染的 HEK293T 细胞接种到盖玻片上

转染后24小时，将细胞接种至24孔板中（每孔约4 × 10³ 个细胞），孔内含多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片。注意：转染后的细胞可在转染后24–72小时内使用。将细胞分种是为了为膜片钳电生理实验提供独立的盖玻片。

4. 电生理学

4.1 配制溶液

细胞外（灌流）溶液：20 mM KCl，140 mM NaCl，0.5 mM CaCl₂，2 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。

分装 20K 浴液并加入适当的调节剂

• 20K + Ba²⁺：含 1 mM BaCl₂ 的溶液，为内向整流电流的特异性抑制剂
• 20K + 卡巴胆碱（Carbachol）：含 5 μM Carbachol 的溶液，为特异性 M2R 激动剂；M2R 可与 G 蛋白偶联，从而开放 GIRK 通道
• 20K + 乙醇（Ethanol）：含 100 mM EtOH 的灌流液，用于直接激活 GIRK 通道

将浴液放入快速置换灌流系统的注射器（溶液容器）中。注意：我们使用 Warner 夹管阀系统来控制浴液。建议使用 PE 管。

内液/电极溶液：140 mM KCl，20 mM NaCl，5 mM EGTA，5.4 mM MgCl₂，10 mM HEPES（pH 7.4），含 2.5 mM K₂ATP 和 0.3 μM Li₂GTP。

我们配制不含ATP和GTP的电极液。将ATP和GTP分别分装，于-80°C保存，并在实验当天加入电极液中。将装有最终电极液的注射器置于冰上，以保持ATP/GTP的活性。使用0.2 μm滤膜对内液/外液进行无菌过滤，以抑制微生物生长，并降低管路和电极堵塞的可能性。

4.2 拉制电极

我们使用 Narishige 两步垂直拉制仪和 Warner Instrument 的硼硅酸盐玻璃电极（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 7.5 cm），在用细胞内溶液填充后，获得电阻为 3–7 MΩ 的电极。

注意：必须在实验室内针对电极拉制仪和电极玻璃的类型通过实验确定具体参数。对于我们的垂直拉制仪，第一次拉制的加热设定为 60.2，第二次拉制约为 43。

4.3 全细胞膜片钳

1. 使用少量凡士林将盖玻片固定在35 mm培养皿中，加入外部溶液覆盖，并将培养皿置于倒置荧光显微镜的载物台上。使用微分干涉差（DIC）聚焦并寻找细胞，切换至YFP荧光以定位YFP阳性细胞。
2. 将灌流多路管的尖端置于绿色细胞附近（距离目标细胞20–30 μm，相当于2–3个细胞长度）。
3. 用溶液填充电极，并将其连接至Axopatch 200B放大器（Axon Instruments）的前置放大器头级，初始设置如下：增益（Gain）为1，配置为全细胞模式（whole-cell β=1），工作模式为电压钳（V-clamp）。
4. 对电极施加正压以防止移液管堵塞，并使用操纵器将电极尖端置于细胞正上方。
5. 为将电极电位归零，选择“封接测试”（Seal Test）按钮以施加一个测试电压阶跃。在Clampex的封接测试窗口中将出现一个5 mV的矩形电压阶跃。调节放大器上的电极偏移电位器（Pipette Offset potentiometer），使基线电流归零至0 nA。或者，也可将放大器模式选择器切换至V-track模式，将仪表旋钮（meter knob）调至Vtrack，再使用放大器上的电极偏移电位器将放大器仪表显示的电压调至“0.00”。
6. 使用Clampex 8.2软件的封接测试命令检查电极电阻（应为3–7 MΩ）。
7. 打开已保存的实验协议文件或创建新协议。要打开协议文件，请从主菜单选择“Acquire”（采集），然后选择“Open Protocol”（打开协议），并选择一个已保存的电压协议文件。本实验所用协议设定为：将膜电位钳制在-40 mV，施加一次50 ms的单阶跃电压至-100 mV，随后在200 ms内斜升至+40 mV。该协议每2秒执行一次。此斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位和内向整流特性。对于电压门控离子通道，使用矩形电压阶跃可能更为合适。
8. 使用操纵器的微调功能接近细胞，释放正压，在接触细胞表面后施加负压，并在封接测试示波器窗口中监测电阻的上升。当电阻达到GΩ范围时，表明电极已与细胞膜形成紧密封接（即已形成Gigaseal）。
9. 施加短暂的负压脉冲以破裂细胞膜，从而进入细胞内部。一旦进入全细胞构型，将观察到电容性电流的增加。
10. 切换至Clampex中的“膜测试”（Membrane Test）模式，记录接入电阻（Ra）、膜电阻（Rm）、膜电容（Cm），并通过肉眼观察理论曲线与实际电容性电流的指数拟合情况。膜电容与细胞大小成正比，后续将用于计算电流密度。
11. 切换回封接测试模式，将V-Out（膜电位）设定为-40 mV，并将滤波器设置为10 kHz。
12. 通过以下步骤在放大器上对膜电容和串联电阻进行补偿：
    1. 打开“全细胞电容”（WHOLE CELL CAP）开关。反复调节“全细胞电容”（WHOLE CELL CAP）和“串联电阻”（SERIES RESISTANCE）旋钮，直至测试脉冲呈平坦状。必要时还需调节移液管电容快速补偿（FAST CAP）旋钮。
    2. 将“预测百分比”（% PREDICTION）旋钮调至约60–80%，再次调节“全细胞电容”和“串联电阻”旋钮（可能还需同时调节移液管电容补偿FAST CAP旋钮）。
    3. 将“补偿百分比”（% COMP-）调至100%，同时避免细胞振荡，并通过重新调节“全细胞电容”和“串联电阻”旋钮尽量保持脉冲平坦（可能还需调节移液管电容补偿FAST CAP旋钮）。通过减小时间常数来调节滞后时间。
    4. 在实验记录本中记录放大器上设置的膜电容（Cm）、串联电阻（Rs）、%COMP、%PRED和滞后时间。Cm和Rs的值应与前述“膜测试”中测得的Cm和Rm大致相同。
13. 打开外部溶液阀门以控制浴槽溶液。将放大器的8极贝塞尔滤波器设为2 kHz，打开电压钳协议并开始记录电流。
14. 我们采用斜升协议记录GIRK电流：先施加50 ms的-100 mV阶跃，随后在200 ms内从-100 mV斜升至+40 mV，每2秒重复一次。该斜升协议可用于观察GIRK通道的反转电位及其内向整流特性。在室温（22–25°C）下，当浴液中含有20 mM KCl时，GIRK电流的反转电位应接近-50 mV（与计算的钾离子平衡电位E_K = -50 mV相近），在高于E_K的电位下电流保持相对平坦。
15. 实验方案：在记录稳定基线后，切换至20K + 氯乙酰胆碱（Carbachol）溶液，等待反应达到峰值；再切换回20K浴液；接着施加20K + 乙醇溶液，等待其峰值反应；然后切换回20K浴液，最后施加20K + Ba²⁺溶液。在施加这些药物期间，将观察到GIRK电流幅度的变化（在-100 mV时最为显著）。在实验记录本中注明不同细胞外溶液施加对应的扫描序号。单个Clampfit文件将包含整个实验的所有扫描记录。

5. 数据分析

我们使用 Clampfit 9.2 软件在 -100 mV 条件下分析 GIRK 电流数据。

1. 打开记录文件，将光标设置在 -100 mV。默认情况下，屏幕上将显示所有叠加的曲线。点击“Write cursors”图标后，可生成类似 Excel 的电子表格，包含数值数据。
2. 将 X 轴指定为曲线编号列，Y 轴指定为光标列，然后点击“Create Graph”图标，即可快速绘制实验的时间进程图。
3. 通过从仅含外部灌流液记录的电流（“20K 电流”）中减去含 Ba²⁺ 时的电流，计算基础电流（“20K 电流”减去“20K + Ba²⁺ 电流”）。通过从 20K 条件下的基础电流中减去激活状态下的电流，计算诱导电流（“20K + 卡巴胆碱电流”减去“20K 电流”；“20K + 乙醇电流”减去“20K 电流”）。通过将电流除以膜电容（直接从放大器读取）计算电流密度（pA/pF）。通过将诱导电流除以基础电流再乘以 100，计算激活百分比。

6. 代表性结果

应能够记录转染了野生型通道的细胞中的电流。在含有 20 mM K⁺ 的细胞外溶液（以及 145 mM K⁺ 的细胞内溶液）中测量 GIRK 通道时，应观察到明显的内向整流特性以及约 -50 mV 的反转电位，这是钾通道的基本特性。施加卡巴胆碱后，野生型电流将显著增加（较基础电流增加 3-5 倍），并对 100 mM 乙醇产生类似反应。注意：电生理学中的符号约定为，内向电流为负，外向电流为正。对于 GIRK2 酒精结合口袋中的 L257W 突变，将观察到对卡巴胆碱和乙醇的反应均减弱。这表明 L257 参与了酒精和 G 蛋白对 GIRK2 通道的激活过程。有关 GIRK2 突变实验结果的更多示例，请参见 Aryal et al.¹ 的近期发表文章。

图1. Clampfit 8.0 窗口显示野生型GIRK2记录的数据文件。 左上方图显示在不同外部bah溶液存在下，对斜坡电压方案响应所记录的叠加扫描曲线。光标1位于-100 mV处。光标数值被写入电子表格（右侧面板）。左下方图显示扫描次数与电流的关系图。注意乙醇（EtOH）和卡巴胆碱（Carb）引起电流增加（向下偏转），而Ba²⁺引起电流抑制。

图 2. Clampfit 8.0 窗口显示突变型 GIRK2-L257W 记录的数据文件。 说明同图 1。请注意突变通道中卡巴胆碱（Carb）激活作用的丧失以及乙醇诱导电流的减弱。

讨论

定点突变是研究离子通道结构与功能关系的经典方法。该方法基于以下假设：通过改变离子通道中的关键残基，应能观察到通道功能的显著变化。相反，若在非关键位置引入突变，则通常不会对通道功能造成重大影响。通常，首先将目标残基突变为丙氨酸（一种小的非极性氨基酸），随后再突变为色氨酸（氨基酸中体积最大的一种）²。如果该残基对通道功能至关重要，则这两种突变均会改变通道活性；而若突变发生在较不重要的残基上，其效应（尤其是突变为丙氨酸）往往不明显。由于色氨酸体积较大，更容易因空间位阻效应而导致功能改变。当缺乏结构信息时，常可在通道的某一片段内系统性地进行丙氨酸或色氨酸突变（称为丙氨酸扫描或色氨酸扫描），以定位关键残基。值得注意的是，可同时平行构建多个含有不同点突变的克隆，从而在相对较短时间内检测多个残基的功能。近年来，多种离子通道的晶体结构已被解析^3,4,5，这些结构信息可用于预测潜在的关键残基，并通过本实验方案所述的方法加以验证。

对野生型通道的测量应始终与突变通道的测量同时进行，以作为阳性对照，确保转染和电生理实验操作正确。点突变可能导致无功能性电流产生、电流与野生型相似，或通道活性的调控发生改变。无法检测到电流可能是由于蛋白质折叠异常或转运改变所致。在此情况下，可通过生物素化实验或针对细胞外标签的免疫荧光染色（不进行细胞通透化处理），检测通道是否正确转运至细胞表面，从而区分位于细胞膜上的非功能性通道与滞留在细胞内的通道。最后，建议不仅研究通道的基础活性，还应探究突变对通道调控的影响。可根据所研究的离子通道类型，探讨不同的功能调节机制，包括G蛋白、PIP2、离子、ATP浓度、磷酸化（利用酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸突变）、泛素化或类泛素化修饰（利用赖氨酸突变）以及直接通道激动剂或阻断剂对通道功能的调节作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学品	Sigma	不同
小型质粒提取试剂盒	Qiagen	27104
放射性去污清洗剂	Biodex	005-100
聚-D-赖氨酸氢溴化物	BD 生物科学	CB40210	聚-L-赖氨酸也可使用
Maxi Prep 试剂盒	Qiagen	12263
QuickChange XL II 定点突变试剂盒	Stratagene	200512-5
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
盖玻片 ˆ… 12 毫米	Warner Instruments	CS-12R
毛细玻璃管 硼硅酸盐-标准壁厚	Warner Instruments	G150-3
倒置荧光显微镜	Leica	DMI3000 B
电生理学	尼康 Leica 蔡司	任何倒置的微分干涉相差（DIC） （霍夫曼） 荧光显微镜
放大器	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B 放大器
灌注系统	Warner Instruments	VC-6 灌注 MM-6
数字化仪	Molecular Devices	Digidata 1320 数字转换器
操纵器	Sutter Instruments	操纵器：MP-85
电极拉制仪	Narishige	PC10 垂直电极拉制仪
分离台	技术制造公司	气浮台