זרימות עבודת תיוג איזוטופים יציבות המעסיקות<sup> 18</sup> O מועשר במים (ליאו זרימות עבודה) הם כלים מגוונים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים. בתהליכי עבודה בסיוע פרוטאז (Paleo),<sup> 18</sup> O-אטומים הם הציגו על ידי מחשוף פרוטאוליטי ותגובות חליפי חמצן carboxyl מתווך על ידי פרוטאזות. בחומצת קטליזאטור זרימת העבודה (Aleo),<sup> 18</sup> O-אטומים הם הציגו על ידי חילופי החמצן carboxyl ב-pH הנמוך.
איזוטופים יציבים הם כלים חיוניים בספקטרומטריית מסה ביולוגית. מבחינה הסטורית, 18 איזוטופים יציבים O-נעשו שימוש הנרחב כדי ללמוד את המנגנונים קטליטי של אנזימים פרוטאוליטים 1-3. עם כניסתו של פרוטאומיקה המונית ספקטרומטריית מבוססת, התאגדות enzymatically-הקטליזאטור של 18 O-אטומים ממים יציבים מועשרים isotopically הפכה שיטה פופולרית כמותית להשוות את רמת ביטוי חלבון (נבדק על ידי Fenselau ויאו 4, מיאגי וRao 5 ו יה et al. 6). 18 O-התיוג מהווה חלופה פשוטה וזולה לחומרים כימיים (למשל iTRAQ, ICAT) ו( למשל SILAC) טכניקות תיוג מטבוליות 7. בהתאם לפרוטאז המנוצל, 18 O-תיוג יכול לגרום להתאגדות של עד שני 18 O-אטומים בקבוצת carboxyl C-המסוף של מוצר המחשוף 3 </sup>. תגובת התיוג נחלקת לשני תהליכים עצמאיים, ביקוע האג"ח פפטיד ותגובת חילופי חמצן carboxyl 8. בPaleo (עמ rotease-דואר abeling l ssisted mploying 18 הו מים מועשרים) הסתגלות של O-תיוג האנזימטית 18, שנוצלו 50% 18 הו מים מועשרים להניב חתימות איזוטופ ייחודיות. בשילוב עם רזולוציה גבוהה מטריצה בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסת טנדם ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/TOF MS / MS), את מעטפות איזוטופ אופייניות יכול לשמש כדי לזהות מוצרי ביקוע עם רמה גבוהה של פירוט. קודם לכן יש לנו להשתמש Paleo-המתודולוגיה כדי לזהות ולאפיין פרוטאזות אנדוגניים 9 ולנטר תגובות proteolytic 10-11. מאז Paleo מקודד את עצם מהותה של תגובת ביקוע פרוטאוליטי, ההתקנה הניסיונית היא enri פשוט וביוכימייםצעדי chment של מוצרי ביקוע ניתן לעקוף. Paleo-השיטה ניתן להרחיב בקלות ל( i) ניסויים כמובן הזמן שמפקחים על הדינמיקה של תגובות ביקוע proteolytic ו (ב) ניתוח של proteolysis בדגימות ביולוגיות מורכבות המייצגות את התנאים פיסיולוגיים. ניסויי Paleo-TimeCourse לעזור זיהוי צעדים מגבילי קצב עיבוד ביניים תגובה בתגובות מסלול proteolytic מורכבות. יתר על כן, Paleo-התגובה מאפשרת לנו לזהות אנזימים פרוטאוליטים כגון טריפסין פרוטאז סרין, כי הוא מסוגל ליחבוש את מוצרי הביקוע ולזרז את ההתאגדות של 18 2 O-Atom. "תיוג כפול" אנזימים כאלה יכולים לשמש לpostdigestion 18 O-תיוג, שבפפטידים מסומנים באופן בלעדי על ידי תגובת חילופי חמצן carboxyl. האסטרטגיה השלישית שלנו משתרעת תיוג מעסיק 18 הו מים מועשרים מעבר אנזימים ומשתמשת בתנאי pH חומצי להציג סימן איזוטופ יציב O-18atures לפפטידים.
על ידי שילוב של תיוג איזוטופ יציב וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה באופן הזמן נפתר, שיטת Paleo-TimeCourse מאפשרת לניתוח דינמי של הדור של מוצרי פפטיד. הבדיקה יכולה לשמש ליצירת פפטידים שכותרת isotopically יציבים ללימודי proteomics כמותיים ואיכותיים ולהעריך את הקינטיקה של פפטידים שprot…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR גרנט 1R01DE019796.
Name of material | Company | Catalogue number |
PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
Name of reagent | Company | Catalogue number |
Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
Trypsin Gold | Promega | V5280 |
Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents