In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion

Summary

Clathrin-medierad endocytos beror på adaptern proteiner som samordnar gods urval och clathrin päls montering. Här beskriver vi rutiner för att studera adapter-clathrin fysisk interaktion och levande cell imaging tillvägagångssätt med som en modell jästen endocytic Sla1p adapter protein.

Abstract

En stor endocytic bana inleder med bildandet av clathrin belagda vesiklar (CCVs) att transportera gods från cellytan till endosomes ^1-6. CCVs kännetecknas av en polyhedral galler av clathrin som rockar vesikler membranet och fungerar som en mekanisk klätterställning. Clathrin skikt monteras under vesikler bildning från enskilda clathrin triskelia, den lösliga formen av clathrin består av tre tunga och tre subenheter lätt kedja ^7,8. Eftersom triskelion inte har förmåga att binda till membranet direkt clathrin bindande adaptrar är avgörande för att länka bilda clathrin gitter till membranet genom samarbete med lipider och / eller membranproteiner ^9. Adaptrar även paket transmembrana protein gods, såsom receptorer, och kan interagera med varandra och med andra delar av CCV bildandet maskiner ^9.

Över tjugo clathrin adaptrar har beskrivits, flera är inblandade i clathrin endocytos och andra lokalisera till trans Golgi nätverket eller endosomes ^9. Med undantag av HIP1R (jäst Sla2p), alla kända clathrin adaptrar binder till N-terminal-propeller domän clathrin tunga kedjan ^9. Clathrin adaptrar är modulära protein bestående av vikta domäner sammankopplade med ostrukturerad flexibel linkers. Inom dessa linker regioner, kort bindande motiv medla interaktion med clathrin N-terminal domän eller andra delar av vesikler bildning maskiner ^9. Två skilda clathrin-bindande motiv har definierats: den clathrin box och W-ruta ^9. Samförståndet clathrin-box-sekvensen definierades ursprungligen som L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] ^10, men varianter har därefter upptäckt ^11. W-boxen följer sekvensen PWxxW (där x är några rester).

Sla1p (Syntetiska Lethal med aktin bindande protein-1) var ursprungligen identifierats som en associerad aktin protein och är nödvändig för normal aktin cytoskelettet struktur och dynamik i endocytic platser i jästceller ^12. Sla1p binder också NPFxD endocytic sortering signal och är kritiskt för endocytos av last som bär NPFxD signalen ^13,14. Mer nyligen var Sla1p visat att binda clathrin genom ett motiv som liknar den clathrin rutan LLDLQ, kallas en variant clathrin-box (VCB), och att fungera som en endocytic clathrin adapter ^15. Dessutom har Sla1p blivit ett vanligt förekommande markör för endocytic pälsen i levande mikroskopi cell fluorescens studier ^16. Här använder vi Sla1p som en modell för att beskriva metoder för adapter-clathrin interaktionsstudier. Vi fokuserar på levande celler fluorescensmikroskopi, GST-pull down, och co-immunoprecipitation metoder.

Protocol

1. Införande av en GFP-tagg och markör i SLA1 genen

Applicera Longtine metod ¹⁷ för att fixera en GFP-tagg direkt på 3 'änden av SLA1 genen öppna läsram (Sla1p C-terminal) och samtidigt markera genen med E. coli Kan ^r gen som möjliggör G418 urval.

1. Generera en DNA-fragment med PCR använda som mall plasmiden pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 ¹⁸ och följande grundfärger: framåt, 5'-CA AGG CAA GCC AAC-ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ", och omvänt, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3". De understrukna sekvensen motsvarar SLA1 genen specifika segmentet närmast föregående (framåt primer) och efter stopp kodon (omvänd primer). Isolera PCR-produkten med agarosgelelektrofores följt av DNA-rening.
2. Förbered en 50 ml kultur S. cerevisiae SEY6210 stam (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) ¹⁹ i YPD, växer så tidigt logaritmiska fas (OD ₆₀₀ = 0,2-0,6). Spin i rumstemperatur i 3 min vid 2000 xg, tvätta två gånger med sterilt vatten.
3. Förvandla PCR-fragment som erhålls i steg 1 i cellerna med hjälp av metoden litium acetat ^20. Tvätta cellerna med 1 ml sterilt vatten, tillsätt 1 ml YPD och inkubera i 4 h vid 30 ° C i en shaker.
4. Sprid celler YPD-G418 plattor välja för G418-resistenta transformants, inkubera vid 30 ° C i 2-3 dagar. Plocka kolonier och strimmig dem på YPD-G418 plattor.
5. Använda koloni-PCR, identifiera transformants där GFP-kan-modulen var väl integrerad med SLA1 gensekvenser med hjälp av homolog rekombination. Använd en framåt primer som anneals inom SLA1 öppna läsram och en omvänd primer som anneals inne i GFP-kan-modul. Identifiera kolonier som PCR-produkter har den förväntade storleken och kontrollera av sekvensering.
6. Skärm kolonierna genom fluorescensmikroskopi för att bekräfta att de har GFP fluorescens.

2. Mutation av den variant clathrin rutan (VCB) i SLA1 genen

1. Presentera en LLDLQ att AAALQ mutation i SLA1 gen (nukleotider 2407-2415) efter en två steg ^15.
2. Först förstärka SLA1 nukleotider 1207-1410 och 2427-2589 med PCR och klona fragment i Noti / BamHI och EcoRI / Sali platser i pBluescriptKS, respektive.
3. Subclone i BamHI / EcoRI platser en PCR-fragment som innehåller URA3.
4. Klyva den resulterande plasmiden med Noti / Sali, isolera URA3 fragment av gel rening, och införa den genom att litium-acetat omvandling till de Sla1-GFP stam som genereras i del 1, eller i TVY614 (MATA ura3-52 leu2-3112 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) ^21.
5. Sprid celler på kompletteras SD-skyltar saknas uracil. Bekräfta genom att koloni-PCR och sekvensering att Ura + kolonierna innehåller integreras ordentligt URA3 ersätta VCB fragmentet.
6. I ett andra steg, subclone SLA1 nukleotider 1207-2589 i Noti / Sali platser i pBluescriptKS. Använda QuickChange-XL site-directed mutagenes kit (Stratagene), muterar VCB rester LLDLQ till AAALQ. Verifiera av sekvensering.
7. Klyva den resulterande konstruera med BsgI / AgeI, och isolera den muterade VCB innehåller fragment av gel rening. Cotransform den BsgI / AgeI fragment med pRS313 (HIS3) ²² in i stammen beräkningen i del 2.3.
8. Sprid celler på kompletteras SD-skyltar saknas histidin. Replica-platta Hans + kolonier på agar medium som innehåller 5-fluorotic syra för att identifiera celler där muterade sekvenser ersättas URA3 därmed återskapa sla1 genen innehåller LLDLQ till AAALQ mutation (sla1 ^AAA). Bekräfta genom att koloni-PCR och sekvensering.

3. Fluorescensmikroskopi

1. Växa jäststammar Sla1-GFP och sla1 ^AAA-GFP genereras i del 1 och 2 i 4 ml kompletteras SD-media vid 30 ° C i en rotator i mörker tills nå en OD ₆₀₀ = 0,1 till 0,4. Spin 1 ml kultur i mikrocentrifug vid 4000 xg under 1 minut vid rumstemperatur. Kasta ~ 950 l av supernatanten. Resuspendera cellerna i de kvarvarande vätska (~ 50 l).
2. Deposition 3 ìl av cellsuspension på en mikroskopi bild och täck med ett glas täckglas. Skydda provet från ljus.
3. Montera glida på en 100x olje-nedsänkning målet om en snurrande-skiva konfokalmikroskop.
4. Leta rätt fokalplan celler med brightfield belysning eller 488 nm laser med lämpliga filter för att excitera och upptäcka fluorescens från GFP.
5. Fånga tidsförlopp bilder av Sla1-GFP och sla1 ^AAA-GFP i celler med exponeringstid på 500 ms (eller lämpligt värde) vid enn intervall på en bild per sekund för 150 sekunder. Förväntat resultat: GFP märkt punctae visas på insidan av att begränsa cellens membran, kvarstår i flera sekunder, och rör sig mot mitten av cellen som signalen snabbt försvinner (visar päls demontering).
6. Välj en del av en bild där fläckar syns att framträda, vara i flera sekunder, och försvinner. Beskär den här delen av bild för varje bildruta av tidsförlopp bilder.
7. Generera en kymograph motsvarar denna del av bilden i varje bildruta av de 150 andra gång-lapse bilden genom att rikta in bilder längs en axel som motsvarar förfluten tid.
8. Beräkna längden på varje plats baserat på hur många sekunder (time-lapse ramar) fläckarna finns i kymograph. Observera att varje plats bör "kurva" in mot det inre av cellen som den håller på att försvinna, vilket avspeglar endocytos och demontering av pälsen.
9. Jämför vildtyp Sla1-GFP med sla1 ^AAA-GFP. Upprepa för att avgöra om resultaten är statistiskt signifikanta. Förväntat resultat: sla1 ^AAA-GFP fläckar kvar betydligt längre (~ 80 sek) än vild typ (~ 30 sek) tyder på en defekt i pälsen bildas ^15.

4. Beredning av jäst cytosolic extrakt och totalt cellextrakt

1. Inokulera 3 liter YPD med ett lämpligt jäst stam, såsom TVY614 ^21, och växa vid 30 ° C i en shaker kuvös tills nå en OD ₆₀₀ = 1-2.
2. Centrifugera jästkultur i rumstemperatur i 20 minuter vid 3700 x g.. Kasta bort vätskefasen, tillsätt 3-5 ml sterilt vatten, och pipettera upp och ner tills pellets är helt återsuspenderade.
3. Häll ~ 150 ml flytande kväve i en 250 ml plastbägare. Flash-frysa jäst genom att lägga droppvis i flytande kväve i ett cirkulärt mönster för att undvika agglutination av den frysta pellets. Låt inte pellets tinas, lägga till mer flytande kväve vid behov.
4. Chill en rostfri mixer behållare genom att hälla flytande kväve i den. Låt flytande kväve för att nästan helt försvinna. Lägg den frysta jästen pellets till den kalla mixer behållaren. Stäng mixer behållaren med en kall gummipropp och slipa jästen pellets i 10 sekunder. Vänd behållaren 3-4 gånger för att blanda innehållet och upprepa slipsteg två gånger. Marken frysta jästen kommer att ha en pulver-liknande utseende.
5. Chill en tratt och en 50 ml koniska rör med flytande kväve. Med hjälp av kallt tratt, överföra marken jästen till röret. Den frusna marken jästen kan förvaras vid -80 ° C eller användas omedelbart.
6. För att få en cytosoliskt extrakt för GST-fusionsproteinet affinitet analys (del 5), vikt 3 g frusen mark TVY614 jästen i en 15 ml koniska rör och återsuspendera i 3 ml rumstemperatur buffert A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mm DTT) med cocktail proteashämmare (Sigma).
7. Cap och vänd röret flera gånger tills den är helt upptinad och sedan lägga på is.
8. Ultracentrifugen extraktet vid 4 ° C i 20 min vid 300 tusen x g. Försiktigt Överför supernatanten (cytosoliskt extrakt) till en konisk tub med hjälp av en pipett utan att störa pelleten. Håll cytosoliskt extrakt på is.
9. Tillsätt 100 ìl av en 50% (v / v) glutation-Sepharose slam i buffert A. Det är bekvämt att skära i slutet av spetsen för att underlätta pipeting kulorna. Rotera vid 4 ° C i 15 min, spinn-ned kulorna genom centrifugering vid 4 ° C i 2 min vid 1000 xg, och överför supernatanten (cytosoliskt extrakt) till ett nytt rör. Reserv 50 l av extrakt för ingående kontroll.
10. För att få total cell extrakt för samarbete immunoprecipitation experiment (Del 6), använd stam TVY614 (WT SLA1), den sla1 ^AAA stammen bär en LLDLQ att AAALQ mutation som genereras i del 2 i TVY614 bakgrund och en sla1 stam som bär en strykning av SLA1 gen som GPY3130 ^23. Vikt 2 g av motsvarande frusna marken jäst i koniska rör och återsuspendera dem i 2 ml rumstemperatur buffert A, som innehåller cocktail proteashämmare (Sigma) och 2% Triton X-100.
11. Cap och vänd röret flera gånger tills den är helt upptinad och sedan Inkubera på is i 10 min, regelbundet blanda genom inversion.
12. Överför materialet till mikrocentrifugrör och snurra vid 4 ° C i 15 min vid 16.000 xg (toppfart på mikrocentrifug). Försiktigt föra över supernatanten (totalt cell extrakt) till en konisk tub på isen med hjälp av en pipett utan att störa pelleten.
13. Tillsätt 100 ìl av en 50% (v / v) protein A-Sepharose slam i buffert A. Rotera vid 4 ° C i 15 min, spinn-ned kulorna genom centrifugering vid 4 ° C i 2 min vid 1000 xg, och överföra supernatanten (totalt extrakt) till ett nytt rör. Reserv 50 l av extrakt för ingående kontroll.

5. GST-fusionsprotein affinitet analys

1. Amplify med PCR ett fragment containing den Sla1p varianten clathrin-box (VCB) (rester 803-807), klon det i pGEX-5X att få pGEX-5X-VCB. Verifiera av sekvensering.
2. Använda pGEX-5X-VCB som en mall och QuickChange-XL site-directed mutagenes kit (Stratagene), muterar VCB rester LLDLQ att AAALQ att få pGEX-5X-vCBmut. Verifiera av sekvensering.
3. Express moms och fusionsproteiner GST-VCB och GST-vCBmut i E. coli (BL21 DE3), rena med hjälp av glutation-Sepharose, eluera från pärlor med reducerat glutation, dialyze mot PBS, och bestämma protein koncentration.
4. Etikett 3 mikrocentrifugrör: GST, GST-VCB och GST-vCBmut, och tillsätt 1 ml PBS, 30 ìl av en 50% (v / v) glutation-Sepharose slam i buffert A och 50 mikrogram dialized GST, GST -VCB, eller GST-vCBmut proteiner fusion.
5. Rotera i rumstemperatur i 30 min för att möjliggöra bindande.
6. Tvätta pärlor 2 gånger med PBS och 1 gång med buffert A. Tillsätt 1 ml jäst cytosolic extrakt - bereds enligt anvisningarna i del 4 - till varje rör.
7. Rotera rören 1 h vid 4 ° C, snurra 10 sek vid 5000 xg till pellets kulorna, kassera supernatanten och snabbt tvätta pärlor 3 gånger med buffert A som innehåller 0,1% Triton X-100, och 1 gång med buffert A.
8. Spinn ner kulorna en gång till och med en spets gel loading bort så mycket vätska som möjligt. Vid denna punkt proverna kan förvaras vid -20 ° C för att fortsätta vid ett senare tillfälle.
9. Tillsätt 15 ìl av 2x Laemmli prov buffert till varje rör, inkubera vid 96 ° C i 5 min, och snurra 10 sek vid 5000 x g.
10. Analysera prover genom immunoblotting använda en antikropp mot clathrin tunga kedjan. Förväntade resultat: clathrin binder till GST-VCB men inte GST eller GST-vCBmut. Också analysera proverna med SDS-PAGE för att bekräfta liknande lastning av GST fusionsproteiner.

6. Co-immunoprecipitation analys

1. Etikett 3 mikrocentrifugrör: WT (vild typ SLA1), sla1 ^AAA, och sla1Δ, och tillsätt 1 ml PBS, 30 ìl av en 50% (v / v) protein A-Sepharose slam i buffert A och 2 mikrogram en kanin anti-Sla1p antikropp.
2. Rotera i rumstemperatur i 30 min.
3. Tvätta pärlor två gånger med PBS och en tid med buffert A som innehåller 1% Triton X-100.
4. Tillsätt 1 ml av motsvarande totala jäst extrakt upprättad i Del 4: SLA1, sla1 ^AAA och sla1Δ. Rotera 1 h vid 4 ° C.
5. Spin 10 sek vid 5000 xg till pellets kulorna, kassera supernatanten och snabbt tvätta pärlor 3 gånger med buffert A som innehåller 0,1% Triton X-100, och 1 gång med buffert A.
6. Spinn ner kulorna en gång till och med en spets gel loading bort så mycket vätska som möjligt. Vid denna punkt proverna kan förvaras vid -20 ° C för att fortsätta vid ett senare tillfälle.
7. Tillsätt 15 ìl av 2x Laemmli prov buffert till varje rör, inkubera vid 96 ° C i 5 min, och snurra 10 sek vid 5000 x g.
8. Analysera prover genom immunoblotting använda en antikropp mot clathrin tunga kedjan. Förväntade resultat: clathrin samarbete immunoprecipitates med vildtyp Sla1p men inte med sla1 ^AAA, eller i sla1Δ provet.

7. Representativa resultat

Figur 1. Analys av Sla1p clathrin adaptern endocytic webbplatser genom att levande celler fluorescensmikroskopi. En ruta (till vänster) från en video och motsvarande kymographs (höger) av jästceller som uttrycker Sla1-GFP eller sla1 ^AAA-GFP bär en LLDLQ till AAALQ mutation. Både vildtyp och muterade Sla1-GFP uttrycktes från den endogena SLA1 locus. Endocytic sajter observeras som ljusa fläckar distribueras i cellen periferin (vänster bild). Området mellan vita linjer motsvarar den regionen där kymographs genererades. Filmer togs vid en hastighet på 1 bild / sek. Lägg märke till längre livslängd Sla1-GFP i LLDLQ till AAALQ muterade (sla1 ^AAA) jämfört med vild typ (SLA1).

Figur 2. Fysisk interaktion mellan clathrin och Sla1p-varianten clathrin rutan. GST smält till Sla1p fragment aa798-813 innehåller sekvensen LLDLQ (GST-VCB), motsvarande AAALQ mutant (GST-vCBmut) eller GST ensam (GST) var bundna till glutation-Sepharose pärlor och inkuberas med en cytosoliskt extrakt från vild- typ jästceller. Den associerade proteiner elueras och analyseras av immunoblotting (IB) för clathrin tung kedja.

Discussion

Clathrin belagda vesiklar (CCV) delta i endocytos och transport från trans Golgi nätverket och endosomes, bevarade vägar som är grundläggande för eukaryota cellbiologi. De metoder som beskrivs i denna metoder papper är bra att studera de molekylära mekanismer som CCV bildning, särskilt samspelet mellan adapter proteiner och clathrin. GST-fusionsprotein samhörighet och samarbete immunoprecipitation analyser möjliggör testning av fysiska samband mellan en adapter (kandidat) och clathrin. GFP-taggning och fluorescensmikroskopi avbildning tillåter dynamiska studier i levande celler. Jästceller I synnerhet ger fördelen av enkel genetisk manipulation att införa taggar och mutationer i adaptern endogena genen därmed upprätthålla normala uttryck reglering av taggade / muterat protein. På samma sätt kan clathrin eller andra delar av CCV märkas med RFP eller andra fluorescerande proteiner för att underlätta dubbla imaging studier i levande celler ^16.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit	Stratagene
protease inhibitor cocktail	Sigma