Förbereda Undercut Modell av Posttraumatiskt Epileptogenesis hos gnagare

Summary

Delvis isolerad cortex ("bjuda") är en effektiv djurmodell av posttraumatiska epileptogenesis. Här visar vi hur man gör en ny kirurgisk enhet och använda den för att göra mer precisa och konsekventa skador för att generera denna modell.

Abstract

Delvis isolerad cortex ("bjuda") är en djurmodell av posttraumatiska epileptogenesis. Det kirurgiska ingreppet innebär att skära genom motoriska cortex och undersidan vit substans (underskred) så att en viss region i hjärnbarken till stor del är isolerad från den närliggande cortex och subkortikala regioner ^1-3. Efter en fördröjning på två eller flera veckor efter operationen, kan epileptiforma utsläpp dels vara införd i hjärnan skivor från gnagare ^1, och elektriska eller beteende anfall kan observeras in vivo från andra arter som katt och apa ^4-6. Detta väletablerad djurmodell är effektivt att generera och härmar flera viktiga egenskaper för traumatisk hjärnskada. Men det är utmanande tekniskt försöka göra exakta kortikala lesioner i små gnagare hjärnan med fria händer. Baserat på det förfarande som ursprungligen fastställts i Dr David Prins labb vid Stanford University ^1, här presenterar vi en förbättrad teknik för att utföra en operation för utarbetandet av denna modell hos möss och råttor. Vi visar hur man gör en enkel kirurgisk enhet och använda den för att få en bättre kontroll av skärande djup och vinkel för att generera mer precisa och konsekventa resultat. Enheten är enkel att göra, och förfarandet är snabb att lära sig. Den generationen av denna djurmodell ger ett effektivt system för studie om mekanismer posttraumatiska epileptogenesis.

Protocol

1. Göra en enkel anordning för underskred operation

1. Den underskred enhet vi skapat består av tre delar (Fig. 1): (1) en bärande platta av rostfritt stål eller plast som möjliggör anslutning av en vägledande rör och en nål, och sitter tvärs över kraniella fönstret under operationen, (2) en vägledande rör som har en nål i läge och tillstånd nål rotation, och (3) en nål som är böjd 90 grader på ~ 3 mm från spetsen och är lös i rotation och insättningen.
2. Klipp en bit 1-1,5 mm tjock, 7 ~ 10 x 30 mm rektangulära rostfritt stål eller genomskinlig plast (1) för att göra den stödjande plattan. Förbered en 1,5 tums 22-gauge (BD företag, # 305.156) och en 1,5 tums 25-gauge (BD företag, # 305.127) sprutnålen. För att göra en vägledande rör, skära av plasten slutet och den lägre nålspetsen av 22-gauge nålen så att dess totala längd är ca 31-32 mm (2). Sand metallen slut för att göra det plan och jämn. Den slutliga längden på denna vägledande röret bör vara ca 5-6 mm kortare än 25-gauge spruta nål.
3. Använd cyanoakrylat lim för att fixera vägledande röret på stödplåten, se till att nålen är vinkelrät mot kanten av metall.
4. Sätt in 25-gauge injektionsnålen i de vägledande röret och böj nålen 90 grader på 2,5-3 mm från spets (Fig. 1).
5. Justera den vertikala rörelse utbud av nålen genom limning ett litet plaströr på upp änden av nålen (Fig. 1, nål stopp). Den slutliga flytta utbudet av nålen bestämmer hur djupt nålen kan sättas in i hjärnbarken, och bör vara 1,6-1,8 mm för P21 råttor och 1,3-1,5 mm för P21 möss. Denna längd måste anpassas för olika arter och åldrar av djur.
6. Fäst en liten koppartråd eller en liten bit tejp på den övre delen av nålen i samma riktning som böjd spets (fig. 1 nål indikator). Den tråd eller tejp anger vridningsvinkel nålen under underskred kirurgi (Fig. 1).

2. Animal förberedelse

1. Alla kirurgiska instrument måste autoklaveras, steriliseras med ett glas-pärla autoklav, eller desinficeras med 70% etanol.
2. Vi använder Sprague / Dawley råttor vid postnatal ålder 20 - 22 dagar (P20-22) eller CD1 möss vid samma ålder. Olika stammar av möss eller råttor kan användas för specifika projekt.
3. Bedöva musen med en ip injektion av ketamin 80 mg / kg och xylazin 8 mg / kg. Det kirurgiska ingreppet påbörjas efter det att djuret inte reagerar på svansen nypa. Under operationen, om nödvändigt, den ursprungliga dosen av bedövningsmedel cocktail en boosterdos av en tredjedel kan ges för att återställa den ursprungliga narkos staten.
4. Klipp håret i hårbotten av djuret med ett elektriskt hår trimmer. Applicera en liten mängd oftalmologiska salva på ögonen på djuret för att skydda mot uttorkning under anestesi. Desinficera hårbotten med en 10% povidon-jodlösning, följt av 70% etanol.
5. Montera djuret på en stereotaxic apparat för att hålla huvudet i ett stabilt fast position. Under hela operationen, behåller vi djur på en värmedyna för att förebygga hypotermi.
6. Gör en mittlinjen främre-bakre snitt i hårbotten med hjälp av en skalpell, sträcker sig från Lambda till mellan ögonen. Använd peanger att dra huden åt sidan och avslöja vänster skallen tillräckligt.
7. Gör en rektangulär klippa på vänster skallen och använda skalpell för att skrapa bort periostet. Detta steg kommer att minska blödningen och underlätta borrning på skallen.

3. Göra underskär

1. Tillsätt en liten mängd steril koksaltlösning för att den exponerade skallen området och sedan använda flera Q-tips för att rena blod och torra området.
2. Enligt en kirurgisk mikroskop, börja borra en rektangulär spår (~ 5 x 7 mm på råttor, 4 x 5 mm i möss) på mitten av den vänstra skallen (ungefär ovanför vänster motoriska cortex). Tillämpa en droppe koksaltlösning på skallen underlättar borrning och avleder värme. Efter ungefär 2 / 3 djup ben är borrat, avlägsna överskott av saltlösning och rengör borrning området med en tops. Sakta och försiktigt borra djupare tills mitten benbit är lös vid ett lätt tryck på en tång.
3. Ta försiktigt bort den centrala delen av ben genom att sticka in en vass spets av en tång på kanten av benet och sakta lyfta pincett för att exponera den vänstra hjärnhalvan.
4. Enligt den kirurgiska mikroskop hålla underskred enheten och orientera nålen i en parasagittal riktning och de stödjande plattan vinkelrätt mot mittlinjen luta apparaten något caudally för att bibehålla visualisering av nålspetsen och målet kortikala region. Rikta nålspetsen till ett område 1-2 mm i sidled för att den överlägsna sagittala sutur, i mitten av kraniala fönstret och undvik direkt penetration av stora fartyg.
5. In nålen i horisontell riktning genom duran och under Pia så att skona blodkärl. Sitt ner på underskred enhetenspå båda kanterna av kraniala fönster så att nålen är placerad vinkelrätt mot kortikala ytan (Fig. 1). Vila enheten på båda kanterna av kraniella fönster för hand kommer att minska eller eliminera handen skakar under följande procedur. Lyft upp nålen till under Pia, sedan sakta sänka den för att skapa en transcortical klippa tills nålen inte kan gå djupare. Rotera ~ 135 ° från mittlinjen till att skapa en halv-cirkel vita substansen / djupa skikt VI underskred. Höj sedan nålen igen för att under Pia. Luta enheten bakåt och dra tillbaka nålen.
6. Alternativt kan man upprepa proceduren ovan (steg 2,5), men utan att vrida nålen för att skapa en ytterligare transcortical klippa vid sidokanter fönstret. Detta kommer att skapa en mer komplett kortikal isolering.
7. Lägg en bit plastfolie (6 x 6 mm) på kraniella fönster för skydd, och sutur hårbotten. Placera djuret på en uppvärmd platta tills återhämtat sig helt från narkos.

4. Representativa resultat:

Koronalt kortikala skivor kan vara beredd att bekräfta framgång underskred kirurgi. I skivor förberedda> 2 veckor efter operationen, transcortical och underskred nedskärningar är skönjas under lågt effekt målet om ett mikroskop (Fig. 2). Den delvis isolerade cortex blir oftast lite tunnare och epileptiform aktivitet kan upptäckas i majoriteten av kortikala skivor med fält potentiella inspelning (bild 3).

Däremot bildas stora hål i den vita substansen eller i djupa kortikala skikt, dramatisk förtunning av lesioned cortex, eller en vandrande klippa är över eller under vita substansen kommer att göra hjärnan oanvändbar för vidare experiment.

Figur 1. Struktur och tillämpning av en underskred enhet. En vägledande rör (2) är fastklistrad på en bärande platta (1) som är gjord av rostfritt stål eller transparent plast. En spruta nål (3) förs in genom vägledande röret och böjda i ~ 3 mm till spetsen. En nål stopp gjord av plast röret är limmade på den övre delen av nålen så att den vertikala rörelse utbud av nålen är begränsad till ~ 1,2 mm och ~ 1,5 mm för användning i P21 möss och råttor respektive. Ett segment av små koppartråd är fastsatt under handtaget när nålen indikator för orientering böjd nål. Observera att lutas och i kontakt med både kanten av kraniala fönstret så att en sänkning kan göras parallellt med pial ytan.

Figur 2. En representant bild av underskred skiva. A. Fluorescerande bild av en bit som var beredd två veckor efter underskred lesion i ett P48 råtta. Den skär sår var märkt med fluorescerande färg DII. De vita pilarna till höger visar transcortical klippa, och pilarna på undersidan visar underskred som passerade även om gränsen mellan skikt IV och vit substans.

Figur 3. Fält potentiella inspelning från en underskred slice. Fält potentiella inspelning från en underskred hjärnan bit ut epileptiform aktivitet, vilket tyder hyperexcitabilitet av de skadade kortikal vävnad.

Discussion

Den underskred modellen är ett mycket effektivt system för att studera posttraumatiska epileptogenesis. En typisk operation tar bara ungefär 20-30 minuter till slut, och framkallat eller spontana epileptiform aktivitet kan registreras i skivor från de flesta djur två veckor efter operationen ^1-2. Ännu viktigare, härmar denna modell aspekter av förändringar efter traumatisk hjärnskada såsom blödning, inflammation, ödem, axotomy och neuronal död ^7. Inte bara har epileptiform aktivitet observerats hos gnagare och andra djur, utan även epileptiska anfall har dokumenterats på människor som lider jämförbara kortikala lesioner ^8. Betydande framsteg har gjorts för att klarlägga de underliggande mekanismerna under senare år. Spontana och framkallade Interiktal epileptiform utsläpp har registrerats i hjärnan skivor> 2 veckor efter skada, och dessa aktiviteter konstaterades ha sitt ursprung hos råtta kortikala skikt V ^1. Bevis av krets omorganisation, förlust av GABAergic interneuronen och avhämning ökar i neuronala membran retbarhet, och ökar i excitatoriska synaptic kopplingen har också påvisats, särskilt i kortikala skikt V ^2,9-13.

Här har vi infört ett nytt instrument för att göra underskred lesioner. När man utför underskred kirurgi med fria händer, gör handen skakar ofta svårt att göra en stabil och exakt kortikala lesioner. Även om träning och erfarenhet kan förbättra kvaliteten på operation, finns betydande variation i djup och kvalitet lesioner. Enheten vi har infört här är till nytta i tre aspekter. Först genom att vila på kanterna av kranial fönstret, eliminerar enheten i stort sett problemet med handen skakar under operationen, vilket gör det möjligt att göra en smidig skär genom den känsliga hjärnvävnaden. För det andra kan djupet av nålen insättning och graden av rotation kontrolleras noggrant, vilket gör det möjligt att skära mer exakt och konsekvent i den vita substansen under lagret VI. För det tredje är ytan av hjärnbarken halvklotet böjda: den mediala är högre än den laterala sidan (bild 1), vilket kan orsaka saknas riktade vita roll om vinkeln inte nålen justeras därefter. Genom att vila enheten i kraniell fönstret, är nålen lutar i sidled, och skärvinkeln justeras automatiskt så att rotation av nålen är alltid parallell med ytan av hjärnbarken och exakt lesionen erhålls (Fig. 2). Ett potentiellt problem med att använda den här enheten är att det kan störa direkt visualisering av nålen under mikroskop. Detta problem kan lösas genom något att luta apparaten mot caudal riktning när tränga in pial och cortex. Så fort nålen sänks till den vita substansen, måste den enhet som ska justeras för att bli vinkelrät med kortikala ytan, och vilade på skallen. Vid denna punkt, tittar på nålen indikatorn är tillräckligt för att övervaka nål rotation. Sammanfattningsvis, med dessa flera fördelar och dess relativt lätt konstruktion, kommer underskred modellen blir mer tillgänglig och användbar för studiet av posttraumatiska epileptogenesis.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450