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Biology

Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

doi: 10.3791/305 Published: October 1, 2007

Summary

En este video se demuestra la preparación de neuronas de rata E18 cortical.

Abstract

En este video, se demuestra la preparación de las neuronas de ratas E18 cortical. E18 neuronas corticales de rata se obtienen de la corteza de ratas fetales E18 previamente disecados y preparados. La corteza es E18, la disección, de inmediato se disocian en las neuronas individuales. Es posible almacenar E18 corteza en Hibernate buffer E que contienen B27 a 4 ° C hasta una semana antes de la disociación se realiza. Sin embargo, habrá una disminución de la viabilidad celular. Normalmente obtenemos nuestro E18 corteza fresca. Se transporta al laboratorio en el hielo frío buffer de calcio libre disección de magnesio libre (CMFM). A su llegada, la tripsina se agrega a la corteza a una concentración final de 0,125%. La corteza se incuba a 37 ° C durante 8 minutos. DMEM con FBS al 10% se agrega a la corteza para detener la reacción. La corteza se centrifuga a 2500 rpm durante 2 minutos. Se elimina el sobrenadante y 2 ml de medio basal neural (NBM), que contiene 2% de B27 (vol / vol) y 0,25% Glutamax (vol / vol) se añade a la corteza que luego se volvió a suspender pipeteando arriba y hacia abajo. A continuación, la corteza se tritura con pipetas de vidrio previamente pulidas al fuego, cada uno con una pequeña apertura sucesiva. Después de trituración, la corteza es una vez más, se centrifuga a 2500 rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se retira la corteza y el pellet resuspendido en 2 ml de NBM que contienen B27 y Glutamax. La suspensión celular se hace pasar por un colador de 40 um celular nylon. A continuación las células se cuentan. Las neuronas están listos para cargar en el dispositivo de microfluidos neurona.

Protocol

Preparación de las neuronas de ratas fetales E18 cortical de compartimentación

Antes de salir, es importante para calentar todos los medios necesarios y los reactivos a 37 ° C.

También es importante esterilizar todo lo que se utiliza para la preparación de las células (por ejemplo, los bulbos de goma, bastidores de tubos, botellas de los medios de comunicación, etc), y lo que se coloca en la capilla, al lavarlo con etanol al 70%.

  1. Coloque dos trozos de corteza de rata fetal E18 (un cerebro, previamente disecados) en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de helado de calcio sin magnesio libre de tampón de disección.
  2. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA a la corteza en un tampón de disección, con lo que el volumen final de 2 ml y la concentración final de tripsina al 0,125%.
  3. Coloque el tubo de 15 ml en un baño de agua 37 º C durante 8 minutos.
  4. Durante este tiempo, el fuego de uñas 3 pipetas Pasteur de vidrio, formando aberturas cada vez más pequeños, en un gabinete de bioseguridad para ayudar a mantener la esterilidad.
  5. Después de la incubación de 8 minutos de la corteza, agregar 10 ml de DMEM con FBS al 10% de la corteza cerebral para ayudar a detener la reacción de la tripsina.
  6. Centrifugar el tubo de 15 ml que contiene la corteza y DMEM/10% FBS a 2500 rpm durante 2 minutos.
  7. En la cabina de bioseguridad, separar el sobrenadante de la corteza con una pipeta Pasteur de vidrio con aspiración al vacío adjunto. Tenga cuidado de no perturbar o desalojar el pellet.
  8. Añadir 1 ml de la NMB a la bolita corteza y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo. Es muy importante evitar la creación de burbujas de aire, mientras que pipeta hacia arriba y abajo, como las burbujas de aire pueden dañar las células de la oxidación.
  9. El uso del fuego pulido pipeta Pasteur con la más amplia apertura para triturar la corteza adjuntando una pera de goma estériles para el final y pipeta hacia arriba y abajo 5 veces, de nuevo teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Continuar este proceso con la pipetas de vidrio otros dos, cada uno con un tamaño de abertura menor.
  10. Después de la trituración, se centrifuga a las células de nuevo a 2500 rpm durante 2 minutos.
  11. Después de la centrifugación, una vez más, separar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 2 ml de NBM.
  12. Filtrar la solución de células resuspendidas a través de un colador de la célula 45 um.
  13. Tinción de las células con azul de tripano, se cuentan y se carga en los dispositivos. Por lo general carga de 20 ul de células por dispositivo.

Nota: la concentración final de células es típicamente entre 2,5 millones de células / ml y las células de 8 millones / ml

Carga de las células

Después que las células han sido contadas, es el momento de la carga de las células en el dispositivo:

  1. Lleve los dispositivos previamente preparados que contienen NBM en la cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad.
  2. Quite el exceso de los pozos de succión al vacío. Sin embargo, tenga cuidado para evitar la eliminación de todos los medios de comunicación - que debe haber algunos medios de comunicación en el canal principal.
  3. Aplicar 20 ul de células para el depósito superior izquierda del dispositivo (vea el diagrama si es necesario). Las células de flujo en el dispositivo y se adhieren a la superficie tratada PLL.
  4. Después de la carga, coloque los dispositivos que contienen las células de nuevo en una incubadora durante 10 minutos para permitir que las células que desea adjuntar.
  5. Después de 10 minutos, llenar los depósitos con los medios de comunicación y dispositivos de volver a meterla en la incubadora.

Discussion

Densidades celulares pueden variar dependiendo de la aplicación. Sin embargo, la siembra de las neuronas primarias de muy baja densidad de un general conduce a la muerte celular. Dependiendo de la incubadora y el nivel de humedad, los medios de comunicación puede ser necesario cambiar los dispositivos cada 2 ó 3 días. Al cambiar los medios de comunicación, es importante después de la eliminación de los medios de comunicación de los depósitos, a no quitar el medio de los canales principales. Además, es una buena práctica para poner los medios de comunicación fresca en los pozos de la parte superior y permitir que algunos medios de comunicación fresca que fluya a través del dispositivo y en los principales canales antes de llenar los embalses.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
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Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).More

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

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