Implantasjon av en Carotid Cuff for Utløsende Shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

Summary

Den constricting cuff presenteres i denne artikkelen er designet for å indusere aterosklerose i murine felles carotisar. På grunn av den koniske formen på sitt indre lumen det implanterte cuff genererer godt definerte regioner av lav, høy og oscillasjon skjærspenning utløser utviklingen av aterosklerotisk lesjoner av forskjellige inflammatoriske fenotyper.

Abstract

Det er allment akseptert at endringer i vaskulær skjærspenning utløse uttrykk av inflammatoriske gener i endotelceller og dermed indusere arteriosklerose (anmeldt i ¹ og ^2). Rollen skjærspenning har blitt grundig studert in vitro undersøke påvirkning av flyten dynamikk på dyrkede endotelceller ^1,3,4 og in vivo i større dyr og mennesker ^1,5,6,7,8. Men svært reproduserbare små dyremodeller gir systematisk undersøkelse av påvirkning av skjærspenning på plaque utvikling er sjeldne. Nylig introduserte Nam et al. ^Ni en mus modell der ligation av grenene av carotisar skaper en region med lav og oscillasjon flyt. Selv om denne modellen fører til endotelial dysfunksjon og rask dannelse av aterosklerotiske lesjoner i hyperlipidemic mus, kan det ikke utelukkes at den observerte inflammatorisk respons er, i hvert fall delvis en konsekvens of endotelceller og / eller fartøy skade på grunn ligation.

For å unngå slike begrensninger, har en skjærspenning endre cuff blitt utviklet basert på beregnet fluid dynamikk, som kjegle formet indre lumen ble valgt for å skape definerte regioner av lav, høy og oscillasjon shear stress i felles carotisar ^10. Ved å bruke denne modellen i apolipoprotein E (APOE) knockout mus fôr med høyt kolesterol vestlige typen kosthold, vaskulære lesjoner utvikle oppstrøms og nedstrøms fra mansjetten. Deres fenotypen er korrelert med regional flow dynamikken ¹¹ som bekreftes av in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) ^12: Lav og laminær skjærspenning oppstrøms mansjetten fører til dannelse av store plaques i en mer sårbar fenotype, mens oscillasjon skjærspenning nedstrøms mansjetten induserer stabile aterosklerotiske lesjoner ^11. I de regionene med høy skjærspenning og høy laminær flow innenfor mansjetten,vanligvis ingen aterosklerotisk plakk er observert.

I konklusjonen, er den skjærspenning-endring cuff prosedyre en pålitelig kirurgisk tilnærming til å produsere fenotypisk forskjellige aterosklerotiske lesjoner i APOE-mangelfull mus.

Protocol

1. Klargjøre skjærspenning modifier (mansjett)

1. Den skjærspenning modifier består av to langsgående halvdeler av en sylinder med en kjegle formet lumen. Halvparten skjellene er laget av termoplast polyetherketone produsert av en plast støping prosedyre. Den støpte elementer blir sendt ut mens de fortsatt er koblet til løperen. Derfor halvdelen skjell må bli kappet før bruk. Hver kastet inneholder halv skall av forskjellige størrelser fra 150 mikrometer - 300 mikrometer (lavest indre diameter på nedstrøms ende).
2. Mansjetten forberedelse bør utføres under et kirurgisk mikroskop.
3. Hold mansjetten halvdel skallet med butt tang og forsiktig så hogg den av fra den kastet ved hjelp av en skarp skalpell. Denne prosedyren vil føre til en halv shell forløpere som må bearbeides videre.
4. Plasser halvparten skallet forløperen på en enda sklisikker plate; fikse det med butt tang og klippe det nøyaktig langs preformed snitt for å remOve lukket slutten. Dette vil gi mansjetten halvdel skallet klar til bruk.
5. Kontroll den halve skallene under mikroskopet og forsiktig fjerne eventuelle gjenværende skarpe kanter. Den koniske indre lumen er vesentlig for å indusere ulike kvaliteter av skjærspenning innenfor, oppstrøms og nedstrøms av den implanterte mansjetten. En groove på den ytre overflaten av den halve skjell kjører vinkelrett på indre lumen fungerer som en veiledende for den tråden som til slutt stikker den halve skall sammen for å danne funksjonelle mansjetten.
6. Oppbevar cuff en halvdel skjell, klassifiseres etter størrelse, i 70% etanol.

2. Implanting mansjetten rundt høyre carotisar

1. APOE knockout mus bør være rundt 10 ukers alder og med en vekt på minst 20 gram. Hvis plakk utvikling bør undersøkes under høyt kolesterol diett, som starter en slik vestlige typen kosthold 4 uker før mansjetten implantasjon anbefales.
2. Hele kirurgiske prosedyren børutføres under minst semi-sterile forhold: Bruk et kirurgisk kappe, maske og lue og sterile hansker. Sterilisere instrumentene i 30 sekunder i en perle instrument sterilisator og plassere dem på et sterilt ugjennomsiktig ark. Pass opp! Instrumenter må kjøles ned før bruk!
3. Plasser musen i en anestesi induksjon kammer fylt med 3% isofluran til den er helt bedøvet. Bekreft anestesidybden med respons til tå klype. Alternativt kan anestesi utføres med intraperitoneal (ip) injeksjon av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) eller alternative anestesimidler godkjent av IACUC. For ip injeksjon, hold musen i liggende posisjon og injisere det bedøvelse i venstre nedre kvadrant av magen.
4. Plasser musen på et oppvarmet kirurgisk plate, i ryggleie. For å hindre øynene kjøres tørr fukte dem med øye salve (f.eks Bepanthen øyne og nese lotion). Spre for-og hind-labber og tape dem ned til plate. Hvis du utfører isofluran anestesi, den narkotiske gasstrømmen (2% isofluran) må være levert via en liten gnager maske.
5. Fjern hår mellom kjeven og sternum ved enten å bruke hårfjerningskrem agent (f.eks Pilca Med) eller ved å bruke en fin elektrisk barbermaskin (f.eks Wella Contura). Barbering må utføres med forsiktighet for å unngå irriterende på huden. Hvis du bruker en hårfjerningskrem agent, gi det 1-2 min for å trenge inn i håret, deretter forsiktig gni til alle hår og hårfjerningskrem agent er fjernet.
6. Ha klar tidligere forberedt cuff halv skall av forskjellige størrelser (to av hver størrelse) og en 2,5 cm lang bit av 6-0 silke sutur for sammenkobling den halve skallene på stedet av carotis okklusjon.
7. Desinfiser operativsystemet feltet med liberale mengder Betadine. Bruk skarp liten saks for å åpne huden og det underliggende konseptet av halsen av en 4-5mm medial snitt start fra toppen av sternum (manubrium).
8. Utvid åpningen, shift høyre parotiden kjertelen til side og sette inn et kirurgisk spreder. Så rett ut dissekere inn i den dype, like til venstre i luftrøret (fra kirurger visning), hvor retten sternomastoideus muskelen krysser rett omohyoid muskelen, inntil du er i stand til å identifisere pulserende høyre felles carotis.
9. Ved hjelp av svært fine vinklet eller buet tang (f.eks Dumont # 5 / 45), dissekere høyre felles carotisar ved å forsiktig fjerne omkringliggende bindevev. Separate carotis fra vagus nerve - den hvite, trevlet objekt kjører direkte langs carotis - da dette trinnet er nødvendig for å fullstendig avsløre fartøyet. Vær forsiktig verken å skade vagus nerve eller en gren av venstre interne vena jugularis, som også i nær tilknytning til carotis.
10. For å velge riktig mansjettstørrelse, sammenligne diameter på konkurranseutsatt carotis med indre diameter på mansjetten halv skall: Den største bredden på mansjettene lumen bør møte den ytre diameteren på carotis. Nå nøye sette tuppen av tang under carotis, åpner tang, tråden stykke 6-0 silke sutur under carotis og danne en loop. Mellom sløyfen og carotis plassere en mansjett halvdel skallet under carotis. Den siden av største innsnevring må nedstrøms.
11. Plasser den andre cuff halv skall i sløyfen på toppen av carotis.
12. Forsiktig stramme sutur løkken bruker suturing pinsett og node tråden. Ved å gjøre dette fungerer skjærspenning modifier er dannet. For nøyaktig montering av mansjetten er det avgjørende at sutur kjører akkurat innenfor preformed sporet på den ytre overflaten av mansjetten.
13. Flytt rett parotiden kjertel tilbake i sin opprinnelige stilling, omtrentlig og lukke huden enten ved hjelp av en liten mengde 6-0 prolene sutur eller, alternativt, kan du bruke sår klipp.
14. Injisere en enkelt dose av 5 mg / kg carprofen (f.eks Rimadyl) subkutant å gi profylaktisk smertebehandling og plassermusen i en varmende kammer før det kommer seg. Normalt tar dette 30-60 min ved bruk av Ketamin / xylazin anestesi. Ved bruk av isofluran innånding anestesi utvinning perioden er vesentlig kortere (10-20 min).
15. I vår erfaring, dyr gjenvinne normal trykklett aktivitet innen de første 24 timene etter mansjett implantasjon med intervensjonen blir utført av en erfaren kirurg. Men hvis dyret ser ut til å være fortvilet enda en dag etter operasjonen, gjenta smertestillende behandling og rådføre seg med veterinær ansatte.

3. Eksplantasjon mansjetten og carotis

1. For histologiske analysen carotis må høstes ved slutten av observasjonsperioden. Før du starter explantation, har dyret å bli drept i henhold til IACUC retningslinjer.
2. Hvis mansjetten halv skjellene er beregnet på gjenbruk, nøye fjerne alle vev fragmenter og koble sutur fra plasten elementene, dissecting fra carotis, vaske og lagre halvparten skjell i 70% alkohol. Man bør huske på at mansjetten er innebygd i bindevev sammenvoksninger etter flere uker med implantasjon og at man må dissekere mansjetten med forsiktighet for ikke å skade fartøyet vegger.
3. Alternativt kan mansjetten være eksplanterte og innebygde sammen med carotisar. Plastmaterialet av mansjetten er motstandsdyktig mot normal fiksering løsninger og løsemidler brukes for parafin innebygging. Dessuten kan den innebygde prøvene bli kuttet med en vanlig mikrotom utstyrt med normal blader.

Fire. Representant Resultater

Mansjetten må plasseres alltid rundt en av de to vanligste carotis av et dyr (Fig. 1a, 1b) - motsatt side fungerer som en kontroll. På bildet presentere to halve skall av cuff (Fig. 1B) den koniske formen på indre lumen er synlig. Dette koniske formen er avgjørende for establishing de tre regionene med distinkte flow dynamikk. Typiske skjærspenning mønstre indusert av støpte beregnet fra Doppler målinger ¹¹ og tilsvarende flyt hastigheter basert på fase-kontrast velocity MR ¹² er gitt i Figur 2.

Når mansjetten er implantert i APOE knockout mus matet en western typen diett endret flow dynamikken provosere skjærspenning induced aterosklerotisk plakk nedfall (Fig. 3): Upstream av koniske innsnevring lav laminær skjærspenning fører til massive utviklingen av aterosklerotisk plakk på en mer sårbare fenotype, preget av lipid kjerner nær det sentrale lumen dekket bare av en tynn fibrøs cap (Fig. 3A1). Den koniske indre lumen av mansjetten fører til en økning i strømningshastighet. Nesten ingen plakk deponering er observert i dette området. Rett nedstrøms stedet av flaskehalsen umiddelbar utvidelse av arterien resulterer i et område av virvler og oscillasjon flow parametre, noe som fører til mindre utvidet plakk utviklingen av et mer stabilt fenotype (dvs. mindre lipid kjerner som er lokalisert mer tett til media).

Figur 1 skjærspenning modifier - montering og plassering (A) Skjematisk tegning av den implanterte cuff..: Mansjetten er plassert rundt høyre felles carotisar (RCCA) - på motsatt side (LCCA = venstre felles carotisar) fungerer som kontroll . (B) In vivo MR angiografi i en mus: I maksimal intensitet projisering av en tre-dimensjonale tid-of-flight MR angiografi den koniske innsnevring indusert av kastet (hvit pil) er synlig (for detaljer se ^12). (H = hode, F = føtter, R = høyre, L = venstre). I øvre høyre hjørne en makroskopisk syn på indre lumen og den ytre overflaten av cuff halvdel skall er gitt. Når montert, to halve skall danner en konisk sylinder som modifisererflyten dynamikken innenfor fartøyet i en definert måte. For å sikre riktig passform, serverer en groove på den ytre overflaten av cuff (gul pil) som en veiledende for linking sutur.

Figur 2. Regioner av forskjellig flow dynamikk og skjærspenning. Implantasjon av mansjetten endrer flow dynamikk og senere shear stress i constricted carotisar i en definert måte. I øvre skjematisk illustrasjon ulike flytegenskaper indikeres og det lokale omtrentlige verdier for skjærspenning er gitt (basert på Doppler målinger ^11). Nedenfor er tilsvarende flow hastigheter for et enkelt dyr målt ved MRI oppstrøms av implantert cuff vist i en T1-vektet cross-sectional MR-bilde av halsen (fase-kontrast hastighet bildebehandling, for detaljer se ^12).

Figur 3. Skjærspenning indusert plaque utvikling i APOE knockout mus. Øvre venstre hjørne viser makroskopisk syn på den åpne halsen og utsatte carotis arteries av en APOE knockout mus under høyt fett (western type) kosthold 8 uker etter implantering av en skjærspenning modifier rundt høyre felles carotisar (RCCA). Den ugjennomsiktige hvite delen av fartøyet (*) oppstrøms for cuff tilsvarer et nettsted med omfattende aterosklerotisk plakk deponering. Den gule pilen viser den tråden som kombinerer de to cuff halvdeler. I kontrast er det ingen tegn til plakk deponering i venstre felles koronar (LCCA).
(A) - (C) Representant HE beiset tverrsnitt av retten til felles carotisar av APOE knockout mus under vestlig typen kosthold 8 uker etter implantering av mansjetten. Skjematisk illustrasjon gir tilsvarende fly (stiplet linje) der hvore delene var lokalisert. (A) Upstream på mansjetten aterosklerose fører til massive plakk deponering. Stor lipid kjerner (røde piler), som delvis ligger nær den sentrale lumen (detalj A1) karakteriserer den sårbare karakter av disse plakk. (B) På flyet på mansjetten flaskehalsen nesten ikke plakk utvikling er åpenbare, mens direkte nedstrøms cuff (C) oscillasjon flyt fører til moderat plakk utvikling av en mer stabil type (dvs. mindre eller ingen lipid kjerner). (C1, C2 = halve skall av mansjetten, P = plaketter, asterisk = fartøy lumen)

Discussion

For å minimere eksperimentell variasjon er det anbefalt å arbeide med dyr på nesten samme alder og med samme kosthold historie. En nylig publisert undersøkelse viser at skjærspenning modifier anvendt i wildtype mus kan være en god modell for etterforskningen av endotelial dysfunksjon og tidlig inflammatoriske responser forårsaket av endret flow dynamikk ^13. Men for henvendelsen av aterosklerotisk plakk utvikling transgene hyperlipidemic musemodeller (f.eks APOE knockout mus) er påkrevd. Progresjon og omfang av plakk deponering i hver mus modell avhenger av type diett som brukes. Generelt, jo høyere kolesterol / fett i dietten, jo raskere progresjon av sykdommen er.

Under mansjett implantasjon kirurgen bør prøve å minimere vevsskade og manipulasjon, for dette vil senke inflammatoriske responser på grunn av skade. Minimere skaden er spesielt viktig nårinflammatoriske prosesser i løpet av aterosklerose er i fokus for studien. For å anslå graden av postoperative betennelse det er sterkt anbefalt å implantat non-konstriktiv kontroll mansjetter i noen dyr. Kontrollen cuff bør være en sylinder laget av samme materiale, men med en kontinuerlig, ikke-konstriktiv indre diameter.

Det er også viktig å alltid plassere mansjetten på samme posisjon carotisar og å velge alltid samme side, ellers flow hastigheter ikke er reproduserbar. Kirurgen må ta godt vare på riktig passform på mansjetten når kombinere de to cuff halvdel skjell, fordi feilaktig passer resulterer i en ikke lett dannes koniske indre lumen som igjen fører til uforutsigbare flow parametere.

En stor fordel av skjærspenning modifier er at det lager tre godt definerte regioner med karakteristiske og reproduserbare mønstre av flow hastigheter innenfor samme fartøy (Fig. 2, Tabell 1). I et hyperlipidemic miljø hver av disse strømningsmønster forårsaker plakk deponering av et karakteristisk fenotype (Fig. 2) ligner sårbare og stabile plakk i mennesker.

Dermed er presentert musen carotid cuff en verdifull in vivo modell for etterforskningen av skjærspenning indusert plakk fenotyper (stabil og ustabil). Videre kan det også være en ideell små dyr modell for utvikling av nye molekylær avbildning prober, designet for å tidlig identifisere områder av aterosklerose selv før kommet plakk deponering fører til stenose eller plakk ruptur, den første hendelsen som gir opphav til livstruende kardiovaskulære hendelser som trombe formasjon og hjerteinfarkt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shear stress modifier (polyetherketone)	Promolding BV