Cet article présente une approche consistant à combiner photostimulation à balayage laser avec des enregistrements de cellules entières dans des souris transgéniques exprimant la GFP dans les populations limitées neurone inhibiteur. La technique permet de cartographie étendue et l'analyse quantitative des locaux des circuits synaptiques inhibitrices spécifiques des neurones corticaux.
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Article de méthode
Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les neurones inhibiteurs sont cruciaux pour la fonction corticale. Ils représentent environ 20% de toute la population neuronale corticale et peut être subdivisée en sous-types différents en fonction de leurs propriétés immunochimiques, morphologiques, physiologiques et 1-4. Bien que des recherches antérieures ont révélé beaucoup sur les propriétés intrinsèques des différents types de neurones inhibiteurs, les connaissances sur leurs connexions circuit local est encore relativement limitée 3,5,6. Étant donné que la fonction de chaque neurone individuel est façonné par son entrée synaptique excitateurs et inhibiteurs dans les circuits corticaux, nous avons eu recours à balayage laser photostimulation (LSP) pour les connexions locales au plan du circuit des types spécifiques de cellules inhibitrices. Comparé à une stimulation électrique conventionnel ou la stimulation de glutamate feuilletée, LSPS a des avantages uniques permettant la cartographie étendue et l'analyse quantitative des locaux fonctionnels pour les entrées enregistrés individuellement neurones 3,7-9. Photostimulation laser via uncaging glutamate active sélectivement les neurones perisomatically, sans activer les axones de passage ou de dendrites distales, ce qui assure une résolution de cartographie sous-laminaire. La sensibilité et l'efficacité de LSP pour les entrées de cartographie à partir de nombreux sites de stimulation sur une vaste région sont bien adaptées pour l'analyse des circuits corticaux.
Ici, nous introduisons la technique de LSP combinée avec la cellule entière patch clamp pour la cartographie des circuits locaux inhibiteurs. Enregistrements spécifiques ciblées sur des types de cellules inhibitrices sont facilitées par l'utilisation de souris transgéniques exprimant des protéines vertes fluorescentes (GFP) dans des populations limitées neurone inhibiteur du cortex 3,10, ce qui permet l'échantillonnage uniforme des types de cellules ciblées et d'identifier sans ambiguïté les types de cellules enregistrées . Comme pour la cartographie des LSP, nous décrivons l'instrumentation du système, décrire la procédure expérimentale et acquisition de données, et présente des exemples de cartographie circuit principal de la souris cortex somatosensoriel. Comme illustré dans nos expériences, le glutamate est activé en cage dans une région géographiquement limitée de la tranche de cerveau par photolyse laser UV; simultanée voltage-clamp enregistrements permettent la détection de photostimulation évoqués réponses synaptiques. Cartes d'entrée soit excitateurs ou inhibiteurs synaptiques du neurone cible sont générés par la numérisation du faisceau laser pour stimuler des centaines de sites potentiels présynaptiques. Ainsi, les LSP permet la construction de cartes détaillées des entrées synaptiques empiéter sur des types spécifiques de neurones inhibiteurs par des expériences répétées. Pris ensemble, la technique basée sur la photostimulation offre neuroscientifiques un outil puissant pour déterminer l'organisation fonctionnelle des locaux circuits corticaux.
Protocole
1. La préparation de tranches de cerveau
- Les souris transgéniques sont profondément anesthésiés avec du pentobarbital de sodium (> 100 mg / kg, ip) et rapidement décapité, et leurs cerveaux extraits dans une solution de découpe congelés et oxygéné.
- Lunettes de GFP sont utilisés pour visuel écran si le cerveau de souris exprime bien la GFP.
- Somatosensoriel primaire sections corticales de 400 um d'épaisseur sont coupées avec un vibratome de saccharose contenant le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF). Les tranches sont d'abord incubées dans le saccharose contenant ACSF pendant 30 min à 1 h à 32 ° C, et après la période d'incubation ....
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Discussion
Techniques de cartographie basée sur photostimulation ont été effectivement appliquées pour l'analyse des circuits corticaux. Photostimulation balayage laser combinée avec l'enregistrement de cellules entières permet de cartographier à haute résolution des distributions laminaires des sources d'entrée pour les neurones présynaptiques unique, car l'enregistrement simultané d'un neurone postsynaptique avec photostimulation d'amas de neurones présynaptiques à différents endroits fournit des mesures .......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous remercions Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin pour leur assistance technique. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health DA023700 subventions et de DA023700-04S1 à XX
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| lignées de souris transgéniques | Jackson laboratoire ou d'autres sources | S'il vous plaît se référer à Xu et Callaway (2009) | |
| GFP lunettes | BLS SA, en Hongrie | ||
| vibratome | Systèmes Leica | VT1200S | |
| Glutamate INM en cage (4-méthoxy-7-nitroindolinyl-cage L-glutamate) | Bioscience Tocris, Ellisville, MO | Cat n ° 1490 | |
| biocytine | B4261 | ||
| Extracteur d'électrode | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| tubes de verre pour faire des électrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp ampli 700B | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| La caméra CCD numérique | Q-imagerie, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Microscope à la recherche | Olympus, Tokyo, Japon | BW51X | |
| Unité laser UV | DPSS Lasers, Santa Clara, Californie | le modèle 3501 | |
| Autres équipements pour la numérisation laser phostimulation | S'il vous plaît se référer à Xu et al (2010). |
Solutions:
- Contenant du saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour couper une tranche (en mM: NaCl 85, 75 de saccharose, 2,5 KCl, 25 de glucose, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl2, et 24 NaHCO 3).
- Enregistrement ACSF (en mM: NaCl 126, KCl 2,5, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, et 10 de glucose)
- Solution électrode interne (en mM: 126 K-gluconate, 4 KCl, HEPES 10, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, et 10 phosphocréatine; pH 7,2, 300 mOsm).
Références
- Ascoli, G. A. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature. 9, 557-568 (2008).
- Markram, H. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nature. 5, 793-807 (2004).
- Xu, X., Callaway, ....
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Réimpressions et autorisations
