Summary
in vitroで神経堤幹細胞（NCSC）を育成するために、特殊な培地（NCSCM）が必要です。 NCSCMの本質的な部分は、ニワトリ胚抽出物（CEE）です。ここでは、分離、浸軟、遠心分離、およびろ過プロセスなどの詳細を含む、純粋で高品質CEEの最大化量を、生成する正確なテクニックを説明します。
Abstract
神経堤は、胚発生中に神経外胚葉から発生し、一時的にしか保持されます。初期の実験は、すでに神経堤1の重要部分であると多能性前駆細胞をへのドア。表現型、神経堤幹細胞（NCSC）を同時に神経堤2,3,4,5から、その移行中にP75（低アフィン神経成長因子受容体、LNGFR）とSOX10の発現によって定義されます。これらの前駆細胞は平滑筋細胞、クロム親和性細胞、神経細胞とグリア細胞だけでなく、メラノサイト、軟骨や骨6,7,8,9に分化することができる。 in vitroで NCSCを育成するために、特別な神経堤幹細胞の培地（NCSCM）が10必要です。 NCSCMの最も複雑な部分は、NCSCのためだけでなく、神経外植片の他の種類の成長因子の本質的なソースを表すニワトリ胚抽出物（CEE）の準備です。 CEEの横にある他のNCSCM成分は市販されている。それは分離、浸軟、遠心分離、およびろ過プロセスなどの挑戦的な詳細を知るために非常に重要であるCCE使用して実験室の標準機器を生産。このプロトコルでは、純粋かつ高品質CEEの最大化の量を生産するために、正確なテクニックを説明します。
Protocol
動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNIHのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学（ドイツ）での委員会（IACUC）を使用してください。
パート1：（ビデオで示されていない）の設定
（インキュベータから卵を取る前に）材料と溶液の調製
- 卵は37℃で11日間の加湿インキュベーター中でインキュベートする必要があります° C（100 ° F）。
- 70％エタノールのスプレー、クリーンプレート、正確な清潔なピンセットを用い、4℃（40 ° F）冷滅菌氷上でDMEM、60 mLの滅菌シリンジ
- 50 mLの滅菌コーニングチューブには、° C、コールドDMEMは1:1の比率（：DMEM浸軟質量）で浸軟した胚を混在させる4を半分埋める必要があります。早く卵がニワトリ胚のインキュベータの解剖から取り出されているとして起動する必要があります。
- オートクレーブや解剖の日に解剖ツールを殺菌、20分間70％エタノールでツールを浸す。
第2部：ニワトリ胚の解剖（ビデオで実証）
- 少なくとも30秒間、70％エタノールを噴霧インキュベート卵を湿らせ、過度に卵を振っていないがきれいで柔らかなペーパータオルで慎重にそれらを乾燥させます。
注：私たちは、同時に60以上のニワトリ胚を解剖することはお勧めしません。 - 鋭いエッジに対して破線で慎重に卵を開いて、卵黄の袋またはニワトリ胚自体を破壊しない、注意して胚を取り出す。
- すぐに臍帯の開始のための検索と卵黄の袋または少し船を破壊することなく明確なラッピングを開きます。その後、正確な清潔なピンセットを用い、へその緒を解剖。
- 卵黄の袋から胚を取り出す。
注：胚が（ビデオに示されていない）すぐに断頭してください。 - 4で最小必須培地で胚を収集℃に
パート3：ニワトリ胚のマセラシオン
- 60 mLの滅菌注射器の外プランジャーを取る。
- one 60mLのシリンジに約10胚を転送します。
- 浸軟物質を失うリスクにしないために慎重に戻ってシリンジにプランジャーを置く。
- プランジャーを押し下げることによって痩せ衰えさせる。
- 準備コーニングチューブ1:1（：DMEM浸軟質量）の比でDMEMで半分満たさで浸軟した質量を収集する。約25 mLの量が生産される10の胚を使用する。
- 4℃45分℃でシェーカーで混合物を置かない
第4部：ニワトリ胚の遠心分離 - DMEMサスペンション
- ニワトリ胚を移す - DMEM懸濁液を遠心管に。
- 胚の25 mg当たり1ミリグラムの濃度で滅菌ヒアルロニダーゼを追加。
- 非常に正確に風袋遠心分離チューブ。
注：遠心操作は非常に高いg力および材料または不均衡なチューブを使用する場合は、遠心機が発生する可能性の損傷時に実行されるため、この手順は慎重に行われるべき。すべてのチューブの小数点以下をDMEMで不足額を調整することで受信する必要があります後に3つのポジションについて、マシンに基づいて秤量精度の高い。 - 4に遠心分離機の温度を下げる℃に
注：また、遠心分離ローターは、一晩冷却室または冷蔵庫に保管してください。 - 少なくとも180.000 xgx時間にわたって6時間を遠心注：単相の分離に関する優れた結果を得るためには266.000 xgx hを使用する可能であれば、バキューム調整を使用してください。
第5部：ニワトリ胚抽出物のろ過
遠心分離後、3つのフェーズは気づいたことができる：脂肪のフラグメントを持つ上層薄汚い液相、中央にある透明な液体の相と遠心チューブの下部にあるペレットを注：遠心混合物の振動や移動活発になる必 要がありますこれは明確な中心的な液相を失うことによって遠心分離のステップの結果を破壊するように厳密に、避けて。
注：すべての次の手順では、層流のベンチを使用して無菌条件下で実行する必要があります。
- 0.45μmの細孔を有するフィルターシステムに明確な液相をピペット。その後、接続された真空ポンプのスイッチをオンにします。
注：下部にあるペレットに触れないでください。これは、抽出液とフィルターシステムの閉塞の汚染につながる。 - 0.22μmのと接続された真空ポンプのスイッチを再度の細孔を持つフィルターシステムに事前に抽出して転送する。
- 注し達成ニワトリ胚エキス滅菌15mlのコーニングチューブインチ
- 迅速° C（-62 ° F）-80分注して保存する。注：-80で保存した場合最長2年間の最後のCEE℃に
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Discussion
このプロトコルは過去10,11に記載されている手順の変更に基づいています。前者の出版物に加えて、我々はここで、プロセスの個々の異なるステップより多くの拡張を示します。これが正しい手続きで信頼性の高い成果を保証する重要な詳細と実験者をサポートしています。さらに、解剖プロセスとして我々は細部に卵黄の袋から胚を取り出すの手順を記述するCEEの抽出の重要な部分です。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。
インキュベーションが終了した後のニワトリ胚の解剖はできるだけ早く開始する必要があります。前の解剖に死んでいる胚に悪影響結果に影響を与える可能性がある酵素活性とタンパク質の分解など、このプロトコルのいずれかのステップには使用しないでください。
いくつか手の訓練を始める前にすることは解剖のプロセスのすべてのステップとして実行する必要があります迅速かつ正確に実施する必要があります。それは否定的に干渉するタンパク質の顕著な量を伴っていた卵黄と汚染を避けるために、手順全体の成功にとって重要です。胚は卵黄の袋から取り出した後、彼らは（ビデオには示されていない）すぐに断頭してください。
温度だけでなく、ローターのセレリティは、あまりにも、非常に重要です。酵素活性化とNCSCMに必要な要因の質と量の減少を避けるために遠心分離し、ローターの温度を4に減らす必要が℃に遠心分離工程の後に透明な中央の液相はNCSCMに不可欠な成長因子を含む重要なプリエキスです。異なる画分と要因の濃縮のかなりの分離を達成するために我々は180.000 xgx hよりではない低いセレリティを推薦が必要
透明な液相と遠心チューブの上部にある薄汚い液相間の密度の違いとして、任意の揺れを回避する必要がある二つの部分のリミックスを妨げるものではない。それの脂肪の部分が非常に早くフィルターシステムの目詰まりにつながるとして、薄汚い液相の成分は、0.45μmのフィルターシステムを介して濾過することができます。それの部分はフィルタシステムの目詰まりにつながるとしても、遠心分離機の下部にあるペレットは、全く触れてはいけません。
最後のステップでNCSCsの栽培のためのCEEの可能性が検証される必要があります。幹細胞のこの多能一時的な人口は、十分な生産CEEを追加せずにメディアに急速にその実行可能性を失います。したがって、導入遺伝子活性依存的に早期のNCSCのマーカーを発現し、NCSC生物学を研究するために使用されるトランスジェニックマウス系統（JoMa1）は、CEE 10のすべての新たに得られた電荷で栽培されている。 NCSCsの成功した栽培は、CEEの適切な検証を表します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
マルクスPajtlerとロバートボーラーのサポートやアドバイスは、このプロトコルの可視化のための非常に貴重でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
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