Summary
Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.
Abstract
El accidente cerebrovascular es una de las causas más frecuentes de muerte y discapacidad en los adultos, especialmente en los países altamente desarrollados. Sin embargo, las opciones de tratamiento hasta la fecha son muy limitados. Para satisfacer la necesidad de nuevos enfoques terapéuticos, la investigación el accidente cerebrovascular experimental emplea con frecuencia modelos de roedores de la isquemia cerebral focal. La mayoría de los investigadores utilizan la oclusión permanente o transitoria de la arteria cerebral media (ACM) en ratones o ratas.
Oclusión proximal de la arteria cerebral media (ACM) a través de la técnica de sutura intraluminal (llamado filamento o modelo de sutura) es probablemente el modelo más utilizado en la investigación de accidente cerebrovascular experimental. El modelo intraluminal MCAO ofrece la ventaja de inducir isquemia transitoria o permanente reproducible del territorio de la ACM de una manera relativamente no invasiva. Enfoques intraluminal interrumpir el flujo de sangre de todo el territorio de esta arteria. Filamento por lo tanto la oclusión proximal de detención del flujo de las arterias lenticulo-estriados, que abastecen a los ganglios basales. Filamento de la oclusión de los resultados en las lesiones de MCA reproducible en la corteza y el cuerpo estriado y puede ser permanente o transitorio. Por el contrario, los modelos de inducción distal (a la ramificación de las arterias lenticulo-estriado) MCA oclusión suele repuesto el cuerpo estriado y consisten principalmente en la corteza cerebral. Además, estos modelos requieren craniectomía. En el modelo mostrado en este artículo, un filamento de silicio recubierto se introduce en la arteria carótida común y avanzado a lo largo de la arteria carótida interna en el Círculo de Willis, donde bloquea el origen de la arteria cerebral media. En los pacientes, las oclusiones de la arteria cerebral media se encuentran entre las causas más comunes de accidente cerebrovascular isquémico. Desde distintos intervalos de isquemia puede ser elegido libremente en este modelo en función del punto en el tiempo de la reperfusión, lesiones isquémicas, con diferentes grados de severidad se puede producir. Reperfusión mediante la eliminación de los filamentos de oclusión al menos parcialmente, los modelos de la restauración del flujo de sangre después de espontáneo o terapéutico (tPA) lisis de un coágulo de tromboembólicos en los seres humanos.
En este video se presenta la técnica básica, así como los escollos más importantes y los factores de confusión que puede limitar el valor predictivo de este modelo.
Protocol
Para garantizar una alta calidad y reproducibilidad, se recomienda el uso de procedimientos operativos estándar (SOP). En este video, publicado como SOP desarrollados y utilizados en nuestro laboratorio se aplican 1.
1. Oclusión de la Arteria Cerebral Media
- Los ratones se anestesiaron con un régimen adecuado de anestesia en consultar con el personal veterinario. (Ejemplo, la inducción con 1,5 - 2% isoflurano y el mantenimiento de 1,0 a 1,5% isoflurano en 2 / 3 de N2O y 1 / 3 O2 usando un vaporizador).
- La temperatura corporal de los ratones se mantiene en 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante la cirugía con una placa calefactora. Una plataforma de información calentamiento controlado, que calienta de acuerdo a la temperatura rectal del ratón, es muy recomendable.
- La desinfección de la piel y la piel circundante con un agente apropiado (por ejemplo, 70% de alcohol etílico) y secarlo después.
- Una incisión de línea media del cuello se realiza y los tejidos blandos se separan.
- La arteria carótida común izquierda (ACCI) se diseca cuidadosamente libre de los nervios que rodean (sin dañar el nervio vago) y la ligadura se realiza mediante cadena de 6.0/7.0. Cadena de 5.0 también se puede utilizar.
- La arteria carótida externa izquierda (LECA) se separa y un segundo nudo se hace.
- A continuación, la arteria carótida interna izquierda (LICA) está aislado y un nudo se prepara con un filamento de 6,0.
- Después de obtener la buena vista de la arteria carótida interna izquierda (LICA) y la arteria izquierda pterigopalatina (LPA), ambas arterias se recortan, con un clip microvascular.
- Un pequeño agujero se corta en el LCCA antes de que se bifurca a la LECA y el LICA. Un monofilamento hecha de nylon recubierto de 8,0 con la mezcla de endurecedor de silicio (ver más abajo) se introduce en la LICA, hasta que se detenga en el clip. La atención tiene que ser pagado de no entrar en la arteria occipital. (Figura 1)
- Las arterias cortadas se abren al mismo tiempo que el filamento se inserta en el LICA para ocluir el origen de las TCI en el polígono de Willis.
- El tercer nudo en la LICA está cerrada para fijar el filamento en su posición.
- Los ratones que reciben solución salina 0,5 ml por vía subcutánea como la reposición de volumen. Para aliviar el dolor, gel de lidocaína es de aplicación tópica en la herida.
- Si la reperfusión se pretende, ratones estancia para 30 a 90 min de oclusión en una jaula climatizada, la herida puede ser cerrada con un clip de sutura pequeños. Después, un segundo se lleva a cabo la anestesia, el tercer nudo en el ICA es momentánea abre y retira el filamento.
- Las suturas restantes se reducen y la piel se adapta con una sutura quirúrgica.
- Todos los animales reciben una reposición segundo volumen como se describió anteriormente.
- Los animales son puestos en una jaula climatizada durante dos horas para controlar la temperatura corporal.
- Los animales deberán ser controlados diariamente después de la cirugía para detectar signos de malestar. Los ratones pueden mostrar una pérdida de peso después de cirugía. Ellos reciben el puré en un plato de petri-colocado en el suelo para promover la alimentación. La comida se sustituye al día durante siete días.
2. Sham Operación
- Para las operaciones de simulacro de los filamentos se inserta la oclusión del TC y se retira de inmediato para permitir la reperfusión inmediata (1,8). La siguiente operación es idéntica a la realizada en los animales sometidos a isquemia cerebral (1.9-1.14), incluyendo un segundo anestesia.
3. Preparación del filamento
- Esterilidad del filamento debe ser considerado. El uso de equipo esterilizado, así como un manejo adecuado de los filamentos después es un requisito previo para una intervención quirúrgica estéril. Desinfección del filamento es difícil, ya que muchos de los métodos de esterilización común puede empeorar la calidad de los filamentos. Sin embargo, los métodos tales como la radiación, por ejemplo, con la luz ultravioleta o los rayos γ, o la esterilización química, por ejemplo, con gases altamente reactivos, como el óxido de etileno, son aplicables.
- 8,0 de filamento de nylon se corta en trozos de 11 mm bajo el microscopio
- La punta del filamento se debe cubrir por completo y de manera uniforme sobre una longitud de 8 mm con una mezcla de endurecedor Xantopren M mucosa y activador de NF Optosil
4. Resultados representante
Dependiendo de la duración de la restricción del flujo sanguíneo, motor diferente y el resultado déficits de comportamiento. Tanto a los 30 y 60 minutos de isquemia cerebral, los animales en la mayoría de los casos presentan una menor resistencia a empuje lateral y circular debido a la perturbación en la locomoción. Lesiones más leves se manifiestan como una posición flexor en la parte delantera limbs. Estos signos fácilmente observables se puede utilizar como un valor básico para el éxito de la operación 2.
Morfológicamente la lesión puede ser evaluado utilizando la histología o la resonancia magnética (MRI). Sesenta minutos de oclusión de la arteria cerebral media produce pannecrosis tejido en un área que incluye tanto el cuerpo estriado y el neocórtex, mientras que 30 minutos de isquemia causar la muerte celular neuronal principalmente limitada en el cuerpo estriado. 3 (Figura 2) En términos de volumen del infarto, esperamos que una desviación estándar inferior al 30% en un conjunto de operaciones. La mortalidad depende del tiempo de la oclusión con alrededor del 5% después de 30 minutos de isquemia y 10 - 20% después de 60 min.
Otra posibilidad de mínima invasión es el uso de la flujometría láser Doppler (LDF) durante la operación, lo que permite un control directo de su éxito. En un animal, la reducción de 10 a 20% de los valores preocclusion indica claramente la inducción exitosa de la isquemia cerebral focal 4 Sin embargo, LDF no se puede utilizar como un método para realizar comparaciones entre individuos, ya que LDF sólo pueden medir los cambios cuantitativos (en porcentajes) de la sangre. flujo dentro de un volumen de muestra de tejido pequeño y limitado. No da información sobre la extensión espacial de la reducción del flujo sanguíneo. 5
Existen varias pruebas para evaluar aspectos del comportamiento después del accidente cerebrovascular, incluyendo análisis de la marcha 6,7, rotarod 8, Polo prueba de 9,10, prueba de eliminación de adhesivos 11,12, 13,14 prueba de escalera, prueba de escalera de mano 15,16 y laberinto de Morris 17. En todas estas pruebas, los ratones sometidos a MCAO realizar con menos éxito que los animales control.
Figura 1. Esquema de la arquitectura del barco que irrigan el cerebro (que se muestra en el fondo) en el ratón. Las diferentes cepas pueden mostrar variaciones, por ejemplo, la arteria occipital a veces sale de la arteria carótida interna.
Figura 2. Representación esquemática de las lesiones cutáneas típicas después de diferentes tiempos de reperfusión en el próximo modelo de MCAO. En el centro, el curso típico de la actividad funcional y el flujo sanguíneo cerebral después de MCAO se muestran. (MCAO: la arteria cerebral media oclusión, LDF: láser de medición de flujo Doppler)
Discussion
El modelo de la transitoria, oclusión proximal MCA 18,19 presentados aquí imita uno de los tipos más comunes de accidente cerebrovascular isquémico en pacientes 20. Basado en tiempos de reperfusión variable, el modelo ofrece diferentes grados de daños que van desde un ataque isquémico transitorio (TIA) a las grandes infartos, incluidas las partes más importantes del hemisferio isquémico. Esto permite al investigador para estudiar los diferentes mecanismos fisiopatológicos después del accidente cerebrovascular 20,21.
La cirugía se puede realizar en un corto período de tiempo y produce lesiones altamente reproducible. Sin embargo, esto requiere un control exhaustivo de los factores de confusión. 22 Las pequeñas diferencias en la técnica de la operación puede dar cuenta de diferentes efectos en el infarto. 23,24 Además, debido a las variaciones en la anatomía vascular cerebral, diferentes cepas de ratón muestran un resultado diferente. 25,26 Cuerpo la temperatura afecta el daño neurológico, con hipotermia conduce a lesiones más pequeñas 27 y la hipertermia a la más grave déficit. 28 En consecuencia, el control de la temperatura y el mantenimiento es muy relevante en este modelo. 29 Además, la presión arterial y los gases en sangre son factores de confusión importantes de los resultados y la necesidad de ser controlados 30,31. El uso de métodos invasivos rápido y un mínimo (la medición no invasiva la presión arterial, conveniente y fácil de sitios web accesibles de extracción de sangre) se recomienda. La elección de la anestesia también es muy importante, ya que algunos pueden tener efectos neuroprotectores, y / o ser vasodilatadores, como por ejemplo isoflurano. 32 Por consiguiente, la exposición a la anestesia debe ser lo más breve posible y estandarizados. Se excluyen los animales que han sido sometidos a cirugía por más de 15 min.
El rasurado del área quirúrgica produce microabrasions y la inflamación y libera fragmentos de pelo. Esto puede aumentar la inflamación y promover la infección local, que puede repercutir en la fisiopatología accidente cerebrovascular. Las condiciones de vivienda, especialmente el uso de enriquecimiento, puede afectar el resultado tiempos y debe ser normalizada y se describe en los informes de investigación. 6,33,34 El uso de enriquecimiento ambiental y su efecto sobre la reproducibilidad es un tema de discusión. 35 Otro factor de confusión importante es la el riesgo de ictus inducido por la infección, especialmente después de largos tiempos de isquemia de 36 años, lo que lleva a la morbilidad adicional y aumento de la mortalidad 37,38. Como las infecciones se vuelven sintomáticos en alrededor de 3 a 5 días, esto tiene importantes consecuencias para el seguimiento a largo plazo en estos modelos.
Para producir resultados relevantes para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para el accidente cerebrovascular, la normalización y control de calidad es muy importante en la investigación preclínica traslacional carrera 39 "Buenas Prácticas de Laboratorio" 40,41 mandatos.:
- una descripción adecuada y detallada de los animales utilizados;
- Cálculo del tamaño muestral y la información sobre la magnitud del efecto esperado;
- criterios de inclusión y exclusión, establecido antes del estudio;
- aleatorización de la asignación a los grupos;
- ocultamiento de la asignación con respecto a los investigadores;
- informes animales excluidas del análisis;
- evaluación cegada de los resultados;
- informar los posibles conflictos de interés y financiamiento del estudio.
Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Programa de la Comunidad Europea Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n º 201024 y n º 202213 (Red European Stroke). La financiación adicional fue dado por el Bundesministerium für Bildung und Forschung (Centro de Investigación de Carrera de Berlín), y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).
Los autores desean agradecer a Mareike Thielke (Dep. de Neurología Experimental, Charité de Berlín) por el apoyo durante la operación y Elke Ludwig (Servicios Charité Video) para la producción de la animación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical scissors (skin cut) | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Spring scissors (according to Vannas) | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Applying forceps for micro clamps | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Micro vascular clamp (e.g. S&G B1-V) | Fine Science Tools | 00396-01 | Also Serrefine possible |
| 2 Hemostats according to Hartmann | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Needle holder (according Olsen-Hegar or other) | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Standard anatomical forceps (for wound closure) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 5/0 sutures | Suprama | for vascular ligatures | |
| 6/0 sutures | Suprama | for skin suture, 5/0 also possible | |
| Lidocaine (e.g. Xylocain Gel 2%) | AstraZeneca | or other local pain relief | |
| Dissecting microscope (stereo microscope), magnification 6x to max. 40x | Leica Zeiss | MZ6 Stemi2000C | |
| Cold light source | Leica Microsystems | KL1500 | |
| Temperature feedback controlled heating pad system | Fine Science Tools | 21052-00 | With mouse pad and small probe |
| Anaethesia system for isoflurane | |||
| Isoflurane | Abott | ||
| Veterinary Recovery Chamber | Peco Services | V1200 | Heated cage |
| 8.0 nylon filament | Suprama | TEL181005 | for coating |
| Scalpel | For cutting filament in pieces | ||
| Ruler | To cut correct length of filament | ||
| Xantopren M Mucosa | Heraeus Instruments | ||
| Activator Universal Plus | Heraeus Instruments | Optosil - Xantopren | |
| 2 Dumont forceps (Medical #5 straight tip) | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| A soft underlay for storing and grasping the uncoated filaments | e.g. swabs, foam, … | ||
| Receptacle for new build filaments | e.g. petri dish, flexible foam,… |
References
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