Biology

Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen

Published: August 22, 2007 doi: 10.3791/261

Joseph Harris¹, Hyuna Lee¹, Behrad Vahidi¹, Christina Tu², David Cribbs³, Noo Li Jeon¹, Carl Cotman³

¹Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine (UCI), ²Stem Cell Research Center, University of California, Irvine (UCI), ³Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine (UCI)

Summary

In deze video laten we zien de techniek van zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS), dat we gebruiken om een microfluïdische apparaat voor het kweken van neuronen farbricate.

Abstract

In deze video, tonen we de techniek van zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS), dat we gebruiken om een microfluïdische apparaat voor het kweken van neuronen fabriceren. Voorheen werd een silicium wafer patroon met het ontwerp voor het neuron microfluïdische apparaat met behulp van SU-8 en fotolithografie aan een meester mal te maken, of wat we gewoon naar verwijzen als een "master". Vervolgens gaan we gieten het silicium polymeer PDMS op de top van de meester, die vervolgens wordt genezen door het verwarmen van de PDMS tot 80 ° C gedurende 1 uur. De PDMS vormt een negatieve mal van het apparaat. De PDMS wordt vervolgens zorgvuldig knippen en tilde uit de buurt van de meester. Gaten worden geponst waar de reservoirs zal zijn en de overtollige PDMS geknipt uit de buurt van het apparaat. Stikstof wordt gebruikt om de klap weg overtollige vuil uit het apparaat. Op dit punt de apparaten zijn nu klaar voor gebruik en kan zowel gebonden aan Corning nummer 1 te dekken glas met een plasma sterilisator / reiniger of kan reversibel worden gebonden aan de dekking van glas door simpelweg plaatsen van het apparaat op de top van het deksel glas. De omkeerbare binding van het apparaat om glas is bedekt met een aparte video-en vereist in de eerste dat het apparaat of worden gesteriliseerd met 70% ethanol of door autoclaveren. Plasma behandelen steriliseert de apparaten zodat er geen verdere behandeling nodig is. Het is echter belangrijk, wanneer de apparaten toe te voegen vloeistof aan op de apparaten binnen 10 minuten van de plasma-behandeling, terwijl het oppervlak nog hydrofiel plasma-behandeling. Wacht langer dan 10 minuten om vloeistof toe te voegen aan het toestel maakt het moeilijk voor de vloeistof om het apparaat in te voeren. Het neuron apparaten zijn meestal plasma gebonden aan glas en 0,5 mg / ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8,5 boraatbuffer cover is meteen toegevoegd aan het apparaat. Na een minimum van 3 uur incubatie met PLL, zijn de apparaten gewassen met water dH2O een minimum van drie keer met ten minste 15 minuten tussen elke wasbeurt. Vervolgens wordt het water verwijderd en vers medium wordt toegevoegd aan het apparaat. Op dit punt van het apparaat is klaar voor gebruik. Het is belangrijk om te onthouden op dit punt om nooit alle media te verwijderen uit het apparaat. Laat altijd media in het hoofdkanaal.

Protocol

Deel 1: Het voorbereiden van de microfluïdische neuron apparaat

Een 3 "silicium wafer met een patroon gemaakt van SU-8 door fotolithografie wordt gebruikt om de Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische mal gegoten. We verwijzen naar de SU-8 patronen silicium wafer als meester mallen, of" meesters ".
PDMS wordt gemengd met verharder in de aw / w-verhouding van 10:1, dat wil zeggen, voor 10 gram PDMS, is 1 gram verharder toegevoegd.
Het PDMS is vervolgens goed gemengd en uitgegoten op het silicium wafer. De silicium wafer is vervat in een 10 cm polystyreen petrischaal. Het duurt ongeveer 12 g tot 15 g van PDMS aan de master te bedekken met een dikte van ongeveer 4 mm.
De meester met het PDMS wordt dan geplaatst in een vacuüm exsiccator met het deksel van de petrischaal, en vacuüm wordt toegepast. Dit wordt gedaan om te helpen luchtbellen te verwijderen uit de PDMS die werden geïntroduceerd tijdens het roeren in de verharder. Het duurt ongeveer 15 minuten voor de luchtbellen worden verwijderd.
De master met PDMS wordt verwijderd uit de exsiccator. Een lucht pistool met een 0,45 um filter wordt gebruikt om de resterende luchtbellen te verwijderen.
De master wordt dan geplaatst op een 80 ° C hete plaat gedurende 1 uur om uit te harden.

Opmerking: Als een vacuüm exsiccator niet beschikbaar is, de meester kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. De luchtbellen zullen uiteindelijk verdwijnen op hun eigen. Als een hete plaat is niet beschikbaar is, zal het PDMS uitharden bij kamertemperatuur na 24 uur.

Opmerking: Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de master-niveau is tijdens het uithardingsproces.

Deel 2: Knip uit het neuron microfluïdische apparaat

Zodra de PDMS is uitgehard op de master, is het naar een schoon kap.
Met behulp van een chirurgisch mes, is een cirkel gesneden rond de omtrek van de apparaten. Wanneer men voegt het blad in het PDMS, is het belangrijk om contact te maken met de silicium wafer, maar om niet te veel druk op de wafer, anders wordt de meester zal barsten.
Met een cirkel knippen helemaal rond de apparaten (er zijn 4 apparaten per elke 3 "Silicon Master), is het PDMS voorzichtig getild de meester. Dit kan worden gestart door voorzichtig te draaien de chirurgische mes zoals het is ingevoegd in de voorafgaande cut .
Vervolgens worden reservoirs gestanst in het apparaat met behulp van een 8 mm weefsel biopsie punch.
De apparaten worden dan in vieren en het teveel PDMS getrimd weg, zodat het toestel netjes past op Corning Glass Cover (nr. 1) 24 mm x 40 mm. Stikstof lucht wordt gebruikt om de klap weg overtollige vuil. Hardnekkige vuil kan ook worden verwijderd met 3M Scotch Brand 471 vinyl tape.

Deel 3: Plasma hechting de apparaten om glas dekglaasjes.

Plasma Cleaner wordt gebruikt om de band A Harrick het neuron apparaten aan op de dekglaasjes. Kortom, zijn de apparaten geplaatst in het plasma schoner en een vacuümpomp wordt gebruikt om de lucht te evacueren uit de kamer.
Nadat de vacuümdruk heeft bereikt 300 millitorr, is macht ingeschakeld om de elektrische spoel en ingesteld op hoog.
De elektrische spoel creëert plasma, "een gedeeltelijk geïoniseerd gas dat bestaat uit elektronen, ionen en neutrale atomen of moleculen" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , uit de resterende luchtmoleculen links in de kamer. De plasma creëert reactieve stoffen op het oppervlak van het glas en het apparaat, dat wanneer ze samen geplaatst zal een blijvende band te vormen. De plasma wordt ook het oppervlak hydrofiel, die helpt vergemakkelijken de toevoeging van vloeistoffen. Daarnaast is de plasma reiniger steriliseert de apparaten.

Het oppervlak van de PDMS apparaat dat de microfluïdische apparaat bevat is geplaatst zijde naar boven in het plasma reiniger, samen met het glas dia's.

De plasma behandelde oppervlakken van het glas en microfluïdische apparaat worden gemonteerd in contact met elkaar op een schone bench, dan geplaatst in steriele 60 mm gerechten. De behandelde oppervlakken vormen een hechte band onomkeerbaar.
Binnen 10 minuten van plasma hechten van de apparaten op glas, is Poly-L-lysine (PLL) toegevoegd aan het apparaat. Na 10 minuten zal de hydrofiliciteit van het toestel afnemen waardoor het moeilijk is voor de PLL om het apparaat in te voeren.

Opmerking: Het is belangrijk om voor de luchtbellen in het apparaat te controleren na de toevoeging van de PLL. Luchtbellen in het hoofdkanaal zijn ongewenst, omdat ze zouden oxideren cellen. Een eenvoudige methode om bestaande luchtbellen te verwijderen is het gebruik van een P200 pipet gevuld met 150 ul van de vloeistof (in dit geval PLL), direct plaats de tip bij de opening van de belangrijkste kanaal, en krachtig druk de P200. Dit moet mogelijk worden meerdere malen herhaald, maar uiteindelijk de kracht van de pipet rijdt de luchtbellen uit.
De apparaten met PLL mogen 's nachts in een standaard weefselkweek incubator geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO _2.
De volgende dag, de deondeugden zijn tweemaal snel gespoeld met geautoclaveerd dH2O. Tijdens dit proces wordt vloeibare nooit helemaal verwijderd van de belangrijkste kanalen, alleen van de reservoirs. Het verwijderen van vloeistof uit de belangrijkste kanalen zal introduceren bubbels. Na twee snelle spoelingen, zijn de apparaten gevuld met geautoclaveerd dH2O en terug geplaatst in de incubator voor een minimum van 3 uur, of 's nachts.
De volgende dag, zijn de apparaten opnieuw twee keer snel gespoeld met geautoclaveerd dH2O. Vervolgens wordt neurale basale media, met de nodige aanvullingen B27 en Glutamax voor het kweken van primaire rat neuronen, toegevoegd aan de apparaten. De apparaten zijn terug geplaatst in de incubator voor toekomstig gebruik. De apparaten zijn nu klaar voor het zaaien van neuronen.

Discussion

In deze video hebben we laten zien hoe te maken en voor te bereiden een PDMS microfluïdische apparaat dat we gebruiken om de cultuur neuronen inch Het apparaat stelt ons in staat om het verkrijgen van een zuivere axonale fractie van elkaar gescheiden door microgroeven van het compartiment met daarin een mix van cellichamen, dendrieten en axonen . Deze toestellen kan de onderzoeker om de effecten van verschillende behandelingen studie en als een platform voor het uitvoeren van lichamelijk letsel op de axonen en kijk welke effecten deze behandelingen hebben op de neuronen te bieden. Het toestel biedt ook een niveau van om het kweken van neuronen die helpt te vergemakkelijken transport studies. Daarnaast heeft de microgroeven, die de celkweek compartiment gescheiden van de axon compartiment, zorgt voor vloeibare isolatie tussen de twee compartimenten waardoor het mogelijk is aan een kant van het toestel te behandelen zonder het uitvoeren van de andere kant van het apparaat direct met de behandeling. Deze eigenschap maakt het mogelijk de onderzoeker te bestuderen effecten zoals signaaltransductie en het vervoer als gevolg van de behandeling.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
New Item

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).