Summary
एक तेजी से, की पीढ़ी के लिए सरल और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल दाता व्युत्पन्न सीएमवी अभिभाषक, या EBV संक्रमण के विकास के जोखिम में allogeneic hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) प्राप्तकर्ताओं के लिए जलसेक लिए multivirus विशिष्ट CTLs (rCTL). यह विनिर्माण प्रक्रिया जीएमपी अनुरूप है और टी सेल immunotherapy के विशेष केंद्रों से परे व्यापक कार्यान्वयन सुनिश्चित करना चाहिए.
Abstract
वायरल संक्रमण allogeneic hematopoietic स्टेम सेल (HSCT) के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में रुग्णता और मृत्यु दर के कारण. हम और दूसरों को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है और टी कोशिकाओं Epstein बर्र वायरस (EBV) cytomegalovirus (सीएमवी) और (Adv) Adenovirus monocytes और उपयोग के लिए विशिष्ट संचार EBV से बदल lymphoblastoid सेल (EBV से LCL) जीन एक adenovirus वेक्टर के साथ के रूप में संशोधित प्रतिजन कोशिकाओं (APCs). कुछ 2x10 5 किग्रा / trivirus विशेष साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) जलसेक के बाद कई लॉग द्वारा proliferated है और रोकने के लिए और अन्य उपलब्ध उपचार के लिए प्रतिरोधी भी गंभीर वायरल रोग का इलाज दिखाई . तैयारी के लिए यह उत्साहजनक दृष्टिकोण के व्यापक कार्यान्वयन उच्च उत्पादन लागत, निर्माण की जटिलता और लंबे समय (कुल 10-14 सप्ताह EBV से LCL पीढ़ी है, और सीटीएल निर्माण के लिए 4-8 सप्ताह के लिए 4-6 सप्ताह) के द्वारा सीमित है. इन सीमाओं को पार करने के लिए हम एक नया, जीएमपी अनुरूप सीटीएल उत्पादन प्रोटोकॉल विकसित किया है. सबसे पहले, टी कोशिकाओं हम वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCS) प्रतिजन के रूप में पेश डीएनए plasmids एन्कोडिंग LMP2 EBNA1 और BZLF1 (EBV), Hexon और Penton (Adv), और pp65 और IE1 (सीएमवी) के साथ nucleofected उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए adenovectors की जगह कोशिकाओं. ये APCs टी कोशिकाओं सभी उत्तेजक प्रतिजनों के लिए विशिष्ट पुन: सक्रिय. दूसरा, संस्कृति की उपस्थिति आईएल-4 में टी कोशिकाओं को सक्रिय (1,000 यू / मिली) और आईएल 7 (10ng/ml) बढ़ जाती है और हमारे लाइनों में प्रदर्शनों की सूची और विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति को बनाए. तीसरा, हम एक नया, गैस पारगम्य संस्कृति (जी Rex) युक्ति है कि एक एकल उत्तेजना के बाद और बड़े सेल नंबर के विस्तार के अस्तित्व को बढ़ावा देता है, इस प्रकार EBV से LCLS के लिए आवश्यकता को हटाने और तकनीशियन हस्तक्षेप को कम करने का इस्तेमाल किया है. इन परिवर्तनों को लागू करने से अब हम multispecific सीटीएल 10 6 कोशिकाओं है कि> 90% से कम है प्रति एक कीमत पर EBV, सीएमवी, और अभिभाषक लक्ष्यीकरण का उत्पादन कर सकते हैं और सिर्फ 10 के बजाय दिन 10 हफ्तों के एक दृष्टिकोण है कि अतिरिक्त तक बढ़ाया जा सकता का उपयोग सुरक्षात्मक वायरल प्रतिजनों. हमारे एफडीए को मंजूरी दी दृष्टिकोण उच्च जोखिम allogeneic HSCT प्राप्तकर्ताओं के लिए रोगनिरोधी और उपचार अनुप्रयोगों के लिए मूल्य का होना चाहिए.
Protocol
1. डीसी nucleofection
- हार्वेस्ट monocyte व्युत्पन्न DCs, जो प्लास्टिक पालन, 5 दिनों के लिए सेल Genix IL4 (1000U/ml) के साथ पूरक मीडिया, GMCSF (800IU/ml) और आगे डीसी परिपक्वता IL4 (1000U साइटोकिन्स का उपयोग 24hrs के लिए परिपक्व का उपयोग सुसंस्कृत का उपयोग समृद्ध किया गया है /) मिलीलीटर (800IU/ml) GMCSF, IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, 10ng/ml IL1-β और PGE2 (1μg/ml) 1 3ml हस्तांतरण विंदुक के साथ कोमल resuspension द्वारा, .
- व्यवहार्य DCs trypan नीले, 3x 15ml ट्यूबों में कोई कम 0.5x10 से अधिक 6 के साथ हस्तांतरण और अधिक नहीं 2x10 की तुलना में 6 कोशिकाओं / ट्यूब का उपयोग कर की गणना.
- 10mins @ 200g के लिए DCs अपकेंद्रित्र. एक ऊतक 12 ° C / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर 37 में अच्छी तरह से थाली इलाज संस्कृति के तीन कुओं में 2ml/well - इस समय के दौरान पूर्व गर्म सेल Genix मीडिया डीसी परिपक्वता साइटोकिन्स (डीसी परिपक्वता मीडिया) के साथ पूरक .
- एक बार कोशिकाओं कताई समाप्त कर दिया है, aspirate सतह पर तैरनेवाला और ट्यूबों के प्रत्येक के लिए 5μg डीएनए / ट्यूब के एक अंतिम एकाग्रता में प्रासंगिक डीएनए plasmids जोड़ने. इस मामले में प्लाज्मिड एन्कोडिंग ट्यूब IE1 - pp65 # 1, ट्यूब को Hexon - Penton # 2, और # 3 ट्यूब को EBNA1 LMP2 - BZLF1 जोड़ें.
- Resuspend DCs और Amaxa nucloefection समाधान के 100μl के साथ डीएनए, मिश्रण अच्छी तरह से और nucleofection cuvettes करने के लिए स्थानांतरण.
- 4D nucleofector में रखें cuvettes, CB150 कार्यक्रम (/ Amaxa Lonza) का चयन, और प्रेस शुरू.
- तुरंत बाद nucleofection 2ml पूर्व गर्म सेल Genix डीसी क्युवेट करने के लिए परिपक्वता मीडिया के 500μl जोड़ने के लिए, ऊपर और नीचे pipetting 2-3 बार, और हस्तांतरण nucleofected DCs 12 अच्छी तरह से तैयार प्लेट prewarmed के शेष 1.5 मिलीलीटर युक्त द्वारा धीरे मिश्रण डीसी परिपक्वता मीडिया. 37 के लिए स्थानांतरण ° सी / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के लिए एक और आगे 12-18hrs.
2. टी सेल उत्तेजना
- हार्वेस्ट और nucleofected DCs गिनती, और 30Gy पर चमकाना. सीटीएल माध्यम के 10ml (45% RPMI, 45% क्लिकों EHAA, 10% FBS, 2mm Glutamax) और resuspend @ 3 x 10 सीटीएल मीडिया के मिलीलीटर प्रति 5 DCs के साथ एक बार धोएं .
- पूल 7.5x10 (2.5ml) 5 और 5 प्रत्येक plasmids के DCs युक्त (5ml) 15x10 की एक अधिकतम की एक न्यूनतम और जी Rex डिवाइस जो तब इनक्यूबेटर में रखा जाएगा करने के लिए जमा DCs हस्तांतरण.
- प्रत्युत्तर कोशिकाओं की तैयारी के लिए या तो पहले से जमे हुए PBMCs या गैर पक्षपाती mononuclear कोशिकाओं है कि डीसी चयन (पालन या चयन CD14) रहने के बाद का उपयोग करें. कोशिकाओं को पहले गला लें, prewarmed संस्कृति के माध्यम से हस्तांतरण, सीटीएल मीडिया के साथ एक बार धो लो. Resuspend सीटीएल मीडिया में कोशिकाओं, कोशिकाओं की गिनती और मिलीलीटर प्रति 6 2x10 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए उन्हें लाने. 15x10 6 कक्षों या 7.5ml और पूरक और 300ng IL7 (10ng/ml - अंतिम सान्द्र.) - 30000U (अंतिम सान्द्र 1000U/ml) IL4 के साथ ले लो .
- जी रेक्स और 30ml के एक कुल मात्रा के लिए सीटीएल मीडिया के साथ bioreactor ऊपर की 7.5ml PBMC (15x10 6 कोशिकाओं) स्थानांतरण.
- संस्कृति एक 37 में 6-7 दिनों के लिए जी - रेक्स ° / 5 सी% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर .
3. टी सेल विस्तार
- 6-7 दिन में, मीडिया की aspirate 10ml, तो एक 10ml विंदुक के साथ मीडिया के 20ml शेष में कोशिकाओं और मिश्रण trypan नीला का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती. अगर वहाँ रहे हैं 50x10 <6 ताजा + मीडिया साइटोकिन्स के साथ फिर से भरना . यदि 50x10> 6 कोशिकाओं सेल निलंबन के 10ml हटाने के लिए, एक नया जी - रेक्स हस्तांतरण, और तब ताजा सीटीएल + मीडिया साइटोकिन्स के साथ दोनों जी - Rexs फ़ीड.
- एक अतिरिक्त 4-6 दिनों के लिए संस्कृति. एक बार पर्याप्त कोशिकाओं का विस्तार किया गया है, भविष्य में उपयोग के लिए सीटीएल और cryopreserve अधिक प्ररूपी और कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रदर्शन.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
हमारे एफडीए को मंजूरी दी multivirus विशेष सीटीएल पीढ़ी की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है 2 सम्मेलन multivirus सीटीएल प्रोटोकॉल जो adenovectors और EBV से LCL उपयोग करने के लिए वायरस प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इसके विपरीत हम डीएनए plasmids के साथ संक्रामक वायरस सामग्री की जगह है. 3 वायरस के प्रत्येक से व्युत्पन्न कई प्रतिजनों सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि. Trivirus सीटीएल को प्रोत्साहित करने के लिए हम तीन multicistronic plasmids एन्कोडिंग Hexon और Penton adenovirus के IE1 और सीएमवी pp65, और EBNA1 LMP2, और EBV के BZLF1 बनाया. इन प्रतिजनों अपने स्वयं के और अन्य समूहों दिखा रहा है कि टी कोशिकाओं Adv - hexon और penton 2,4-6 के खिलाफ निर्देशित है, और सीएमवी-1E1 और सीएमवी pp65 7 vivo में सुरक्षात्मक के नैदानिक परिणाम उत्साहजनक के आधार पर चुने गए हैं. EBV के लिए, EBNA1 एक immunodominant सीडी 4 + टी सेल लक्ष्य प्रतिजन सभी EBV जुड़े दुर्दमताओं में और सामान्य EBV से संक्रमित बी कोशिकाओं में व्यक्त की है 8,9, LMP2 एकाधिक एचएलए प्रकार भर में immunogenic है और सबसे EBV दुर्दमताओं में व्यक्त की, 10,11 BZLF1 जबकि एक immunodominant, तत्काल जल्दी lytic चक्र प्रतिजन है कि सबसे अधिक व्यक्तियों से दोनों सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं को उत्तेजित करता है और सह के लिए की संभावना महत्वपूर्ण है encodes12 वायरस नकल की कोशिकाओं के ntrol. आगे हमारे विनिर्माण विधियों का अनुकूलन करने के लिए हम जो सीटीएल 13,14 उत्तेजना के लिए minimalized, एंटीबायोटिक मुक्त plasmids (एफडीए अनुरूप) उत्पन्न प्रकृति प्रौद्योगिकी के साथ सहयोग किया है. इस रणनीति का प्रयोग हम लगातार> 35% के nucleofection क्षमता को प्राप्त (नहीं दिखाया डेटा है) जबकि उच्च सेल व्यवहार्यता बनाए रखने 3. चित्रा 2 से पता चलता है कि अनुकूलित डीएनए के रूप में IFNγ ELIspot द्वारा मापा plasmids के जवाब में वायरस विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति, अधिक से अधिक था की तुलना में पारंपरिक pShuttle आधारित अभिव्यक्ति (n = 8 Adenovirus, n = 4 सीएमवी, और n = 2 EBV) एक ही प्रतिजनों व्यक्त plasmids के जवाब में. डीसी के इष्टतम अनुपात: आर अनुपात (n = 2 दाताओं): PBMC शक्तिशाली टी सेल उत्तेजना के रूप में चित्रा 3 में जहां 1:50 का अनुपात 1:20 एस की तुलना में उप इष्टतम सक्रियण उत्पादित दिखाया गया है के लिए महत्वपूर्ण था. व्यापक प्रतिजन विशिष्टता के साथ पर्याप्त सीटीएल संख्या का उत्पादन सभी तीन वायरस के खिलाफ चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए एक पूर्व अपेक्षित है. यह जी रेक्स, जो पारंपरिक 24 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा -4 ए) 15 के साथ तुलना में बेहतर टी सेल के विस्तार का समर्थन करता है में सीटीएल संस्कृति द्वारा हासिल की है, जबकि IL4 और IL7 की संस्कृतियों बढ़ जाती है के अलावा प्रदर्शनों की सूची और विशिष्टता के रूप 4B चित्र में दिखाया गया जहां सीएमवी - pp65 व्युत्पन्न एचएलए-A2 के खिलाफ प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की आवृत्ति resticted NLV पेप्टाइड IL4 और / या 16,17 IL7 की उपस्थिति या अनुपस्थिति में उत्पन्न संस्कृतियों में मूल्यांकन किया गया था . हम प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन विस्तार कोशिकाओं, intracellular cytokine / धुंधला IFNγ ELIspot cryopreservation / जलसेक के लिए अंतिम उत्पाद पर और सीआर 51 रिलीज assays के phenotype और कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए. आमतौर पर सीडी 4 + और दोनों टी सेल के डिब्बों में detectable प्रतिजन विशिष्टता के साथ CD8 + टी कोशिकाओं की एक मिश्रित आबादी के साथ उत्पन्न कोशिकाओं पॉलीक्लोनल हैं. सीटीएल वायरल प्रतिजन व्यक्त लक्ष्य कोशिकाओं को मारने, लेकिन संकेत है कि वे (चित्रा 5) vivo में भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GvHD) प्रेरित नहीं चाहिए वायरस नकारात्मक आंशिक रूप से एचएलए मिलान लक्ष्य नहीं कर रहे हैं.
चित्रा 1 rCTL पीढ़ी प्रोटोकॉल. सबसे पहले, DCs वायरल प्रतिजन एन्कोडिंग plasmids के साथ nucleofected हैं और फिर एक आर पर ऑटोलॉगस PBMCs के साथ मिश्रित: 10 या 20:01 के एस. कक्ष IL4 और IL7 की उपस्थिति में 10-14 दिन तो काटा, गिना, समारोह की पहचान, और बाँझपन के लिए परीक्षण किया, और फिर नैदानिक इस्तेमाल के लिए cryopreserved के लिए जी Rex में विस्तार कर रहे हैं.
चित्रा 2. अनुकूलित डीएनए plasmids इन विट्रो में बेहतर टी सेल सक्रियण प्रेरित. DCs अनुकूलित किया है, एफडीए अनुरूप plasmids एन्कोडिंग Hexon और Penton (Adv), IE1 और pp65 (सीएमवी), और EBNA1, LMP2, और BZLF1 (EBV) या पारंपरिक pShuttle एक ही प्रतिजनों एन्कोडिंग plasmids के साथ nucleofected थे. ये टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया और विशिष्टता IFNγ ELIspot 10 दिनों के बाद उत्तेजना से विश्लेषण किया गया था.
चित्रा 3 इष्टतम डीसी: सीटीएल सक्रियण के लिए टी सेल अनुपात. 2 दाताओं से DCs सभी तीन अनुकूलित plasmids के साथ nucleofected थे और फिर 1:20 या 1:50 डीसी ऑटोलॉगस PBMCs को प्रोत्साहित किया: PBMC अनुपात. पुनः सक्रिय टी कोशिकाओं की आवृत्ति IFNγ ELIspot द्वारा 10 दिन पर मूल्यांकन किया गया था.
चित्रा 4 टी जी Rex में सेल विस्तार बढ़ाने साइटोकिन्स का उपयोग . कक्ष एक जी Rex के रूप में अच्छी तरह के रूप में गैस पारगम्य झिल्ली, माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन पर सीटीएल उपस्थिति डिवाइस से पता चलता है. सेल प्लेटों जी Rex बनाम इलाज सम्मेलन ऊतक संस्कृति में हासिल उत्पादन के बीच एक तुलना भी दिखाया गया है. पैनल बी सीएमवी pentamer सकारात्मक सीटीएल कोई साइटोकाइन, IL4 अकेले अकेले IL7 और IL4 + IL7 की उपस्थिति में विस्तार संस्कृतियों में हासिल की आवृत्ति से पता चलता है.
चित्रा 5. Phenotype और विस्तार सीटीएल के समारोह. और CD8 + - कक्ष एक विस्तारित multivirus सीटीएल, जो सीडी 4 + (सहायक 45%) का एक मिश्रण के साथ पॉलीक्लोनल हैं phenotype के एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है (42% - साइटोटोक्सिक) टी कोशिकाओं, जिनमें से बहुमत (95 %) स्मृति मार्कर CD45RO + / CD62L पैनल + बी से पता चलता है कि इन कोशिकाओं सभी उत्तेजक प्रतिजनों के लिए विशिष्ट हैं और polyfunctional कर रहे हैं के रूप में intracellular साइटोकाइन धुंधला द्वारा मूल्यांकन IFNΓ के उत्पादन और प्रतिजन उत्तेजना के बाद TNFα का पता लगाने पैनल सी से पता चलता है कि विस्तार सीटीएल मापा के रूप में कार्य कर रहे हैं. सीआर 51 परख के द्वारा . ऑटोलॉगस LCL, या तो अकेले या एक अशक्त वेक्टर या एक adenoviral वेक्टर सीएमवी - pp65 व्यक्त के साथ transduced राल के रूप में इस्तेमाल किया गयाहो जाता है. Alloreactivity एक लक्ष्य के रूप में allogeneic पीएचए विस्फोटों का उपयोग मूल्यांकन किया गया था.
Discussion
वायरल संक्रमण पर्याप्त और रोगियों को जो उनके रोग या उसके उपचार द्वारा immunocompromised कर रहे हैं में रुग्णता और मृत्यु दर के लिए खाते. HSCT के बाद, उदाहरण के लिए, जैसे EBV और सीएमवी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से श्वसन syncytial वायरस (RSV) के रूप में श्वसन वायरस के द्वारा लगातार herpesviruses की वजह से संक्रमण, ठीक है, जाना जाता है, जबकि अभिभाषक, बीके वायरस की वजह से संक्रमण के महत्व है, और मानव herpesvirus (HHV) -6 और अधिक हाल ही में सराहना किया गया है. जबकि औषधीय एजेंटों कुछ संक्रमण के लिए मानक चिकित्सा कर रहे हैं वे पर्याप्त toxicities है, प्रतिरोधी वेरिएंट उत्पन्न है, और अक्सर अप्रभावी कर रहे हैं. इसके विपरीत, वायरस विशेष टी कोशिकाओं को स्टेम सेल दाताओं से प्राप्त hemopoietic स्टेम सेल प्रत्यारोपण में वायरल संक्रमण या रोग (HSCT) 2,5,6,18-21 सेटिंग की रोकथाम और उपचार के लिए सुरक्षित और प्रभावी सिद्ध कर दिया है . हालांकि, टी सेल immunotherapy की व्यापक कार्यान्वयन अंततः लागत और जटिलता, और समय सीटीएल के उत्पादन के लिए आवश्यक के द्वारा सीमित है.
हमारी उपन्यास और तेजी से दृष्टिकोण multivirus सीटीएल, वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित है, उत्पन्न काफी वायरल रोगों के लिए साइटोटोक्सिक टी सेल थेरेपी की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए, रणनीति immunocompromised की मेजबानी के लिए देखभाल के एक मानक बन सक्षम होना चाहिए. APCs के रूप में प्लाज्मिड nucleofected DCs के प्रयोग दोनों MHC वर्ग मैं और द्वितीय को प्रतिजन प्रस्तुति वायरल या वैक्टर वास्तव में एक एकल कोशिका के भीतर व्यक्त किया जा रहा है के बाद से अलग डीसी आबादी के लिए प्रत्येक प्लाज्मिड 3 का उपयोग कर रहे हैं कई वायरल प्रतिजनों से से प्रतिस्पर्धा के बिना सक्षम बनाता है. / आईएल 4 7 बढ़ जाती है टी सेल अस्तित्व और प्रसार, जो तदनुसार आवृत्ति और प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का जवाब 16,17 प्रदर्शनों की सूची को बढ़ाने में मदद करता है का उपयोग करें. अंत में, जी Rex संस्कृति में नाटकीय रूप से संस्कृति के दौरान टी सेल apoptosis को कम कर देता है. गैस मुद्रा (2 हे और सीओ 2 के बाहर) एक गैस पारगम्य सिलिकॉन झिल्ली भर फ्लास्क के आधार पर होता है, जबकि कक्षों के ऊपर एक मध्यम की अधिक गहराई की अनुमति hypoxia रोकने, अधिक पोषक तत्वों प्रदान और अपशिष्ट उत्पादों गिराए. यह मंच भी जब सुरक्षात्मक प्रतिजनों की पहचान कर रहे हैं के रूप में अतिरिक्त वायरस के लिए बढ़ाया जा सकता है है.
Disclosures
जुआन एफ वेरा विल्सन वुल्फ विनिर्माण के लिए एक सलाहकार है. अन्य लेखकों कोई प्रासंगिक प्रकटीकरण है.
Acknowledgments
इस काम के सेलुलर (अनुबंध एनआईएच (एचबी-10-03)-NHLBI HHSN26820100000C) चिकित्सा (सी एम आर), सेल आधारित थेरेपी के लिए एक विशिष्ट केंद्र के लिए एक उत्पादन सहायता के द्वारा समर्थित है एनआईएच NHLBI अनुदान U54 HL081007 1 (सी एम आर), एक ASBMT युवा अन्वेषक पुरस्कार (यूजी और जेवी), क्लीनिकल रिसर्च अवार्ड (यूजी) में लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी विशेष फैलो, और एक एमी Strelzer Manasevit विद्वान पुरस्कार (एएमएल).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellGenix | CellGenix | 2005 | |
| IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
| IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
| Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
| Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
| Nucleofection Kit | Amaxa | V4XP-3012 | |
| Plasmids | NTC | n/a | |
| GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
| IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
| G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
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