Summary
Чтобы вырастить нервного гребня стволовых клеток (NCSC) в пробирке, специальные среды (NCSCM) не требуется. Значительная часть NCSCM является куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ). Мы здесь описать точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества Центральной и Восточной Европы, в том числе детали, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов.
Abstract
Нервного гребня возникает из-за нервно-эктодермы в период эмбриогенеза и сохраняется только на время. Первые эксперименты уже проверенные плюрипотентных клеток-предшественников, чтобы быть неотъемлемой частью нервного гребня 1. Фенотипически, нервного гребня стволовых клеток (NCSC) определяются одновременно выразив p75 (низкий аффинных фактора роста нервов рецепторов, LNGFR) и SOX10 во время их миграции из нервного гребня 2,3,4,5. Эти клетки-предшественники могут дифференцироваться в клетки гладкой мускулатуры, хромаффинных клеток, нейронов и глиальных клеток, а также меланоцитов, хрящевой и костной 6,7,8,9. Чтобы вырастить NCSC в пробирке, специальные нервного гребня стволовых клеток среды (NCSCM) требуется 10. Наиболее сложной частью NCSCM является подготовка куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ), представляющий собой важный источник роста факторов NCSC, а также для других типов нейронных эксплантов. Другие ингредиенты NCSCM рядом с Центральной и Восточной Европы имеются в продаже. Производство CCE с использованием лабораторных стандартной комплектации он имеет большое значение, чтобы знать о сложных деталей, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов. В этом протоколе описываются точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества ЦВЕ.
Protocol
Авторы утверждают, что эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейскими сообществами Директивы Совета (86/609/EEC), следующие руководящие принципы в отношении НИЗ уход и использование животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональные животных Уход и использование комитета (IACUC) в университете Дуйсбург-Эссен (Германия).
Часть 1: Настройка (не показано на видео)
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ (до принятия яйца из инкубатора)
- Яйца должны быть инкубировали во влажной инкубаторе в течение 11 дней при температуре 37 ° C (100 ° F).
- 70% этанола, спрей, чистые тарелки, точный чистый пинцет, 4 ° C (40 ° F) холодного стерильного DMEM на льду и 60 мл стерильные шприцы
- 50 мл стерильные пробирки Corning должны быть наполовину заполненной с 4 ° С холодным DMEM смешать вымоченных эмбрионов в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Как только яйца выводятся из рассечение инкубатор куриных эмбрионов должен быть запущен.
- Стерилизовать рассечение инструментов в автоклаве или в день вскрытия, погрузить инструменты в 70% этаноле в течение 20 минут.
Часть 2: Препарирование куриных эмбрионов (демонстрируется на видео)
- Влажные инкубационных яиц с 70% этанола спрея в течение по крайней мере, 30 секунд и высушите их осторожно чистой мягкой салфеткой при этом не качая яйца чрезмерно.
Примечание: Мы рекомендуем не рассекает более чем на 60 куриных эмбрионов одновременно. - Открытое яйца тщательно лихой против острого края и выньте эмбриона с осторожностью, не разрушая мешок желтка или куриного эмбриона себя.
- Поиск начале пуповины быстро и открытых ясно упаковки, не разрушая мешок желтка или любой мало судов. Затем рассекают пуповину с точным чистым пинцетом.
- Возьмите эмбриона из мешка желтка.
Примечание: Эмбрионы должны быть обезглавленным быстро (не показано на видео). - Сбор эмбрионов в минимальной необходимой среде при температуре 4 ° C.
Часть 3: мацерация куриных эмбрионов
- Возьмите поршень из 60 мл стерильного шприца.
- Передача примерно 10 эмбрионов в одном 60 мл шприца.
- Поместите поршень тщательно обратно в шприц, чтобы не потерять вымоченных материала.
- Размочите, нажав на поршень.
- Сбор вымоченных массу в подготовленные трубки Corning наполовину заполненной с DMEM в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Использование 10 эмбрионов объемом около 25 мл производится.
- Поместите смесь в шейкере в течение 45 мин при 4 ° C.
Часть 4: Центрифугирование куриного эмбриона - DMEM Подвеска
- Передача куриного эмбриона - DMEM суспензии в центрифугирования труб.
- Добавить стерильной гиалуронидазы в концентрации 1 мг на 25 мг эмбриона.
- Тара центрифугирования труб очень точно.
Примечание: Этот шаг следует выполнять с осторожностью, так как центрифугирование запускается при очень высоких перегрузок и повреждения материала или центрифуги могут возникнуть при использовании несбалансированной труб. С высокой точностью весов соответствии отношении трех позиций после десятичной точки для всех труб должна быть получена путем корректировки недостающую сумму с DMEM. - Уменьшить температуру центрифуге до 4 ° C.
Примечание: Также центрифугирования ротора должны храниться в холодильной камере или холодильнике в течение ночи. - Центрифуга 6 часов по крайней мере, 180,000 х ^ Х ч. Примечание: Для получения превосходных результатов в отношении разделения отдельных фаз использовать 266,000 х ^ Х ч. Если это возможно, использовать вакуум регулировки.
Часть 5: Фильтрация Извлечение куриного эмбриона
После центрифугирования, три фазы можно заметить: верхний темный жидкой фазы с жирными фрагменты, ясно жидкой фазы в середине и осадок на дне трубки центрифугирования. Примечание: встряхивания или оживленной перемещения центрифугировали смеси должна быть строго избегать, так как это разрушит результате центрифугирования шаг за потери ясно центральной жидкой фазы.
Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях с использованием ламинарного потока воздуха скамьи:
- Внесите ясно жидкой фазы в фильтр с порами 0,45 мкм. Затем включите связано вакуумного насоса.
Примечание: Не прикасайтесь гранул на дне. Это привело бы к загрязнению извлекать и блокирование системы фильтров. - Передача предварительно распакован в фильтр с порами 0,22 мкм и переключиться на подключенном вакуумный насос снова.
- Алиготе достигнута экстракт куриного эмбрионав стерильные 15 мл Corning труб.
- Быстро хранить аликвоты при -80 ° C (-62 ° F). Примечание: Центральной и Восточной Европе продлится до двух лет при условии хранения при температуре -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом 10,11. В дополнение к бывшим публикациях мы здесь, показывают отдельные различные этапы процесса более расширены. Это подтверждает экспериментатор с важной детали обеспечения правильного разбирательства и достоверных результатов. Кроме того, как рассечение процесс является неотъемлемой частью добычи Центральной и Восточной Европы мы описываем процедуру принятия эмбрионов из мешка желтка в каждой детали. Есть несколько важных моментов, как описано ниже.
Рассечение куриных эмбрионов должно быть начато как можно скорее после инкубации закончилась. Эмбрионы были мертвы до вскрытия не должна использоваться для каких-либо шагов этого протокола, как ферментативная активации и деградации белка может влиять на результат отрицательно.
Перед началом работы некоторых ручных на обучение должны быть выполнены, как и все шаги процесса вскрытия должны быть проведены быстро и точно. Это важно для успеха всей процедуры, чтобы избежать загрязнения с яичным желтком который сопровождался Примечательно, количество негативно вмешиваться белков. После эмбрионы были вынуты из мешков желток они должны быть обезглавленным быстро (не показано на видео).
Температура, а также быстроты ротора очень важны, также. Для того чтобы избежать ферментативной активации и снижению качества и количества факторов, необходимых для NCSCM температура центрифуги и ротора должна быть уменьшена до 4 ° C. После центрифугирования шаг ясно центральной жидкой фазы является важным предварительным экстракт, содержащий существенные факторы роста NCSCM. Для достижения значительного разделения различных фракций и обогащение факторов, необходимых, мы рекомендуем быстроты не ниже 180,000 х ^ Х ч.
Поскольку разница в плотности между ясно жидкой фазы и грязно жидкой фазы в верхней части трубки центрифугирования не мешает ремиксы из двух частей любой тряски должен избегать. Компоненты грязно жидкая фаза не может быть фильтровали через 0,45 мкм фильтр системы, а жирные ее части очень скоро привести к засорению фильтров. Кроме того, гранулы в нижней части центрифуги нельзя трогать вообще, как части, что это приведет к засорению фильтров.
В последний шаг потенциал Центральной и Восточной Европы для выращивания NCSCs должен быть проверен. Это мультипотентные переходных население стволовые клетки теряют свою жизнеспособность быстро в средствах массовой информации, не имея адекватной добавил производится Центральной и Восточной Европы. Поэтому трансгенной линии мышей (JoMa1), который выражает рано NCSC маркеров в трансгенных-активности зависимым образом и используется для изучения биологии NCSC культивируется в каждый вновь полученный заряд Центральной и Восточной Европы 10. Успешного выращивания NCSCs представляет соответствующую проверку и Восточной Европе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержку и советы Маркус Pajtler и Роберт Борер были бесценны для визуализации этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
