Summary
Förfarandet för att förbereda skivor som innehåller den vuxna musen hypothalamus suprachiasmatiska kärnan (SCN), och en snabb väg till kulturen SCN vävnaden i organotypic kultur skick, redovisas. Vidare är mätning av oscillerande klockan gen protein uttryck med hjälp av dynamiska luciferas reporter teknik som beskrivs.
Abstract
En central dygnsrytm (~ 24 tim) klocka samordna dygnsrytm i fysiologi och beteende är bosatt i suprachiasmatiska kärnan (SCN) i främre hypothalamus. Klockan är direkt synkroniseras av ljus via näthinnan och synnerven. Dygnsrytm svängningar genereras genom att interagera negativa återkopplingar av ett antal så kallade "klocka gener" och deras proteinprodukter, inräknat (Per) gener. Kärnan Klockan är också beroende av membran depolarisation, kalcium och cAMP 1. SCN visar dagliga svängningar klocka genuttryck, metabolisk aktivitet och spontan elektrisk aktivitet. Anmärkningsvärt, kvarstår detta endogena cyklisk aktivitet i vuxen vävnad skivor av SCN 2-4. På detta sätt kan den biologiska klockan lätt studeras in vitro, vilket gör att molekylär, elektrofysiologiska och metabola undersökningar av pacemakern funktion.
SCN är en liten, väldefinierad bilaterala strukturen ligger precis ovanför den optiska chiasm 5. Hos råtta innehåller ~ 8,000 neuroner i varje cellkärna och har dimensionerna ca 947 ìm (längd, rostrocaudal axeln) x 424 ìm (bredd) x 390 ìm (höjd) 6. Att dissekera ut SCN är det nödvändigt att skära en hjärna skiva på den specifika nivån i hjärnan där SCN kan identifieras. Här beskriver vi dela upp och skivas förfarande för SCN, som är likartad för mus och hjärna råtta. Vidare visar vi hur kulturen på dissekerade vävnaden organotypically på ett membran 7, en teknik som utvecklats för SCN vävnadsodling av Yamazaki et al. 8. Slutligen visar vi hur transgena vävnad kan användas för att mäta uttrycket av klockan gener / proteiner med hjälp av dynamiska luciferas reporter teknik, en metod som ursprungligen användes för dygnsrytm mätningar av Geusz et al. 9. Vi använder här SCN vävnader från den transgena knock-in perioden2:: luciferas möss som produceras av Yoo et al 10.. Mössen innehåller ett fusionsprotein periodens utgång (PER) 2 och för Firefly enzymet luciferas. När PER2 är översatt i närvaro av substrat för luciferas, dvs luciferin kan PER2 uttrycket övervakas som mareld när luciferas katalyserar oxidation av luciferin. Antalet utsända fotoner korrelerar positivt till mängden producerad PER2 protein, och mareld rytmer matcha PER2 proteinet rytmen in vivo 10. På detta sätt den cykliska variationen i PER2 uttryck kan övervakas kontinuerligt realtid under många dagar. Protokollet vi följer för mjukpapper odling och realtid mareld inspelning har noggrant beskrivits av Yamazaki och Takahashi 11.
Protocol
1. Beredning av lösningar
- Odlingsmedium med luft-buffrande förmåga
- Fyll en 1 liters flaska med ca 800 ml steril H 2 O (autoklaveras milliQ H 2 O).
- Under omrörning, tillsätt och blanda följande ämnen: 1 behållare lågt glukos, serumfritt DMEM 2902 pulver utan natriumbikarbonat och fenol rött (fenolrött stör mareld signalen), 20 ml B27 komplettera 50x, 4,7 ml av en 7,5% NaHCO 3 lösning (eller 0,35 g NaHCO 3), 10 ml HEPES 1M, 2,5 ml PenStrep 10.000 E / ml och 3,5 g D-glukos. Låt mediet rör tills ingredienserna är helt upplöst.
Den slutliga mediet (1 liter) kommer att innehålla:
1x DMEM, 1x B27 komplettera, 4,2 mm 3 NaHCO, 10 mm HEPES, 25 U / ml penicillin, 25 U / ml streptomycin och 19 mm D-glukos. - Justera pH till 7,2 med hjälp av NaOH för att minska eller HCl för att öka pH-värdet, och få volym upp till 1 liter med steril H 2 O.
- Justera osmolalitet med H 2 O (minskning osmolalitet) eller D-glukos (öka osmolalitet). Den osmolalitet måste vara mellan 285-315 mOsm / kg men det optimala intervallet är 300-310 mOsm / kg. Inte för att späda på medellång mer än 5%.
- Filtrera odlingsmedium med Corning sterila set vakuumfiltrering (t.ex. 2 x 500 ml med porstorlek 0,22 mikrometer) i en steril huva. Håll medium i 4 ° C och skydda den från ljus med hjälp av aluminiumfolie. Vi rekommenderar att mediet används inom 3 månader.
- Hank balanserade saltlösning (HBSS) buffert med tillägg (för att skära skivor)
- Fyll en 1 liters glasflaska med ~ 600 ml steril (autoklaveras milliQ) H 2 O och lägg till följande ämnen: 100 ml HBSS 10x lager, 10 ml penicillin-streptomycin 10.000 E / ml, 5 ml av en 7,5% NaHCO 3 lösning och 10 ml HEPES 1M.
Den slutliga lösning för kapning kommer att innehålla:
1x HBSS, 10 mm HEPES, 4,5 mm NaHCO 3, 100 U / ml penicillin och 100 E / ml streptomycin. - Kontrollera pH och, om nödvändigt, justera pH till 7,2 och ta upp volymen till 1 liter med steril H 2 O.
- Kontrollera osmolalitet, som måste vara mellan 285-315 mOsm / kg.
- Kyl HBSS till 4 ° C. Den HBSS buffert måste vara mycket kallt (4 ° C) under skärning / skärning förfarande för att få ner ämnesomsättningen och bevara vävnad livskraft.
- Fyll en 1 liters glasflaska med ~ 600 ml steril (autoklaveras milliQ) H 2 O och lägg till följande ämnen: 100 ml HBSS 10x lager, 10 ml penicillin-streptomycin 10.000 E / ml, 5 ml av en 7,5% NaHCO 3 lösning och 10 ml HEPES 1M.
2. Förberedelser innan du klipper och Odling Segment
- Vävnaderna odlas i en varm torr kammare utan CO 2. För att undvika uttorkning kulturer måste tätas med täckglas knutna till rätter av fett. För detta ändamål fyller 5 ml sprutor med silikonbaserat vakuum fett. Täck sprutan tips med små bitar av aluminiumfolie och autoklav dem. Dessutom autoklav filterpapper (används vid skärning förfarande).
- Precis innan skivning förfarande, tillämpa autoklaveras vakuum fett på den övre ringen yta på 35 mm petriskålar. Förbered en separat petriskål för varje skiva kultur.
- Innan du börjar skära förfarande alla icke-sterila instrument, rakblad, vibratome knivar, glas lock och andra material som används för slice och kultur förfarande måste steriliseras. Spraya alla icke-steril utrustning med 70% etanol. Exponera instrument och smord rätter Petri med UV i ett sterilt huv i minst 30 minuter UV-exponering före odling.
- Samtidigt fyller en Falcon rör med luft-buffring odlingssubstrat (räkna 1,2 ml för varje kultur, för 8 kulturer förbereda sig till exempel 10 ml medium) och tillsätt färsk tinade luciferin (0,1 M stamlösning, Promega, Madison, WI) (10 mikroliter luciferin till 10 ml medium; slutlig koncentration 0,1 mM).
- Det luciferin är ljuskänsligt och både stamlösningar och luciferin medier innehållande behöver skyddas från ljus. Placera Falcon röret med luciferin-medium i en mörk 36-37 ° C värmekammare. Vid behov kan luciferin också läggas direkt i kultur rätter vid tidpunkten för styckning. Om luciferin inte läggs till kommer det att finnas något ljus reaktion mellan luciferas och luciferin och därför ingen signal från vävnaden.
- Efter UV-exponering, bifoga en steril kniv till vibratome.
3. SCN Skivning Förfarande
Följande procedur beskriver skivning av vuxna, vanligtvis 2-4 månader gammal, C57/BL6 möss. Observera: den skärande förfarande samt ljusexponering av djuret under natten, kan differentiellt återställa fasen av SCN. För att undvika detta bör styckning och odling utföras under den ljusa timmar, helst mellan ZT 6-12, när ingen konkret fas skift på grund av förfarandet sker 12. Om SCN har som ska provtas i mörker, 3,1 och 3,2 måste utföras i rött ljus eller med natt glasögon för att undvika ljusinducerad fas skift.
- Bedöva musen helst genom isofluorane (Baxter) i en glass kammare. När djuret har förlorat sin smärta reflexer (kontrollera genom att nypa med naglarna i tassen) men ännu inte slutat andas (för att upprätthålla syretillförseln så länge som möjligt), snabbt halshugga huvudet med en sax eller liknande.
Observera: I vissa länder CO 2 exponering (hyperkapni) fortfarande är tillåten som anestesimetod som, även om det har rapporterats att främja djurens ångest. Dessutom kan halsdislokation krävas innan halshuggning. Följ lokala lagar när euthanizing djur. - Ta bort ögonen från huvudet med en sax för att förhindra påfrestningar och ytterligare excitation av synnerverna, som kan skada SCN.
- Om fortfarande ansluten ta bort de sista livmoderhalscancer ryggradsdjur med en sax, ta bort hud (Fig 1a) och göra två snitt med en fin sax (till exempel iris sax), en klippa på varje sida av skallen längs sidorna, vilket gör ett löstagbart "lock".
- Öppna skallen med en mikro rongeur verktyg (fint dissekera sax kan också användas på en mus) och ta bort alla ben tills luktsinnet lökarna kan ses. Arbeta uppåt, aldrig trycka ner hjärnan med verktyget för att förhindra skador på ventrala SCN (Fig 1b).
- Skär försiktigt synnerven mellan lukt lökarna och halvkloten med fina micro dissekera våren sax. Se till att nerven är helt skär sedan sträckning av synnerven kan leda till skador i SCN och spruckna skivor.
- Vänd huvudet upp och ner och låt den intakta hjärnan faller ut (om det fortfarande sitter i hjärnan, kan andra kranialnerver behöva sänkas caudal på synnerven) i en behållare (till exempel ett glas petriskål ≈ 10 cm) fylld med 50-100 ml kallt HBSS tillåter snabb nedkylning av hjärnan. Helst ska de båda synnerverna förbli intakt (fig 1c). Håll hjärnan i HBSS 30-60 sekunder för att säkerställa hjärnan kyls.
- Använd en sked eller liknande och placera kylda hjärnan, dorsal yta upp på en steril klippa yta (till exempel ett glas petriskål locket vänds upp och ner). I syfte att förbereda en koronalt klippa, göra en vinkelrät skåran med sterilt rakblad eller skalpeller mellan hjärnhalvorna och lillhjärnan, och därmed ta bort lillhjärnan.
- Applicera superlim på torra plattformen hör till vibroslicer / vibratome.
- Plocka upp hjärnan (hjärnhalvorna utan lillhjärnan och utan lukt glödlampor) genom att sticka in en vass, böjd tång i rostralt delen och försiktigt torka bort HBSS på en steril filterpapper, fortfarande håller hjärnan med pincett. (I stället för sätter in en pincett, en liten bit av sterila filterpapper användas för att fästa och överföra hjärnan).
- Fixera halvklotet på limmade plattform med rostralt spetsen uppåt och ventrala yta närmast kniven. Fäst plattformen i hållaren hör till vibratome (till exempel från Campden Instruments, Storbritannien) och omedelbart fylla på med kallt HBSS. Om vinkelräta snitt görs på rätt sätt bör halvkloten stå rakt upp vilket ger en bra vinkel som behövs för att göra en coronal klipp som innehåller de bilaterala SCN.
- För att nå området målet SCN, börja skära av tjockare sektioner (500-800 mikrometer) av halvkloten i hög eller högsta hastighet vibratome. Flytta bladet kan vara ganska snabb i början innan den når hypothalamus men bör vara långsammare när synnerven chiasm blir synlig (hög frekvens vibrerande bladet och långsamma satsen horisontellt minskar cellskador vid skivning, vilket ökar slice livskraft). Minska avsnitt för 100 ìm när synnerven chiasm blir större (bredare) och den främre commissure blir mindre. För att få en mid-SCN avsnitt arbeta för dig själv "down" (caudal riktning) tills de två SCN kärnorna börjar dyka upp. Ett förstoringsglas kan behövas för att visualisera kärnor. Observera: SCN i musen hjärnan ligger mer caudal av optisk chiasm jämfört med råtta hjärnan.
- När önskad nivå av SCN har uppnåtts (SCN kommer på denna punkt framstår som mer definierad, runda eller mandelformade strukturer, Fig. 1d, cirka Bregma-,46--0,70 mm för centrum regionen SCN i mus 13, Bregma - 0,92--1,40 mm för råtta 14), klipp SCN avsnitt (Fig. 1e). Lämplig tjocklek på skiva är för mus 250 ± 50 ìm, för råtta 350 ± 50 ìm.
- Med en mjuk borste, lyft och överföra SCN bit till ett lock från en medelstor petriskål fylld med kallt HBSS, som hänförts till en dissektion mikroskop eller stereoskop. Kolla under förstoring, om det bilaterala SCN syns tydligt. Om mitten-regionen i SCN kommer att väljas (som inte nödvändigtvis vara den enda "optimala" slice-nivå, men som vi anser är det enklaste sättet att standardisera skivning förfarandet och minska variation), bör det tydligt ses åtminstone på ena sidan avskiva avsnitt. Om snittet var för rostralt, gör en annan sektion och kontrollera SCN under förstoring.
4. Organotypic SCN Kultur
- I petriskål lock fylld med HBSS, dissekera ut bilaterala SCN som en fyrkantig vävnad (~ 1,5 mm på varje sida) med ett par av sterila skalpeller under ett dissekera mikroskop. En liten bit av den optiska chiasm förblir knutna till explantation, men inga andra atomkärnor bör inkluderas. Skär så nära som möjligt utan att ta bort SCN vävnad.
- Om det är lämpligt för den planerade experiment, kan det bilaterala SCN sedan halverades för att få två ensidiga SCN. En ensidig SCN kan sedan användas som kontroll (Fig 2a).
- Fyll 1200 ìl av luciferin-medium till ett ≈ 35 mm petriskål och placera en kultur membran (Milli-CM 0,4 ìm, Millipore, Bedford, MA) ovanpå vätskeytan (2b). Kulturen medelhög volym är avgörande, eftersom kulturen membranet ska sitta säkert på basen av kulturen skålen, inte flyta eller sten på medellång 11. Se till att det inte finns några luftbubblor under membranet. Undvik onödiga ljusexponering vid arbete med luciferin.
- Den explants är små och svåra att plocka upp. Därför använder en 1000 mikroliter pipett + tips att suga SCN Explantation i spetsen och tryck ut den på membranet. I de fall Explantation är för stor för att enkelt passa in i en 1000 mikroliter pipettspets (t.ex. råtta SCN, och mus bilaterala SCN) spetsen kan skäras med en steril verktyg för att skapa en bredare öppning. Kasta alltför HBSS på membranet med pipett. För luciferas inspelning, placera bara en SCN / skål (Fig. 2b) som spelar in rören upptäcka alla fotoner som avges från skålen och inte skilja mellan signaler från olika vävnader.
- Täta skålen med ett skyddsglas (≈ 40 mm, Menzel-Glaser, Tyskland) och vakuum fett (Dow Corning Corp, USA) 11. Se till att tätningen är tät (Figur 2c). Om inte, tätning med mera fett.
- Placera skålarna en 36-37 ° C ljus tät kammare och börja PMT-inspelningar omedelbart.
5. Mätning av luciferas aktivitet genom att spela in mareld
Luciferas-inducerade bioluminescens signaler från den lilla SCN vävnaden upptäcks och förstärks med photonmultiplier-rör (PMT) detektor församlingar monteras inuti ett ljus tät kammare. Den PMTs är normalt placerade ~ 1-2 cm ovanför kultur rätter 8. PMT inspelning inställningar kan skräddarsys eller kommersiellt tillgängliga 11.
- Placera skålen i en PMT (den värme som produceras från PMT tar bort kondens på omslaget glas) och Stäng kammaren. Se till att kammaren är 100% ljus-tight som den mörka räkningen av PMTs används för SCN vävnader är mycket låg (mindre än 20 fotoner / min). Den PMTs upptäcka även de svagaste ljuset läckage.
- Starta datainsamling, som utförs med programvara (till exempel LumiCycle, Actimetrics Inc., Wilmette, IL, USA). Photon räknas är integrerade över 1-10 min mellanrum för att få hög upplösning av genen / protein uttryck.
- När inspelningen är klar kan de erhållna dygnsrytm uttrycket av genen / protein analyseras med lämplig programvara (ursprung, OriginLab, Northampton, MA, USA, ClockLab, Actimetrics, LumiCycle, Actimetrics Inc, Chrono, Till Roenneberg, Universitetet i München, München, Tyskland) för att bestämma fas, perioden (tiden för en cykel) och amplitud av rytmen. Den högsta uttrycket av genen eller protein används främst som referenspunkt och definieras som den högsta fotonen räkna under en cykel. Uppgifterna kan jämnas före analys av fas, period och amplitud, särskilt om signal / brusförhållandet är låg. Baslinjen förändringar ibland och måste dras innan analyserna utförs.
6. Representativa resultat:
Vi presenterar här den oscillerande PER2:: Luc uttryck som en läsa upp för livskraft och kondition odlade vävnaden. Under optimala förhållanden, och om vävnaden är vid liv, det PER2:: Luc uttryck oscillerar med en dygnsrytm som visas i figur 3. PER2 i SCN är maximalt uttrycks normalt cirka Zeitgeber Tid 12-13 (där ZT 12 står för belysningen i ett 12:12 HR ljus: mörker-cykel). De större i storlek den levande vävnaden är, desto högre fotonen räkna blir. Dock bör storleken och tjockleken på organotypically odlade vävnad hållas små för att hålla vävnaden livskraftiga, helst inte större än 15 mm 2 11 och inte tjockare än 500 ìm 7. SCN, om skilj dem åt så beskrivs här, typiskt visar fotonen räknas mellan 10.000-40.000/min om vävnaden har plockats från en homozygot PER2:: Luc djur. Amplituden av svängningen i organotypic SCN kulturer är normalt mycket hög under den första cykeln, jämfört med följande cykler. Det är inte helt klart varför den första cykeln har mycket hög amplitUde. En möjlig förklaring är att en stor del av cellerna i vävnaden kan dö kort efter initial kapning och odling, och därmed inte utnyttjar luciferin efter den första cykeln. Den skärande förfarande kan också orsaka överdriven upphetsning, vilket kan förstärka de luciferas signalen under den första cykeln.
Figur 3 visar luminiscens spår från SCN skivor och innehåller en trace (röd) från en skiva som inte var från början friska. Döda eller ohälsosamma vävnader har lågt fotonen räkna baslinjer. (Dessutom, död vävnad separera ofta i skålen och kan inte tas bort från membranet i ett stycke.)
Tekniken beskrivs i denna rapport kan med fördel användas i farmakologiska experiment. Figur 4 visar ett spår från en kultur som vi behandlat mellan dag 1 och 2 med ett HCN-blockerare (ZD7288, 10 mikrometer). Som synes i figuren och som publicerats tidigare 15, minskade blockerare avsevärt amplitud dygnsrytm svängning PER2, men efter tvätt ut med normala odlingsmedium svängning kom tillbaka, visar att blockerare påverkade den molekylära klockan, men vävnaden var livskraftiga och friska.
Figur 1. Skivning förfarande
A) Chefen för ett avlivas halshuggen mus med ögonen och huden tas bort. B) Skalle, tas bort med en mikro rongeur verktyg. När du använder verktyget måste man arbeta uppåt och aldrig trycka ner hjärnan med verktyget. C) Hjärnan visas upp och ned (ventrala sida upp) utan lukt glödlampor. Den vita optiska chiasm med de två intakta synnerverna kan ses. Den suprachiasmatiska kärnan (SCN, gränserna markerade med rött) ligger nära synnerven chiasm. D) En koronalt klippa hjärnan knutna till plattform i vibroslicer, i nivå med SCN. E) coronal hjärnan avsnitt (250 ìm tjock) innehåller optiska chiasm (OC), tredje ventrikeln (3V) och bilaterala suprachiasmatiska kärnorna (SCN).
Figur 2. Organotypic vävnad odling.
A) De två ensidiga SCN kärnorna (infoga) skäras ut från segmentet visas. B) Kultur skålen (35 mm petriskål) med kultur membran, medelstora och Explantation, men utan vakuum fett och skyddsglas. Mediet (1,2 ml) kan ses som flytande mellan skålen och membranet. En ensidig SCN kärnan är placerad på kulturen membranet. Den vitaste delen av små vävnad är en del av synnerven chiasm (infoga). C) Kultur skålen med membran och dess SCN vävnad, förseglade med vakuum fett och en rund skyddsglas.
Figur 3. Bioluminescence inspelningar från friska och icke-hälsosamma kulturer SCN vävnad.
Exempel på bioluminescence inspelningar av perioden2:: luciferas (PER2:: LUC) uttryck i suprachiasmatiska kärnan (SCN) skivor från möss hölls i en 12h: 12h ljus: mörker-cykel. Den PER2:: Luc protein oscillerar med en dygnsrytm (~ 24 timmar) variation i vilken den maximala uttryck av proteinet sker vid Zeitgeber tiden 12-13. Således är den fas av genen rytm beroende på ljuset mörka schema där djuret hölls innan offras. Normalt visar mareld från ensidiga SCN vävnader dissekeras som beskrivs i protokollet fotonen räknas mellan ~ 10.000-40.000/minute. Figuren visar spår från en frisk (svart) SCN kultur, en icke-friska SCN kultur (röd) och en SCN kultur som torkat ut (blå) efter att öppna det förseglade kultur rätt på dag 4 och inte återförslutning skålen ordentligt ( indikeras med pil).
Figur 4. Bioluminescence inspelningen under och efter drog exponering.
PER2:: Luc uttryck i en kultur före, under och efter effekten av ett HCN-blockerare (ZD7288, 10 mikrometer). Den första pilen visar när blockerare lades. Den andra pilen visar wash-out, som gjordes genom att byta ut läkemedel som innehåller mediet med konditionerad kontroll medium. Notera reducerad amplitud efter 2 dagar av läkemedel exponering, bristande svängning på dag 4 och snabb återhämtning av proteinet rytmen efter wash-out.
Discussion
Fördelar och nackdelar med luciferas reporter teknik
I motsats till ex vivo metoder, såsom RT-PCR, in situ hybridisering och Western blot som kräver vävnad provtagning vid flera olika tidpunkter (som ger en låg tidsupplösning på normalt 2-4 timmar beroende på samplingsfrekvens) för att studera diurnal variationer i genen och protein uttryck tillåter luciferas reportern teknik med hög upplösning (1-10 min) studier av dygnsrytm svängningar under många dagar i samma beredning. Således är antalet djur som används minimeras och detaljerade studier av effekter på fas och period av rytmen är genomförbara, vilket normalt inte är möjligt med hjälp av konventionella stickprovsmetoder med låg tidsupplösning. Även relativa amplitud mätningar av rytm är möjliga, bör det understrykas att reportern tekniken inte är kvantitativ och kan därför inte användas för att mäta mängder av transkriberade gener eller översatt proteiner.
Vävnaden inspelningar kan startas och analyseras omedelbart efter odling, en stor fördel för direkt studera molekylära effekter av in vivo stress in vivo ljusinducerad fas skift etc. organotypic SCN kulturen kan på lång sikt (veckor) farmakologisk manipulation av vuxna hjärnan vävnad som innehåller en intakt mogen synaptiska nätverk och luciferas reportern teknik tillåter stabil inspelningar för många veckor. Således behöver vävnaden inte neonatal eller tidigt efter födseln för att få friska kulturer, och i motsats till den akuta skiva kroniska farmakologiska behandlingar kan utföras. I motsats till plasmid-reporter transfections i cellodlingar, som inte leder till inkorporeringen av DNA i arvsmassan, den transgena luciferas-djurmodeller (liksom Lenti-virus transfections) är gynnsam om epigenetiska förändringar ska studeras. Det bör i detta sammanhang också nämnas att luminiscens bildbehandling är idag möjligt med mycket känsliga CCD-kameror 11, vilket gör att inspelningar även i enstaka SCN nervceller (~ 6-10 mikrometer) och andra celltyper, som används av stora laboratorier studera dygnsrytm. Slutligen flera dygnsrytm utredare använder ofta övervakning av molekylära uttryck med hjälp av andra reportrar, såsom det grönt fluorescerande proteinet, för att studera klockan gen / svängningar protein 16-19.
Aspekter på skiva tjocklek
Den här rekommenderas tjocklekar SCN skiva (200-300 mikrometer) kan minskas eller ökas om så önskas. Men även om vävnaden planar ut på membranet efter några dagar i kulturen, är det inte rekommenderat att överstiga 500 ìm tjocklek initialt skär skiva för att bevara livskraften i vävnaden 7. En skiva tunnare än 100 ìm är av mekaniska och praktiska skäl svårt att hantera. Eftersom SCN vävnaden är heterogen tjockleken på skiva kan påverka fasen av luciferas utsignalen, eftersom olika regioner i SCN (till exempel "kärnan" kontra "skal", och rygg kontra ventrala regioner) pendlar med olika faser 20 och differentiellt igen synkronisera efter fas skift 21. Tjockleken på den del påverkar också baslinjen fotonen räkna sedan mer vävnad avger ett större antal fotoner. Amplituden av molekylära svängningar kan på detta sätt indirekt påverkas av storleken på Explantation. Av dessa skäl bör kontrollera och behandlas kulturer alltid av samma storlek, tjocklek och innehåller samma region av SCN för att svänga i samma fas och med samma amplitud. De två ensidiga kärnor, å andra sidan, pendlar i fas med varandra och med liknande amplituder så länge vibratome klipp är horisontell och inte vinklad (som i sin tur är beroende av att separationen snitt mellan lillhjärnan och de två halvkloten är vinkelrät till bordet yta). En utredare som utför SCN odling kan uppleva att SCN kulturer inte pendlar i fas med varandra. Öva och standardisering av skivning tekniken, dvs skivor alltid skärs vid samma Rostro-caudal nivå i SCN kommer att förbättra resultatet.
Kritiska steg
- Syretillförsel är kritisk.
Eftersom hjärnan kräver mycket syre 22 måste skivning förfarande som skall snabb (Ju närmare 3,1-3,10 är ~ 5-6 minuter desto bättre är det för att hålla vävnaden frisk). - SCN är känslig för temperaturförändringar och medelstora utbyte.
SCN är temperaturkänsliga och stora temperaturväxlingar kan fasförskjutning pacemakern och orsaka experimentella artefakter 23. Om medium eller lösningar byts ut eller läggs under ett pågående experiment, till exempel när de tillämpar en drog efter ett par dagar i kultur, medium eller Våra produktern måste förvärmas till 36-37 ° C (samma temperatur som i kammaren) innan addition. I farmakologiska experiment som involverar mediet börser är det viktigt att alltid arbeta med konditionerade cellkulturmedium. Tillägg / wash-out med färsk, kan obetingat medelstora fas eventuellt flytta molekylära SCN rytm 24 samt andra cellkulturer typ 25. - Medium sammansättning.
Det är viktigt att kulturen vävnaden i rätt pH och osmolalitet. Luften-buffrande medel innehåller en stor mängd HEPES, som har en optimal buffertkapacitet i intervallet pH 6,8-8,2 och är också lämplig för buffring av pH-förändringar som kan uppstå som ett resultat av cellandningen. HEPES, å andra sidan, är mer känslig för temperaturförändringar jämfört med natriumbikarbonat, som ingår i små mängder i odlingsmediet. Natriumbikarbonat har en större buffringskapacitet i lägre pH (5,1-7,1) område 26, vilket är lämpligt i en CO 2-atmosfär. Däremot ökade mängder av natriumbikarbonat i luften-buffrande medel (DMEM 2902) ökar osmolalitet avsevärt och kan inte läggas till utan att samtidigt späda medium, som i sin tur resulterar i fel sammansättning av aminosyror, vitaminer och joner.
Råd för att förbereda medium:- Var noggrann och försiktig vid blandning mediet.
- Använd endast färskt eller nyss tinat stamlösningar.
- I fall av mycket hög osmolalitet är det inte värt att späda. Mer än 5-6% utspädd medium kommer sannolikt inte att fungera. Använd D-glukos för att öka osmolalitet om det är för lågt.
- Fas skiftar beroende på förberedelsetid
Tiden för slice förberedelser är kritisk. Noll eller minimal effekt på fas erhålls om segmentet förfarande sker mellan ZT 6-12 december. Alla skiva dissektioner bör ske vid samma fas av dagaktiva eller dygnsrytm cykel för att minimera fel på grund av fas variation mellan förberedelserna.
Möjliga ändringar
- Vid akut SCN elektrofysiologi, har skivning skall utföras med en Ringer (Artificial ryggmärgsvätskan, ACSF) buffert, mättad med syre (95% O 2, 5% CO 2) innan den skivas startar. Vidare behöver syre att kontinuerligt till bufferten under hela skivning förfarandet, såsom el-och synaptisk aktivitet är direkt beroende av syretillförseln 22.
- Horisontella och sagittal skivor kan också vara framgångsrikt förberedd och odlade i SCN. Författarna har erfarenhet av luciferas inspelningar i horisontella skivor, som enligt vår erfarenhet ge dygnsrytm svängningar med lägre amplitud jämfört med coronal snitt.
- SCN är ca 1 mm lång Rostro-caudally och skivning teknik som beskrivs här är inriktad på att förvärva en SCN § i den centrala regionen. Däremot kan fler än en SCN avsnitt hämtas från mus och hjärnor råtta, vilket gör att utredningen av dygnsrytm gen / protein expression fler rostralt kontra caudal nivåer i SCN kärnan.
- Skär kulturer från yngre djur, postnatal valpar eller embryon, kan också vara beredd. Observera att hjärnan och skallen i mycket unga valpar är mycket mjuka och känsliga. Dessutom är synnerven tunna och inte helt utvecklad. Ta försiktig när dissekera hjärna ungarna så att SCN regionen inte är skadad. Till exempel kan mikro rongeur verktyg inte användas för att öppna skallen av mus ungar eftersom de är för stora. Fina sax är nog att klippa mjukdelar hos unga valpar.
- Den skyddsglas baserade kulturen teknik som beskrivs här kan också användas för att bilden luminiscens med hjälp av en CCD / EM-CCD-kamera, även i enstaka SCN nervceller.
- Andra centrala nervsystemet regioner och perifera vävnader organ från transgena PER2:: Luc djur kan lätt erhållas, odlade och analyseras i termer av molekylära svängningar, som PER2:: Luc uttryck fortsätter att svänga i flera dagar även i ett antal andra vävnader och celltyper 10. De flesta av dessa perifera vävnader, till exempel lever, inte kräver ett membran för att överleva men är istället odlas direkt badade på medellång 11. Observera att fasförskjutningen på grund av snittning kan odling i kultur och medelstora utbyte inte följa samma principer som för SCN.
Betydelse
I transgen mus och stammar råtta (mPER2:: Luc; mPer1-Luc 8, 10, 27) luciferas enzymaktiviteten speglar protein eller gen rytmer uttryck och kan bedömas genom bioluminescens inspelning. Den luciferas genererade mareld ger en svag signal men bakgrunden luminiscens är nära noll, vilket gör denna metod fördelaktigt. Dessutom, eftersom luciferas molekyl är instabil och snabbt bryts ner finns det ingen phototoxicitet, som kan visas under långvarig excitatoriska belysning 28. Sammantaget ger dessa egenskaper ger långvariga experiment gör luciferas reportern tekniken en stor fördel i dygnsrytm forskning.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Svenska Medicinska forskningsrådet (K2009-75SX-21.028-01-3, K2008-61x-20700-01-3), FONCICYT 000000000091984, grundvalarna för Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist och Sigurd och Elsa Goljes Minne och Svenska Läkaresällskapet SLS-95.151. Professor Gene D. Block, UCLA, är tacksamt erkänd för värdefulla synpunkter på manuskriptet. Vi tackar Dr Michael Andäng och Dr Helena Johard för HCN-blockerare, och professor Abdel El-Manira för att tillhandahålla video-mikroskop.
Etiska överväganden:
Alla experiment på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Karolinska Institutet och "Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd". Alla djurförsök utförs med avsikt att minimera eventuella stress eller obehag för djuret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B27 supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cover glasses | Menzel-Glaser | 40#1 | ≈ 40 mm |
| Culture membranes | EMD Millipore | PICMORG50 | 0.4 μm |
| DMEM low glucose w/o phenol red | Sigma-Aldrich | D2902 | Powder for 1L |
| Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | ≈ 55 mm |
| Filtration set | Corning | 431097 | Pore size 0.22 μmPolyethersulfone |
| Forceps | Allgaier Instrumente | 0203-7-PS | Dumant #7 |
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | 100 ml |
| HBSS 10x | Invitrogen | 14065-049 | 500 ml |
| NaOCH3 7.5% | Invitrogen | 25080-060 | 50 ml |
| Luciferin | Promega Corp. | E1602 | Beetle luciferin, potassium salt |
| Micro rongeur tool | Allgaier Instrumente | 332-097-140 | |
| PenStrep 10,000 U/ml | Invitrogen | 15140-122 | 100 ml |
| Petri dishes | Corning | 430165 | ≈ 35 mm |
| PMT | Hamamatsu Corp. | H9319-11MOD | |
| Disposable scalpels | Paragon | P503 | Size 11 |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 09-761-5 | |
| Vacuum grease | Dow Corning | 50 g | |
| Vibratome | Campden Instruments |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).
- Green, D. J., Gillette, R. Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice. Brain Res. 245, 198-200 (1982).
- Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice. Brain Res. 247, 154-158 (1982).
- Groos, G., Hendriks, J. Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro. Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).
- Klein, D., Moore, R., Reppert, S. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).
- Pol, A. N. V. anden The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy. J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures. Curr Biol. 7, 758-766 (1997).
- Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization. J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice. J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).
- Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina. Brain Res. 1050, 101-109 (2005).
- Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light. J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).
- LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization. Brain Res. 964, 279-287 (2003).
- Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus. J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).
- Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats. Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).
- Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).
- Burgoon, P. W., Boulant, J. A. Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).
- Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation. Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).
- Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins. Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).
- Kohn, R. A., Dunlap, T. F. Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro. J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).
- Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).
