Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Summary

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Abstract

Embryonalentwicklung der Niere wurde ausgiebig sowohl als Modell für die epithelial-mesenchymale Interaktion in der Organentwicklung und das Verständnis für die Ursprünge der angeborenen Nierenerkrankungen zu gewinnen untersucht. In jüngerer Zeit hat die Möglichkeit der Steuerung naiv embryonalen Stammzellen in Richtung nephrogenen Schicksale in dem aufstrebenden Gebiet der regenerativen Medizin erforscht. Genetische Studien in der Maus haben mehrere Wege für Nieren-Entwicklung erforderlich identifiziert, und einen globalen Katalog der Gen-Transkription in die Orgel wurde vor kurzem generiert http://www.gudmap.org/ und bietet zahlreiche Kandidaten Regulatoren der wesentlichen Entwicklungs-Funktionen. Organogenesis der Nagetier-Niere kann in Organkultur untersucht werden, und viele Berichte haben diesen Ansatz verwendet, um die Ergebnisse der beiden Kandidaten die Anwendung Proteine ​​oder klopfen Sie den Ausdruck von Kandidatengenen mittels siRNA oder Morpholinos analysieren. Allerdings ist die Anwendbarkeit der Organkultur dem Studium der signalisiert, dass Stammzellen / Vorläuferzellen Zelldifferenzierung gegenüber Erneuerung regelt in den Entwicklungsländern Niere begrenzt, da kultivierten Organe einer kompakten extrazellulären Matrix Diffusionsgrenzstrom von Makromolekülen und Viruspartikel enthalten. Um die Zelle Signalwege, die den Stamm / Progenitorzellen Nische in der Niere haben wir eine primäre Zelle, das die nephrogenen Zone oder Progenitorzellen Nische der Entwicklung von Niere ex vivo isoliert von der epithelialen Induktor der Differenzierung schafft entwickelt haben Einfluss zu studieren. Mit begrenzten enzymatische Verdauung, können nephrogenen Zone Zellen selektiv befreit von sich entwickelnden Nieren bei E17.5. Nach der Filtration, können diese Zellen als eine unregelmäßige Monoschicht mit optimierten Bedingungen kultiviert werden. Marker-Gen-Analyse zeigt, dass diese Kulturen eine Verteilung von Zelltypen Merkmal der nephrogenen Zone in vivo enthalten, und dass sie unterhalten geeignete Marker-Gen-Expression während der Kulturzeit. Diese Zellen sind sehr zugänglich für kleine Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die erleichtert das Studium der Kandidat Stamm / Progenitorzellen Regler Effekte. Grundlegende zellbiologische Parameter wie Proliferation und Zelltod sowie Veränderungen in der Expression von molekularen Markern Merkmal Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo erfolgreich als experimentellen Ergebnissen verwendet werden. Laufende Arbeiten in unserem Labor mit Hilfe dieser neuartigen primären Zelle Technik zielt darauf ab, die grundlegenden Mechanismen für die Regulierung von Selbst-Erneuerung im Vergleich Differenzierung in Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen aufzudecken.

Protocol

1. Vorbereitung Reagenzien für die Nieren Verdauung

1. 1,5 ml 0,25% Collagenase A (w / v) und 1% Pankreatin verdauen (w / v) Lösung zur Extraktion von nephrogenen Zone Zellen (NZCs) von 8 E17.5 Nieren notwendig sein. Da Pankreatin dauert ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur zu lösen, genug zu verdauen Lösung für die größte Zahl von embryonalen Nieren erwarten sollte vor dem Versuch erfolgen. Bereiten Analysenlösung durch erste Zugabe von 25 mg Collagenase A bis 10 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) in eine klare 15 ml, steriles Zentrifugenröhrchen. Es ist wichtig, dass die DPBS enthält kein Kalzium oder Magnesium, da dies mit der enzymatischen Verdauung stören. Mix-Lösung auf einem Kolbenpendel für 10 Minuten zu lösen Collagenase A. Add 100 mg Pankreatin aufgelöst Collagenase A-Lösung und mischen auf einem Kolbenpendel für mindestens 2 Stunden. Alternativ können Collagenase A / Pankreatin Analysenlösung auf einem Kolbenpendel gemischt über Nacht bei 4 ° C. Es wird empfohlen, dass Sie eine Maske tragen, wie Collagenase A und Pankreatin leicht zerstreuen in die Atmosphäre während des Wiegens und Nasengänge reizen.
2. Bereiten Sie eine 5% fötalem Rinderserum (FBS) (v / v) Lösung in Kochsalzlösung Hank-Lösung (HBSS). Umkehren, um zu mischen. 1 ml für jede Röhre von 8 Nieren notwendig sein wird.
3. Bereiten Kulturmedium durch Ergänzung Keratinocyte serumfreiem Medium mit 1% Glutamin (v / v) und 1% Penicillin-Streptomycin (PenStrep) (v / v).
4. Coat sterile Flachboden Polystyrol Zellkultur-Platten (96, 48, 24 oder 6 gut) mit humanem Fibronectin-Lösung bei einer Konzentration von 5 mg pro cm ² des Wachstums Oberfläche. 5 mg Fibronectin-Pulver wird in 5 ml sterilem H ₂ O resuspendiert Dies ist 1:25 in steriler DPBS ohne Calcium oder Magnesium verdünnt und 250 ml in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte aufgenommen. Die Platten werden dann mit Fibronektin-Lösung bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 1 Stunde bei 4 ° C. Alternativ inkubiert und anschließend können Platten über Nacht bei 4 ° C. Die Lösung wird dann in einer Sterilbank abgesaugt vor der Zugabe von Medium / Zellen.

2. Dissecting Nieren & Entfernen von Kapseln (Done bei Raumtemperatur)

1. Am E17.5, Opfer der Mutter mit einem Verfahren durch Ihre Institutional Animal Care und Verwenden gebilligten entfernen die Gebärmutter, und legen Sie sie in eine Petrischale mit DPBS mit Calcium und Magnesium. Unter einem Binokular, verwenden Uhrmacher Pinzette für jeden Embryo aus der Gebärmutter zu entfernen und zu enthaupten jedem Embryo. Sobald der gesamte Wurf ist aus der Gebärmutter, Übertragung der Embryonen auf eine saubere Petrischale mit genug DPBS mit Calcium und Magnesium, um vollständig zu bedecken die Embryonen zu hinterlassen, wie viel Blut und Gewebereste wie möglich.
2. Mit einer Pinzette, einen umlaufenden Schnitt in der Bauchwand des Embryos auf der Ebene des Nabels. Dann legen Sie den Embryo auf dem Rücken, Pin es sich bei den Schultern mit einem Satz von Zangen, und entfernen Sie die inneren Organe von der Lunge bis in die Blase mit den anderen Satz von Zangen. Mit der Praxis kann dies in einer Bewegung ausgeführt werden. Die Nieren sollten auf der Rückseite der Masse der Organe beigefügt werden. Wenn die Nieren nicht auf die ausgenommenen Organen verbunden zu tun bleiben, können sie vorsichtig aus der dorsalen Körperwand entfernt werden. Nieren, die in dieser Sektion Prozess beschädigt wurden zu verwerfen, da sie die letzte Kultur mit ungeeigneten Zelltypen verunreinigt werden.
3. Gently necken sich die Nieren aus dem Rest der Organe, kümmert sich um die Nieren miteinander verbunden bleiben. Halten Sie das Gewebe zwischen den Nieren mit einer Reihe von Zangen und Greifer der Nebenniere an einer der Nieren mit der anderen Pinzette. Die Nebenniere sollte die Nierenkapsel angebracht werden. Vorsichtig schälen Nebenniere und Kapsel von außen um die Niere, ähnlich Schälen einer Banane. Achten Sie darauf, die Niere in zwei Hälften geteilt, während Peeling, und sicher sein, nicht auf die Nierengewebe unter der Kapsel beschädigt. Entfernen Sie vorsichtig restlichen Kapsel sowie den Harnleiter, ob es noch angebracht ist. Wiederholen Sie mit den verbleibenden Niere.
4. Verwenden Sie einen Schnitt Transfer-Pipette in die Nieren in ein 5 ml Polystyrol Röhrchen HBSS Platz. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,4 für jeden Embryo. Nieren 8. Mai pro Röhrchen gepoolt werden. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Kapsel entfernen dauert 2-3 Minuten pro Embryo.

3. Enzymatische Verdauung der Nieren (alle Schritte bei Raumtemperatur Soweit nicht anders angegeben)

1. Entfernen HBSS-Lösung von 5 ml Röhrchen mit Nieren mit einer Pipette, während er vermeidet den Kontakt mit den Nieren. Sofort im 1,5 ml Collagenase A / Pankreatin Analysenlösung in der 5 ml Röhrchen mit Nieren, bevor er nach der nächsten Probe. Wiederholen Sie für jede Röhre der Nieren.
2. Die Röhrchen mit Enzym / Niere verdaut auf einem Kolbenpendel in einer vorgewärmten 37 ° C Inkubator für 15 Minuten. 2 Minuten vorAbschluss der Verdauung, fügen Sie 3 ul DNase (1 U / ml) zu einem frischen 5 ml Polystyrol Röhrchen für jeden verdauen durchgeführt wird.
3. Schnelles Entfernen verdaut vom Inkubator, fügen Sie 75 ul FBS und invertieren 3 mal zu mischen. Lassen Sie Standplatz auf der Bank für 2 Minuten.
4. Übertragen 1,4 ml der Zellsuspension auf die 5 ml Polystyrol Röhrchen mit DNase (1 U / ml), während die restlichen 0,2 ml Zellsuspension und Nieren hinter sich. Die zusätzlichen 0,2 ml Lösung zurückgelassen werden Verunreinigungen wie extrazellulären Matrix enthalten.
5. Mix Zellsuspension / DNase auf einem Kolbenpendel in einer vorgewärmten 37 ° C Inkubator für 10 Minuten.
6. Schnelles Entfernen Zellsuspensionen von Inkubator und Transfer jeweils mit einer 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Spin Zellsuspensionen in Mikrozentrifuge bei 325 g für 5 Minuten.
7. Remove from Zellpellet und Pellet Überstand in 1 ml 5% FBS / HBSS, Auf-und Abpipettieren von 5 bis 6 mal. Cap jedes Rohr, bevor er nach der nächsten Probe.
8. Spin Zellsuspensionen in einer Mikrozentrifuge bei 325 g für 5 Minuten.
9. Überstand entfernen und fügen Sie 0,5 ml Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) mit Zusatzstoffen in jedes Röhrchen und Kapillarrohr, bevor er nach der nächsten Probe. Nach Medium hat zu allen Röhrchen hinzugefügt, vorsichtig resuspendieren jedem Zellpellet durch Auf-und Abpipettieren von 5 bis 6 mal mit einer 1 ml Pipette. Kombinieren Sie alle Zellsuspensionen in einem frischen 5 ml Polystyrol Röhre.
10. Vornässen zwei 40 Mikron Zell-Sieb Kappen auf einem 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen mit KSFM pro Probe gestellt. Pass Zellsuspensionen durch eine Zellsieb Kappe durch die Übertragung mit einer 1 ml Pipette. Berühren Sie den Filter mit der Pipettenspitze. Sammeln Flow-Through und wiederholen Filtration durch das zweite Sieb Kappe. Entfernen Sie die Zellsieb Kappe und durch eine neue Mütze aus einer normalen 5 ml Polystyrol Röhre.
11. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder andere Zelle Zähleinrichtung und Transfer-Zellen in die Vertiefungen einer Fibronektin beschichtete Zellkulturplatten mit einer Dichte von 100.000-200.000 Zellen pro cm ^2, Verdünnung wie bei KSFM mit Additiven erforderlich. Grundsätzlich rufen wir etwa 4.5x10 ⁶ Zellen pro 10 Embryo Wurf.
12. Inkubieren von Zellen in einer 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
13. Lassen Zellen sich zu erholen und legen für 2-4 Stunden in Medium vor der Stimulation mit zusätzlichen Reagenzien. Stimulieren Zellen mit Verbindung von Interesse für 1 bis 48 Stunden. Purify RNA für die PCR-Analyse unter Verwendung des Qiagen RNeasy Micro Kit nach den Anweisungen des Herstellers oder folgen Sie den Anweisungen unten, um fluoreszenzmarkierte immunostain den Zellen.

4. Vorbereitung Reagenzien für die Fixierung der Zellen und Immunfärbung

1. Bereiten Sie 4% PFA: Lösen Sie 4% Paraformaldehyd in PBS (v / v) bei 55 ° C mit regelmäßigen Bewegung. Auf Raumtemperatur abkühlen, bevor verwenden. Diese Lösung ist giftig und sollte nur in dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden.
2. Bereiten Permeabilisierung Lösung durch Zugabe von Triton X-100 in PBS um 0,3% (v / v) Lösung zu erhalten.
3. Bereiten Sie einen 5% Blocking-Lösung in PBS mit Serum aus der gleichen Spezies wie wurde verwendet, um den sekundären Antikörper verwendet werden erhöhen. Zum Beispiel, wenn Sie einen Kaninchen-Antikörper gegen Ihre Ziel-Antigen mit einem Esel anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 erkennen wird, bereiten Sie einen Blocking-Lösung mit 5% Esel-Serum. Lagerung bei 4 ° C.
4. Bereiten primärer Antikörper-Lösung durch Zugabe der entsprechenden Konzentration des Antikörpers bis 5% Blocking-Lösung.
5. Bereiten sekundären Antikörper-Lösung unmittelbar vor Gebrauch. Add Fluorophor konjugierten Antikörper in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration zusammen mit der nuklearen Gegenfärbung DAPI und anderen Organellen Marker wie Phalloidin bis 5% Blocking-Lösung. Wenn Speicher benötigt wird, halten Lösung im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung.
6. Bereiten Sie 50% Glycerin / PBS-Lösung (v / v) für die Lagerung von immungefärbt Zellen. Alternativ können Vectashield verwendet werden.

5. Fixierung der Zellen und Immunfärbung

1. Das folgende Protokoll ist für die Fixierung und Färbung von NZCs in einer 24-Well-Platte ausgelegt. Volumes gegeben werden für eine einzige gut. Reagenzien sollte vorsichtig bei allen Schritten zur Ablösung von Zellen zu vermeiden pipettiert werden, und die Platte Agitation ist nicht in der Inkubationsschritte empfohlen.
2. Entfernen Sie vorsichtig Medium mit einer 1 ml-Mikropipette und 0,5 ml 4% PFA für angebracht kultivierten Zellen. Inkubieren für 15 Minuten ungestört bei Raumtemperatur.
3. Entfernen 4% PFA und 0,5 ml pro Vertiefung der Permeabilisierung Lösung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Permeabilisierung Lösung und schonend zweimal gründlich mit 0,5 ml PBS pro Spülung.
5. 0,5 ml Blocking-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
6. Entfernen Blockierungslösung und fügen 0,225 ml Primärantikörper-Lösung.
7. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C.
8. Entfernen primärer Antikörper-Lösung und sanft rinse zweimal mit 0,5 ml PBS pro Spülung.
9. Add 0,225 ml sekundären Antikörper-Lösung. Inkubieren Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
10. Entfernen sekundären Antikörper-Lösung und schonend zweimal gründlich mit 0,5 ml PBS pro Spülung.
11. Fügen Sie 0,3 ml 50% Glycerin / PBS-Lösung (v / v) oder genug Vectashield nach unten gut bedecken.
12. Bild Zellen mit Epifluoreszenzmikroskop oder lagern in Folie verpackt bei 4 ° C.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. NZCs wurden von E17.5 Embryonen gereinigt, vernickelt auf 200.000 Zellen pro cm ² und bei 37 ° C für insgesamt 24 Stunden. Die Zellen wurden durch Phasenkontrast mit einem Leica DM IRB inverse Mikroskop vor Immunfluoreszenzfärbung abgebildet. (A) 20X Phasenkontrast Blick NZCs nach 24 Stunden in Kultur. (B) wurden die Zellen fixiert und gefärbt mit einem Kaninchen-Anti-PAX2 Antikörper, der spezifisch für Nephron Vorläuferzellen (rot) und eine sekundäre Alexa Fluor 568 konjugierten Esel-anti-Rabbit. Hinweis blauen Kerne gegengefärbt mit DAPI. (C) 40X Phasenkontrast Blick auf eine Gruppe von Nephron Vorläuferzellen (zentriert) nach 24 Stunden in Kultur. (D) 40X Bild NZCs von LacZ + Embryonen von Foxd1 ^LacZ-Stamm, der β-Galactosidase exprimiert unter der Kontrolle des Foxd1 Promotor. Foxd1 isoliert ist in den Stromazellen Bevölkerung innerhalb der nephrogenen Zone des sich entwickelnden Niere exprimiert. Die Zellen wurden mit dem F-Aktin-Marker Phalloidin (Oregon green primäre Konjugat), der Kernfärbung DAPI (blau) und Kaninchen-anti-β-Galaktosidase gefärbt (sekundäre - Alexa Fluor Esel-anti-Rabbit 568) für den Nachweis von Foxd1 + Stromazellen ( rot).

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem nephrogenen Zone der embryonalen Niere. Es ist die Entwicklung einer Methode zunächst als Teil einer Studie über die Auswirkungen der BMP7 Behandlung auf Zellen des nephrogenen Zone (Blank et al., 2009) veröffentlicht. In der ersten Studie wurden eine Reihe von Experimenten, die Zelltypen innerhalb der NZC Bevölkerung vertreten charakterisieren durchgeführt. Kurz gesagt, Reinigung von NZCs aus genetischen Reporter für die kortikalen Stroma (Foxd1 ^{+ / lacZ)} (. Hatini et al, 1996), Sammelrohr (Hoxb7 ^{+ / cre;} R26 ^rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), und die Kappe Mesenchym (BMP7 ^{+ / lacZ)} (Godin et al., 1998) ergab, dass ca. 35% der geernteten NZCs kortikalen Stroma, sind 52% cap Mesenchym und das Sammelrohr Verunreinigung weniger als 0,04%. Lineage Kennzeichnung Experimente mit dem BMP7 ^{+ / cre;} R26 ^rEYFP Stamm (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) zeigte, dass etwa 10% der NZCs können Zellen der Kappe Mesenchym Linie, differenziert und haben BMP7 Ausdruck verloren . Machbarkeitsstudien mit 7AAD zeigten eine Überlebensrate in isolierten NZCs von ca. 95%. Vor kurzem haben wir den Erfolg bei der Trennung Zellsubpopulationen innerhalb NZCs durch durchflusszytometrische Sortierung erlebt. Jedoch hat der Mangel an Membran-assoziierte Marker spezifisch für jede der Subpopulationen der nephrogenen Zone dieser Analysen begrenzt und derzeit nur Zellen aus Mäusen, die fluoreszierende Marker-Gene abgeleitet ist machbar.

Die Wirksamkeit dieses Protokolls hängt stark von der Geschwindigkeit in der Anatomie Schritt. Sowohl das Überleben der Zelle und die Anpassungsfähigkeit an growth factor Stimulation zu erhöhen, wenn die Nieren in HBSS bleiben für kürzere Zeiträume vor dem enzymatischen Abbau. Eine kürzere Vorbereitungszeit ergibt sich somit sowohl in höheren Lebensfähigkeit der Zellen und eine robustere Antwort. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, beim Entfernen des Überstandes nach dem Schleudern der Zellsuspension als das Zellpellet leicht gestört ist was zu erheblichen Zellverlust sein.

Seit der ersten Arbeit von Clifford Grobstein beschreiben embryonalen Organkultur (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), hat die Niere ein Modellsystem für Organogenese und die Interaktion zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen in Entwicklung. Aktuelle microanatomic Genexpression Studien haben eine unerwartete Komplexität von Zelltypen innerhalb jeder dieser zellulären Kompartimenten (Brunskill et al., 2008) offenbart, und komplementären Methoden wie NZC Kultur sind erforderlich, um die Wechselbeziehung zwischen diesen Zellen während Nephrogenese verstehen. Das ultimative Ziel unserer primären Zelle Untersuchungen ist es, Bedingungen, unter denen nephrogenen Zone Zellen auf unbestimmte Zeit in vitro sowohl für Studien Nephrogenese und Transplantation bei Erwachsenen kann erweitert werden zu definieren. Die NZC Kultur ist ein wichtiger Schritt auf dieses Ziel hin, und der laufenden Untersuchungen in unserem Labor Ziel, die Mechanismen der Wachstumskontrolle in diesen Zellen zu definieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575