Summary
במאמר זה, אנו מתארים את הזיהוי של adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 3 (AAV3) כווקטור היעילה ביותר להכוונת האדם תאים סרטניים בכבד.
Abstract
וקטורים רקומביננטי המבוסס על parvovirus שאינם פתוגניים האדם, הנגיף adeno הקשורים 2 (AAV2) פותחו, והן נמצאות כיום בשימוש במספר הניסויים בטיפול גנטי קליני. לאחרונה, מספר נוסף קפסיד AAV יש גם מבודד, אשר הוכחו התערוכה סלקטיבית רקמות כמיהות שונות במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים 1. מתוך 10 קפסיד הנפוץ ביותר AAV, AAV3 היא רחוקה לפחות יעיל transducing תאים ורקמות במבחנה, כמו גם in vivo.
עם זאת, מחקרים שפורסמו לאחרונה, אנו תיעדו כי AAV3 וקטורים transduce סרטן הכבד האנושי --Hepatoblastoma (HB) ו קרצינומה hepatocellular (HCC) - שורות תאים מאוד יעיל כי AAV3 מנצל הגורם האנושי hepatocyte קולטן צמיחה כמו הסלולר שיתוף קולטן עבור מחייב ואת הערך התאים האלה 2,3.
במאמר זה נתאר את הצעדים הנדרשים כדי להשיג יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים אנושיים הכבד על ידי רקומביננטי AAV3 וקטורים נושאת גן הכתב. השימוש AAV3 וקטורים רקומביננטי נושא הגן הטיפולי עלול להוביל בסופו של דבר טיפול הגן הפוטנציאל של סרטן הכבד בבני אדם.
Protocol
1. אריזות של רקומביננטי Adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 3 (rAAV3) וקטורים
- עבור אל אתר האינטרנט: " http://www.geguchadze.com/calc "ולחשב את כמות ה-DNA.
- טרום לערבב פלסמידים pHelper (עוזר adenovirus), pACG2c3 (AAV עוזר) ו pdsAAV-CB-EGFP (rAAV וקטור) ב בינוני ללא FBS ואנטיביוטיקה. סך הכל צריך להיות נפח 8750 μL עשר 15 ס"מ 2 צלחות.
- הוסף ישירות 1250 μL של PEI (0.1% m / v, Polysciences, חתול # 23966, pH 4.5) לתוך פתרון ה-DNA בשלב 1.2. וורטקס פתרון ה-DNA PEI במשך כמה שניות.
- דגירה-DNA PEI פתרון להקים קומפלקס 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף 1 מ"ל של פתרון ה-DNA PEI לכל צלחת 15 ס"מ 2.
- הסר בינוני לאחר 4 שעות, עם החלפת בינוני טרי 25 מ"ל להשלים 10% FBS (C-DMEM).
- שבעים שעתיים שלאחר transfection, תאים לגרד ויוצקים לתוך צינור מ"ל 250 צנטריפוגות חרוטי.
- ספין בסל"ד 3000, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. יוצקים את supernatant.
- Re-להשעות את התא גלולה ב 5 מ"ל של RB TMS חוצץ (50 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0). מעבירים צינור חדש 15 מ"ל חרוטי.
- הקפאת באמבט קרח יבש אתנול דקות 10 ו להפשיר על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חזור שלוש פעמים.
- הוסף 1 μL של 4.8 M MgCl 2 ו 2 μL של Benzonase (25 U / μL, Novagen, חתול # 70664-3). וורטקס ו דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
- ספין למטה בסל"ד 4000, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות לאסוף את supernatant (הבהיר lysate).
- בתוך צינור 13 חותם Quick-צנטריפוגות מ"ל (Beckman, חתול # 342413), עומס iodixanol שיפוע (OptiPrep, חתול # 1114542) מלמעלה למטה: 2 מ"ל של 15%, 2 מ"ל של 25%, 1.5 מ"ל של 40% 1.5 מ"ל של iodixanol 60%. טען את supernatant (שלב 1.12) בחלק העליון של שיפוע iodixanol. ממלאים את צינורות עם הצפת TMS RB.
- צנטריפוגה בסל"ד 75,000 במשך שעה 1 ב 16 ° C באמצעות הרוטור Beckman 90Ti.
- אסוף את שבריר iodixanol 40% על ידי החדרת המזרק בגבול 40-60%.
- העברת חלק iodixanol 40% שפופרת 50 מ"ל one חרוטי ולעשות עד 40 מ"ל עם הצפת (20 mM טריס, 15 mM NaCl, pH 8.5).
- להרכיב את מנגנון סינון באמצעות HiTrap ש HP עמודה (GE Healthcare, חתול # 17-1154-01). לשטוף את העמודה עם חיץ את הדברים הבאים: 25 מ"ל של הצפת (20 mM טריס, 15 mM NaCl, pH 8.5); 25 מ"ל של הצפת B (10 mM טריס, 500 mM NaCl, pH 8.5); 50 מ"ל של הצפת; 40 מ"ל של מדגם וירוס חוצץ; 50 מ"ל של הצפת (20 mM טריס, 15 mM NaCl, pH 8.5); 20 מ"ל של הצפת C (20 מ"מ טריס, 175 mM NaCl, pH 8.5);
- איסוף C הצפת בתוך 20 מ"ל אפולו ריכוז (Orbital Biosciences). צנטריפוגה ב 3000 סל"ד, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מחק את הזרימה דרך ולהוסיף 20 מ"ל של PBS צונן צנטריפוגות בסל"ד 3000, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מחק את הזרימה דרך ולהוסיף 500 μL של PBS צונן. שטפו את הווקטורים מן הקרום והעברת סיליקון שטופלו צינורות Eppendorf ולאחסן קפוא aliquots קטן -80 ° C.
2. קביעת rAAV3 titers וקטור
- הפשירי 10 μL של מטוהרים וירוס בצינור Eppendorf על הקרח. הוסף 40 μL של DDH 2 O.
- הוסף 0.2 μL של Benzonase (25 U / μL, Novagen, חתול # 70664) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- קח 50 μL של תקן פלסמיד (0.2 ng / μL) בצינור אחר Eppendorf.
- הוסף 50 μL של 100 mM NaOH בצינור כל דגירה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- צ'יל על קרח מיד דקות לפחות 5.
- גזור קרום ההעברה (Millipore, חתול # INYC00010) לפי Bio-Dot מסנן נייר (Bio-Rad, חתול # 1620161). יש לשטוף את הממברנה ב SSC 10x עם שלושה מאמרים סינון עבור 20 דקות.
- הגדר חריץ כתם SF Apparatus (Bio-Dot, חתול # 170-6542). התחברות בקבוק ואקום ולהוסיף 100 μL של SSC 10x למנגנון כתם חריץ.
- הוספת 100 μL של 20x SSC ו 1 μL של צבע טעינת 6x לכל אחד דגימות בשלב 2.5.
- טען 100 μL של דגימות כל על הממברנה במנגנון כתם חריץ.
- הוסף עוד 100 μL של SSC 10x לתוך כל הדגימות.
- חזור על שלבים 2.9 ו - 2.10 עד שכל מדגם עובר דרך הממברנה.
- לפרק את המנגנון כתם חריץ ולהסיר את הקרום. שים את זה לתוך לינקר מפקח SL-1000 Crosslinker UV. הפעל "אנרגיה", "Crosslink אופטימל" (להראות 1200) ולדחוף "התחל".
- מרתיחים 1 מ"ל של זרע סלמון (SS) DNA (פישר, חתול # NC9753983) במשך 5 דקות. צ'יל על הקרח דקות לפחות 5.
- הכן את הפתרון הכלאה מראש על ידי ערבוב 27.5 מ"ל של DDH 2 O, 15 מ"ל של 20x SSC, 5 מ"ל של תמיסת 50x של Denhardt, 1.25 מ"ל של SDS 20%, 0.25 מ"ל של פולה ו 1 מ"ל של הס"ס דנ"א שלב 2.13.
- להשעות את הממברנה של 25 מ"ל של תמיסת הכלאה מראש בתוך גליל זכוכית דגירה כתרים על 65 מעלות צלזיוס בתא הכלאה בין לילה.
- מדולל 50 תבניות DNA ng ב 10 μL של DDH 2 O. מרתיחים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומקררים על קרח מיד דקות לפחות 5.
- צנטריפוגה ב 3000 סל"ד ב RT דקות 1. הוסף 2 μL של 10 מ"מ 3 dNTPs (חסר dCTP), 2 μL של מיקס Hexanucleotide (רוש, חתול # 11277081001), 1 μL של Klenow (רוש, חתול # 11008404001) ו 5 μL של α -32 P-dCTP. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה G-50 עמודות (GE Healthcare, חתול # 27-5330-01) בסל"ד 3000 דקות 2. עומס בדיקה שלב 2.17 לתוך הטור. צנטריפוגה בסל"ד 3000 דקות 2 לאסוף את הזרימה דרך.
- הרוזן רדיואקטיביות. מרתיחים את החללית על 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומקררים על קרח מיד דקות לפחות 5.
- מוסיפים את החללית (6x10 5 עותקים לדקה / mL) לתוך תמיסה הכלאה מראש עם קרום.
- דגירה לילה בשעה 65 ° C בתא הכלאה.
- מחק את הפתרון הכלאה ולשטוף את הממברנה ב 2x SSC SDS 0.1% ב RT במשך 15 דקות.
- מחק את הפתרון ולשטוף את הממברנה של 0.1x SSC SDS 0.1% ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- מחק את הפתרון ולשטוף את הממברנה של 0.1x ב SSC בקצרה RT.
- לחשוף את הסרט ב -80 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ולפתח את הסרט. תוצאה אופיינית מוצג באיור 1.
3. rAAV3 וקטור בתיווך התמרה והביטוי transgene בתאי סרטן הכבד האדם
- 1x10 Seed 4 תאים (או Huh7 או Hep293TT) היטב בכל צלחת 96-היטב. מדגירים את humidified CO 2 באינקובטור במשך לפחות 18 שעות.
- הסר בינוני מהצלחת 96-היטב.
- שטפו פעמיים עם תאים μL 50 FBS במדיום ללא אנטיביוטיקה ולהסיר.
- הוסף 50 μL של המדיום בלי FBS ו אנטיביוטיקה וקטורים rAAV VGS ב 5000 / תא.
- דגירה הצלחות של CO 2 באינקובטור במשך 4 שעות.
- מחק את המדיום. שטפו פעמיים עם תאים μL 50 בינוני מלא ולהסיר.
- הוספת 150 μL של C-DMEM זה היטב דגירה את הצלחת ה-CO 2 באינקובטור למשך 72 שעות, ולדמיין את הביטוי EGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (DMI 4000B, Leica Microsystems).
- תמונות מתוך שלוש בארות של תאים הנגועים בנגיף מנותחים כמותית ידי ImageJ ניתוח תוכנה (NIH, Bethesda, MD, ארצות הברית).
- הביטוי transgene מוערך כשטח ירוק הכולל של הקרינה (פיקסל 2) לכל שדה הראייה. תוצאה אופיינית היא שמוצג באיור 2.
- הביטוי transgene ניתן גם נקבע על ידי cytometry הזרימה.
4. נציג תוצאות:
בעקבות פרוטוקול שתואר לעיל, אפשר ליצור וקטורים AAV סרוטיפ וביעילות. התשואה טיפוסית היא ~ 500 המכיל μL ~ 10 11 VGS / μL של מטוהרים מניות וקטור. טוהר של המניה וקטור נקבע על ידי השוואת האותות הכלאה כתמים על חריץ ה-DNA כמותי, עם או בלי Benzonase העיכול. מטוהרים rAAV3 וקטורים transduce סרטן הכבד האנושי --Hepatoblastoma (HB) ו קרצינומה hepatocellular (HCC) - שורות תאים וביעילות.
באיור 1. DNA כמותי חריץ כתם ניתוח לקביעת titers rAAV3 של וקטורים. כפולה של דילולים מטוהרים מניות ויראלי, מעוכל עם Benzonase (השורה העליונה) נותחו על כתמים חריץ ה-DNA כמותי עם 32 P-שכותרתו EGFP ספציפי בדיקה דנ"א. כייל של וקטור AAV3 נקבע על ידי השוואה עם 1 ננוגרם (בשורה האמצעית) או 10 ננוגרם (השורה התחתונה) של AAV-EGFP סטנדרטים פלסמיד טעון על הממברנה. המספרים תואמים עותקים DNA.
איור 2. רקומביננטי AAV וקטור בתיווך ביטוי transgene בתאי סרטן אנושי כבד. תאים Hep293TT,-Hepatoblastoma שהוקם לאחרונה התא האנושי קו 4, היו או (פאנל משמאל) מעושה נגוע, או transduced עם VGS 5000 / תא או scAAV2-EGFP או scAAV3-EGFP וקטורים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. הביטוי transgene היה דמיינו 72 שעות שלאחר התמרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Discussion
וקטורים רקומביננטי המבוסס על parvovirus פתוגניים הלא אנושי, וירוס adeno הקשורים (AAV) פותחו, והן נמצאות כיום בשימוש במספר ניסויים קליניים ריפוי גנטי 5. בעבר, של 10 קפסיד הנפוץ ביותר AAV, יעילות התמרה של AAV3 וקטורים בכלל דווחה להיות נמוך במיוחד, הן במבחנה in vivo 1. עם זאת, תצפית האחרונות שלנו AAV3 וקטורים transduce האדם סרטן הכבד שורות תאים מאוד טוב, כפי שנקבע על ידי כמותית cytometry זרימה 2, AAV3 כי מנצל את hepatocyte האנושי גורם הגדילה לקולטן (hHGFR) כמו הסלולר שיתוף קולטן לכניסה מחייב אלה 3 תאים, ממליצים סלקטיבי רקמות כמיהות של AAV3 בתאי כבד אנושיים בכלל, אדם בתאי סרטן הכבד בפרט. עם זאת, מאז AAV3 וקטורים גם transduce hepatocytes אדם נורמלי וביעילות 2, להשתמש הפוטנציאל שלהם ביישום גנים לטיפול בסרטן in vivo תהיה מושפעת לרעה. אסטרטגיה אחת ניתן לעקוף בעיה זו פוטנציאל כולל תעתיק במיקוד של תאים סרטניים על ידי זיהוי תוצר הגן מיוצר באופן סלקטיבי על ידי הגידול, אך לא על ידי hepatocytes נורמלי. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי רמות בסרום של α-fetoprotein (AFP) משמשים כסמן ספציפית עבור מעקב נוכחות, התקדמות, ו / או הישנותם של סוגים מסוימים של סרטן הכבד, מאז hepatocytes נורמלי בדרך כלל מייצרים כמויות קטנות מאוד של חלבון זה. ואכן, השתמשנו AAV3 וקטורים המכילים את האמרגן AFP למקד ביטוי transgene בתאי סרטן הכבד, אבל לא נורמלי hepatocytes 2, ומחקרים כרגע בעיצומו כדי לבדוק את היעילות של גישה זו במודל xenograft Murine של סרטן הכבד. במחקרים נוספים שלנו, יש לנו ציין כי יעילות התמרה של וקטורים שונים AAV סרוטיפ יכול להיות מוגבר באופן משמעותי על ידי mutagenesis באתר בבימויו של משטח חשוף שאריות טירוזין ב capsids ויראלי 6-14. מאז 6 של 7 פני השטח חשוף tyrosines שמורים גם AAV3, יש לנו אתר ביצע מכוונת mutagenesis של שאריות אלה, ציין כי יעילות התמרה של טירוזין מוטנטי AAV3 וקטורים היא משופרת באופן משמעותי האדם תאים סרטניים בכבד (נתונים שלא פורסמו). מחקרים גם מתנהלת כיום כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של טירוזין מוטנטי AAV3 וקטורים במודלים xenograft העכבר עבור-Hepatoblastoma האדם קרצינומה hepatocellular, ואם מצליחים, האופטימלי טירוזין מוטנטי וקטורים AAV3 סרוטיפ עשוי להיות שימושי עבור מיקוד הכבד האנושי סרטן לטיפול הגן פוטנציאליים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. ר ג'וד Samulski ואת שיאו שיאו מתנות מסוגם של AAV3 רקומביננטי ו - AAV-EGFP פלסמידים, בהתאמה, ד"ר גייל טומלינסון עבור בנדיבות מתן תאים Hep293TT. מחקר זה מומן בחלקו על ידי השירות לבריאות הציבור להעניק מענקים R01 HL-076901, 097088 HL-R01, ו - P01 DK-058327 (פרוייקט 1) מן המכון הלאומי לבריאות (בתור).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).
