Summary
Dette arbejde nærmere udarbejdelse af 3D fibrin stilladser til dyrkning og differentiering plutipotent stamceller. Sådanne stilladser kan anvendes til at screene virkningerne af forskellige biologiske forbindelser på stamceller adfærd såvel som modificeret til at indeholde medikamentudleveringssystemer.
Abstract
Stamceller findes i naturligt forekommende 3D mikromiljøer in vivo, hvilket ofte omtales som stamcellen niche 1. Dyrkning stamceller indersiden af 3D biomateriale stilladser tilvejebringer en måde til præcist efterligner disse mikromiljøer, hvilket giver en fordel i forhold til traditionelle 2D dyrkningsmetoder med polystyren samt en fremgangsmåde til splejsning af udskiftning af væv 2. Mens 2D vævskultur polystyren er blevet anvendt til de fleste celledyrkningsforsøg kan 3D biomateriale scaffolds nærmere replikere mikromiljøer fundet in vivo ved at muliggøre mere nøjagtig fastlæggelse af celle polaritet i miljøet, og som besidder biokemiske og mekaniske egenskaber svarende til blødt væv. 3. En række naturligt afledte og syntetiske biomateriale scaffolds er blevet undersøgt som 3D-miljøer til understøtning stamcelle vækst. Medens syntetiske stilladser kan syntetiseres til at have en større rAnge af mekaniske og kemiske egenskaber og har ofte en større reproducerbarhed, er naturlige biomaterialer ofte sammensat af proteiner og polysaccharider, der findes i den ekstracellulære matrix og som et resultat indeholder bindingssteder for celleadhæsion og let støtte cellekultur. Fibrin stilladser, fremstillet ved polymerisering af proteinet fibrinogen fra plasma, har været bredt undersøgt til forskellige vævsdyrkningsapplikationer både in vitro og in vivo 4. Sådanne stilladser kan modificeres ved anvendelse af en række fremgangsmåder til at optage systemer med kontrolleret frigivelse til afgivelse af terapeutiske faktorer 5. Tidligere arbejde har vist, at sådanne stilladser kan anvendes til vellykket dyrkning embryonale stamceller og denne scaffold-baserede kultursystem kan anvendes til at screene virkningerne af forskellige vækstfaktorer på differentiering af stamcellerne podet ind 6,7.
Denne protokol detaljer processen med polymerizing fibrin stilladser fra fibrinogen løsninger ved hjælp af den enzymatiske aktivitet af thrombin. Processen tager 2 dage at gennemføre, herunder en dialyse natten skridt for fibrinogenopløsning at fjerne citrater, der hæmmer polymerisering. Disse detaljerede fremgangsmåder er afhængige af fibrinogenkoncentrationer bestemt til at være optimal for embryonisk og induceret pluripotente stamcelle kultur. Andre grupper har yderligere undersøgt fibrin stilladser til en lang række celletyper og anvendelser - viser alsidigheden af denne fremgangsmåde 8-12.
Protocol
Bemærkninger, før du starter protokol: Fibrinogen er en blod afledt protein og dermed relevant uddannelse i sikkerhed skal være afsluttet inden håndtering. Denne protokol kræver 2 dage at fuldføre så tiden de ønskede stamceller kulturer hensigtsmæssigt at sikre, at de er klar til såning. I form af beregningen hvor meget fibrinogen at afveje tre 35 mm petriskåle i tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,4) indeholdende 110 til 130 mg fibrinogen opløses i 3 ml TBS vil være tilstrækkelig til at frembringe en 24-brønds plade indeholdende 400 pi fibrin stilladser i hver brønd.
1. Day One: Making fibrinogen løsninger og natten dialyse
- Tage lyofiliseret fibrinogen ud af køleskabet og lad den stå i 20 minutter for at lade den komme til stuetemperatur.
- Tilsæt 3 ml Tris-bufret saltvand (TBS) til hver 35 mm petriskål. Hver plade af fibrinogen udbytter 2 til 3 ml fibrinogenopløsning området i en koncentration fra 12 til 20mg / ml og den totale mængde af fibrinogen nødvendigt kan beregnes baseret på disse approksimationer.
- Afvej ca 100-130 mg fibrinogen (Fg) og drys på overfladen af den TBS stede i hver skål. Vent 5 minutter for fibrinogen begynder at gå i opløsning. Omfatte petriskål med låg.
- Inkuber petriskåle ved 37 ° C i 2 timer for at tillade fibrinogen til fuldt ud i TBS-opløsning.
- Våd dialyserør (7000 MW afskæring) med TBS. Fold nederste ende af røret og klemmen ende lukket med en dialyse klemme.
- Afpipettér fibrinogen løsninger fra retter i dialyserør. Foldet over toppen og klemme lukket med en dialyse klemme.
- Sted dialyserør indeholdende fibrinogen-opløsning i en 4 liters beholder med TBS. Blanding opløsning ved anvendelse omrøringsplade sat til lav hastighed (100 rpm).
- Dialysere opløsningen natten over på omrøres pladen i mindst 12 timer. TBS-opløsning behøver ikke at blive ændret i løbet af denne periode. 2. Dag 2: Polymerisering af fibrin stilladser og podning af stamceller i stilladser
- Fjerne fibrinogenopløsning fra dialyserøret og anbringes i en passende størrelse konisk rør (enten 15 ml eller 50 ml).
- Filteret fibrinogen-opløsning med en 5,0 um sprøjtefilter at fjerne store urenheder i opløsningen. Afhængig af volumenet af opløsningen, kan anvendelsen af flere filtre er nødvendig for at behandle hele opløsningen.
- Sterile filter fibrinogenopløsningen med et 0,22 um filter til et 50 ml konisk rør. Ved hjælp af en passende størrelse pipette, bestemmer mængden af den filtrerede fibrinogenopløsning til senere brug, når de udfører beregninger. Afhængig af volumenet af opløsningen, kan anvendelsen af flere filtre være nødvendigt at behandle ENTIRE-opløsning.
- Måle absorbansen af fibrinogen-opløsning ved 280 nm ved spektrofotometri. En fortyndingsfaktor på 50 er det ofte nødvendigt at opnå en absorbans på 1.
- Beregning af koncentrationen af protein til stede i fibrinogenopløsning ved hjælp af følgende ligning: [Fibrinogen i mg / ml] = (A 280 x fortyndingsfaktor) ÷ 1,55 hvor 1,55 er ekstinktionskoefficienten ved A 280 for human fibrinogen 13. Næste beregne mængden af TBS nødvendig for at fortynde koncentrationen af opløsningen til 11,1 mg / ml fibrinogen baseret på det oprindelige volumen. Slutkoncentrationen af protein i fibrin stilladser vil være 10 mg / ml efter polymerisation.
- Opnå sterile thrombin og calciumchlorid opløsninger. Første, tilsættes 15 uL thrombin-opløsning (koncentration: 40 U / ml - slutkoncentration på stilladset er 2 U / ml) til højre for hver brønd i første række af 24-brønds plade. Derefter tilsættes 15 pi 50 mM calcium Chloride opløsning på venstre side af hver brønd. Endelig tilsættes 270 pi af fibrinogenopløsningen til pladen. Ryste pladen fra side til side, efterfulgt af omrystning bagside til forside for at sikre blanding af opløsninger.
- Lad række, der indeholder blandingerne polymerisere i 5 minutter ved stuetemperatur. Skeletterne blive mere uigennemsigtigt som de polymerisere.
- Gentag trin 2.6 og 2.7, indtil det ønskede antal af fibrin stilladser er polymeriseret.
- Efter den sidste 5 minutters inkubering anbringes pladerne inde i en 37 ° C inkubator for at tillade fuldstændig polymerisation af stilladser.
- Efter en time inkubationen er færdig, er næste skridt er at frø skafottet med embryoide organer. Ved hjælp af en 20 gl pipettemen, vælge et individuelt embryoid krop og sted i midten af fibrin stilladset. Check med mikroskop at hver brønd indeholder et enkelt embryoid krop.
- Tilsættes 5 ul thrombin-opløsning (koncentration: 40 U / ml) og 5 pi 50 mM calciumchloridløsning på toppen af hver embryoid kroppen efterfulgt af 90 pi af fibrinogen-opløsning til hver brønd. Løsningen skal danne en boble indkapsler de embryoide organer.
- Sted pladen tilbage i 37 ° C inkubator i yderligere en time for at sikre polymerisation.
- Efter inkubation tilsættes 1 ml af den passende celledyrkningsmedier til hver brønd og anbringes pladen tilbage til 37 ° C inkubator.
Alle trin beskrevet for denne proces udføres i en steril vævskultur hætte disse scaffolds vil blive podet med stamcellekulturer.
3. Repræsentative resultater
Figur 1 viser en skematisk sidebillede af en individuel brønd indeholdende 3D fibrin stilladset dyrkningssystem podet med en embryoid organ. Figur 2A viser repræsentative billeder af mus induceret pluripotente stamceller dyrket på muse embryonale fibroblaster fødelag. Disse celler induceres derefter til at danne embryoide legemer, aggregater af celler indeholdende neurale stamceller under anvendelse af en 8 dages retinoinsyre behandlingsprotokol (fig. 2B), som previously er beskrevet 14, medens figur 3 viser udseendet af et IPS-afledt embryoid legeme efter 3 dages dyrkning inden for 3D fibrin stillads. Lignende resultater er blevet opnået tidligere ved hjælp af muse embryonale stamceller 7. Desuden har denne fremgangsmåde været anvendt til dyrkning IPS-afledte embryoide legemer fremstillet ved anvendelse af en anden protokol indebærer retinsyre og purmorphamine 15 inde i 3D fibrin stilladser, der viser alsidigheden af dette dyrkningssystem.
Figur 1. Skematisk fremstilling set fra siden af en enkelt brønd indeholdende en 3D fibrin stillads podet med en embryoid organ.
Figur 2. Mus induceret pluripotente stamceller (iPS) cellekultur og differentiering. For at kunne skelne disse celler i NEURal fænotyper, er iPS celler dyrket i suspension til fremstilling af aggregater af celler kaldet embryoide legemer (EBS). Disse EB derefter behandlet med retinsyre til at inducere neural differentiering og denne protokol blev tidligere anvendt til at inducere neural differentiering af embryoniske stamceller. A) Udifferentieret muse iPS celle koloni dyrket på en muse embryonale fibroblaster fødelag. B) embryoide legemer afledt fra muse iPS celler i suspensionskultur taget på dag 8 efter behandling med retinsyre til at inducere neural differentiering. Målestokken er 100 um.
Figur 3. Eksempel resultaterne af et muse iPS embryoide legeme efter 3 dages dyrkning inden for en 3D fibrin stillads. Celler er begyndt at migrere og differentiere indersiden af fibrin stilladset. Målestokken er 500 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskrevet ovenfor tilvejebringer en fremgangsmåde til generering af 3D fibrin stilladser til pluripotente stamcelle kultur specifikt muse embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Denne 3D biomateriale baseret kultur system mere nøjagtigt efterligner stamcelle niche findes in vivo, og som følge heraf kan det anvendes til at screene biologiske signaler for at bestemme deres virkninger på stamcelle-differentiation 6. Vore observationer har vist, at disse scaffolds ved podet med stamme afledt celle embryoide legemer forbliver i 2 uger in vitro, før de bliver fuldstændigt nedbrudt. At øge stabiliteten af disse scaffolds, kan aprotinin (en proteasehæmmer) anvendes til at forsinke nedbrydning ved tilsætning til celledyrkningsmedier. 7,16 Disse scaffolds er også blevet anvendt med held til neurale vævsdyrkningsapplikationer, især frembringelse af væv svarende til den, der findes i centralnervesystemet 17. Mens andre groups har kombineret iPS celler med fibrinklæber til behandling af iskæmisk slagtilfælde 18, dette arbejde er den første kendte rapport kombinere iPS celler med fibrin scaffolds for neurale vævsdyrkningsapplikationer. Dette arbejde fungerede også som udgangspunkt for at kombinere en række stamceller celletyper med fibrin stilladser til andre vævsdyrkningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke NSERC Discovery Grant 402462 "manipuleret væv stilladser til styring af induceret pluripotente stamcelle adfærd".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
