Summary
I denna rapport redovisar protokollet som används för att mäta de belönande effekterna av hög-fet mat hos möss med hjälp av en progressiv kvot operant conditioning uppgift.
Abstract
Livsmedel som är rika på fett och socker bidrar väsentligt till att äta och eskalerande andelen fetma. Konsumtionen av välsmakande mat kan ge en givande effekt som förstärker action-resultat associationer och förstärker framtida beteende inriktas på att uppnå dessa livsmedel. Allt fler tecken på att de belönande effekterna av energitäta livsmedel spelar en djup roll i överätande och utvecklingen av fetma har ökat intresse för att studera gener, molekyler och neurala kretsar som modulerar 1,2 mat belöning. Den givande effekten av olika stimuli kan studeras genom att mäta viljan att arbeta för att få dem, som i operant betingning arbetsuppgifter 3. Operanta modeller av livsmedel belöning mått förvärvas och frivilliga beteenden svar som är inriktade på att skaffa mat. Ett vanligt använt mått på belöning styrka är en operant procedur som kallas den progressiva förhållandet (PR) Förfalloplan för förstärkning. 4,5 i PR tfrågar, är ämnet krävs för att göra ett ökat antal operanta svar för varje efterföljande belöning. Den banbrytande studier av Hodos (1961) visade att antalet svar som gjorts för att erhålla den sista belöning, benämnd brytpunkten, tjänar som ett index på belöningen hållfasthet 4. Även operanta förfaranden som mäter förändringar i svarsfrekvens inte ensam kan separera förändringar i belöning styrka från förändringar i prestanda, är brytpunkten härrör från PR schemat en väl validerad mått de belönande effekterna av livsmedel. PR uppgiften har använts i stor utsträckning för att utvärdera effekten givande av missbruksdroger och mat hos råttor (t.ex. 6-8), men i mindre utsträckning i möss 9. Den ökade användningen av genetiskt modifierade möss och kost-inducerade överviktiga modeller musen har ökat kraven på beteendemässiga åtgärder av mat belöning i möss. I denna artikel har vi detaljerat material och förfaranden som används för att träna möss för att svara (spaken-press) för en hög fetthaltoch hög socker mat pellets på ett PR-schema av förstärkning. Vi visar att brytpunkt svar gränsvärden ökar efter akut brist på mat och minskar med perifer administration av anorektiska hormonet leptin och därmed bekräfta användningen av denna livsmedel operant paradigm i möss.
Protocol
* De flesta viktiga steg.
1. Utrustning och programvara
- Utbildning och prov genomförs i mus operanta kamrar utrustade med två ultra-lätta, indragbara spakar 1 placerade på vardera sidan av ett livsmedel kärl (se tabell 1). En stimulusgenerator ljus är belägen ovanför varje hävarm, och det finns ett hus ljus vid den övre delen av buren. En pellet dispensern är belägen utanför kammaren. Varje kammare är inrymt i en ljuddämpande skåp med ventilerande fläkt. Chambers är ansluten till en dator dator med MedPC IV programvara via en "Smart Control"-gränssnittet skåp.
OBS: När ultralätta spakar inte är tillgängliga rekommenderas att näs-säcken användas som operant respons för mus studier. Men med båda alternativen finns föreslår vi urval av ultralätta spakar som en mer tillförlitligt mått på motivation med tanke på att näs-petar svar kan be utlöses av explorativ sniffning.
- De MedPC program som används för att köra operanta uppgifter skrivna i Medstate notation kod som en användare kan lära sig med hjälp av den medföljande programmeringsmanualen. Programmering ger flexibilitet för användaren att ändra befintliga koder eller generera unika experimentella parametrar. Vissa koder kan erhållas gratis från Med Associates "Medstate Notskrift Repository" http://www.mednr.com . Ytterligare koder kan köpas från Med Associates.
2. Mus Acklimatisering och livsmedel begränsning
- Vid ankomst möss är hålls i grupp under minst 10 dagar för att vänja sig vid en omvänd 12 h ljus / mörker cykel och försedda med ad libitum tillgång till standard foder och vatten. I vårt fall använder vi vuxna C57BL / 6 möss köpta från Charles River (St. Constant, QC). Alla möss manipulationer och beteendemässiga experiment utförs under mörker-cykel. Alla proförfaranden som involverar användning av djur godkändes av CRCHUM Animal Care utskottet.
- Möss därefter var för sig de hålls och mat begränsad (70% av sitt dagliga matintag) tills de når 90-95% fri utfodring kroppsvikt för att underlätta förvärv av spaken-press svara. Möss förutsatt att deras dagliga kvot av mat i hemmet buren efter avslutandet av sessionen. När når 5-10% viktförlust är den dagliga maten tilldelats anpassas för att stabilisera de lägre kroppsvikt under resten av utbildningen perioden. När möss har uppnått förvärv kriterier (se nedan) de sätts tillbaka på en ad libitum utfodring schema. Möss återta förlorad kroppsvikt på ca 3-4 dagar.
- Möss hanteras i provrummet i 3 dagar före första träningspasset. Dagen före starten av utbildning 10-15 hög fetthalt och hög-socker (HFHS) pellets placeras i hemmet buren för att förhindra eventuell påverkan av mat neofobi på operant performanCE. Vi använder 20 mg HFHS och dammfri, precision mat pellets (14 mg finns också) innehöll 48,9% Kcal som fett (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Operant Träning
- Möss initialt utbildade för att trycka på spaken på ett fast förhållande (FR) -1 förstärkning schema där en enda spak press framkallar leverans av ett livsmedel pellet till behållaren. Endast en spak betecknas som "aktiv" (utlöser leveranser av mat belöning) och tilldelningen av höger och vänster handtag uppvägs mellan möss. Det är viktigt att lägga till minst en 5 sekunders timeout (TO) till FR1 schema (FR1/TO-5), under vilken ytterligare hävstång-pressning inte resultera i leverans av ett livsmedel pellet. Detta till period ger tid för möss att konsumera maten pelleten, kan dock längre tid outs användas om försöksledaren anser att det är nödvändigt för deras musmodell. Varje FR träningspass varar 1 timme eller när 50 pellets har levererats.
- * Förvärv Kriterier: </ Strong> De kriterier som används för att fastställa förvärv av livsmedel upprätthålls operant svara omfattar: (1) ett minsta antal aktiva svar och belöningar tjänade, (2) ett mått på diskriminering mellan aktiva och inaktiva spakar, och (3) mellan-session prestanda stabilitet. Möss som uppvisar diskriminering av ≥ 3:1 för den aktiva jämfört med inaktiva spaken och få ≥ 20 belöningar per session under tre på varandra följande möten anses att uppnå förvärv kriterier 10. Vi har observerat att de flesta (~ 75%) av C57BL6 möss kräver ca 7-10 dagars utbildning för att uppnå förvärv kriterier. Möss som inte når förvärv kriterier vid denna tid genomgår vidareutbildning för ytterligare 5-7 dagar. Vi utesluter möss från testning (~ 5% av fallen) när det inte finns några framsteg genom att den extra 5:e utbildningsdag. Det är viktigt att komma ihåg att nedsatt operant förvärv kan vara ett resultat av vissa farmakologiska och genetiska insatser och bör därför dokumenteras. </ Li>
- Efter tre på varandra följande möten för att få fram ≥ 20 pellets är schemat ökas till FR5/TO-5 sekunder under vilka 5 aktiva hävarmspressar utlöser leverans av maten pelleten. Utbildning på FR5 schemat varar tre dagar.
- * Mössen sedan utbildas i den progressiva förhållandet (PR) Förfalloplan för förstärkning. Svaret Förhållandet schema under PR testning kan beräknas enligt Richardson och Roberts (1996) 11 med hjälp av följande formel (avrundat till närmaste heltal):
= [5 e (R * 0,2)] - 5
där R är lika med antalet av livsmedel belöningar redan tjänat plus 1 (dvs nästa förstärkare). Sålunda antalet svar som krävs för att tjäna ett matbelöning följer ordningen: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 och så vidare. Det slutliga förhållandet avslutats är brytpunkten. - En PR-session varar maximalt 1 timme. Underlåtenhet att trycka på spaken i alla 10 resultat min period i uppsägning av sessionen. PrestandaMance på PR schemat av förstärkning bedöms vara stabil då antalet belöningar intjänade i en 1 avviker timmes session med ≤ 10% under minst 3 dagar i följd.
4. Progressiv Ratio Test och validering
- För att validera livsmedel upprätthålls operant svara i PR uppgift kan man bedöma brytpunkt svarar följande kända manipulationer för att modulera mat belöning. Ett relativt enkelt test för att utföra är mat berövande som kommer att öka motiverande tillstånd musen för mat och därmed öka brytpunkter. Möss måste först testas i PR uppgift under en period av ad libitum utfodring tills den är stabil, baslinje prestanda uppnås. Dagen efter den sista "baseline" dag mat bort från hemmet buren och möss sedan testas i PR uppgiften 24 timmar efter starten av snabbt.
- Vi undersökte också om perifer administration av anorektiska hormonet leptin skulle få motsatt effekt på brytpunktentrösklar. Leptin (AF Parlow, National Hormone och Peptide Program, NIDDK) upplöstes i steril PBS. PR testning utfördes genom att följa en IP-injektion av PBS på en dag och sedan efter injektion av leptin (5 mg / kg) följande dag. Leptin injicerades en timme före testning PR. Brytpunkter jämfördes med användning av ett parat t-test (GraphPad Prism).
5. Representativa resultat
När du testar förmågan av brist på mat för att modulera brytpunkt svara på en PR-plan av förstärkning räknar vi med att avsevärt öka brytpunkter som visas i figur 1. I detta experiment en 24 h period av brist på mat gav en ~ 3,6-faldig ökning av brytpunkter jämfört med dem som erhölls i den fria utfodring baslinjen state Detta tyder på att brist på mat ökar de belönande effekterna av livsmedel. I motsats härtill perifer administrering av det anorektiska leptin (5 mg / kg, ip) en timme före tProvnings bör minska brytpunkt reagera såsom visas i figur 2.
Figur 1. Fasting ökar de belönande effekterna av livsmedel. En 24 h snabb ökade signifikant brytpunkter på en progressiv kvot (PR) Förfalloplan för förstärkning i möss (n = 4). Medelvärde ± SEM, * p <0,05.
Figur 2. Leptin minskar maten belöning i möss. Perifer leptin administrering (5 mg / kg) minskade PR tröskelvärden brytpunkt svar i möss (n = 4). Medelvärde ± SEM, * p <0,05.
Discussion
Operant betingning uppdrag att ge ett effektivt sätt att utvärdera förändringar i motiverande egenskaper mat. De experimentella förfaranden som anges i dagens utbildning artikeln tillstånd möss till spaken tryck för livsmedel belöningar och stabilt svara på en PR-plan av förstärkning.
Mätning av mängden konsumerade livsmedel ger inte samma avläsningen som ansträngning-baserade motåtgärder eftersom inte alla faktorer som påverkar födointaget modulera de belönande effekterna av livsmedel. Till exempel förbruka användbar glukos med perifer 2-deoxiglukos administration hos råttor ökar mängden fritt tillgängliga konsumeras mat men misslyckas att ändra brytpunkter i en PR-arbete för mat 12. PR brytpunkt svarar kan också spegla förändringar i kvaliteten av livsmedel belöningar. Till exempel brytpunkter positivt korrelerad med sackaroskoncentration visar att motivation för sackaros ökar på ett sätt som följer söt smak 8 12-14.
När du använder detta protokoll är det viktigt att komma ihåg att förvärv av livsmedel upprätthålls operant svarar signifikant förbättras genom regelbunden träning (var 1-2 dagar) och genom att öka motiverande tillstånd musen genom att införa en regim mat begränsning. Dessutom se till att möss uppvisar relativt stabila svara på en förstärkning schema innan vi går vidare till mer komplexa scheman (t.ex. FR1 till FR5) är nyckeln till att minimera rörliga prestationsbaserade under testningen. Trots tillämpningen av dessa steg är det inte ovanligt att få någon variationspeciellt mellan olika möss. Av denna anledning är det mycket rekommenderat att använda en inom-patienter (upprepade mätningar) design när det är möjligt att ta bort hela individuell variabilitet. Även inom individer testning är inte möjligt att utreda stabila genetiska modifieringar (dvs. knockout kontra möss kontroll) kan användas för att undersöka påverkan av droger, skador eller akuta genetiska (t ex optogenetic) manipulationer.
Fetma och fetma-relaterade sjukdomar är ett växande problem som ökat vikten av att identifiera de molekyler och nervbanor inblandade. Ackumulerande bevis framhäver den viktiga roll som hjärnans belöningssystem kretsar i livsmedel begär ökade kaloriintag och viktökning. PR uppgiften är ett värdefullt verktyg för att mäta effekterna av neurobiologiska, genetiska eller farmakologisk manipulationer på de belönande effekterna av livsmedel.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till denna video-artikeln är sponsrad av Med Associates, Inc.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats med bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (355.881) och den kanadensiska Stiftelsen för innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
