Summary
NADPH-oxidase er den vigtigste kilde af reaktive oxygenarter (ROS) i fagocytter. På grund af den flygtige karakter af ROS, er det vanskeligt at måle og overvåge ROS niveauer i levende dyr. Et minimalt invasiv metode til seriel kvantificering af ROS i levende mus er beskrevet.
Abstract
NADPH-oxidase er et kritisk enzym, som medierer antibakteriel og antifungal værtsforsvar. Ud over dets rolle i antimikrobielt værtsforsvar har NADPH-oxidase kritiske signaleringsfunktioner som modulerer det inflammatoriske respons 1. Således er udviklingen af en metode til måling i "real-time" kinetikken af NADPH oxidase-afledt ROS generation forventes at være en værdifuld forskning værktøj til at forstå mekanismerne er relevante at være vært forsvar, inflammation og skade.
Kronisk granulomatøs sygdom (CGD), er en arvelig sygdom af NADPH-oxidase er kendetegnet ved alvorlige infektioner og overdreven inflammation. Aktivering af fagocyt-NADPH-oxidase kræver translokation af de cytosoliske underenheder (P47 phOx, P67 phOx og p40 phOx) og Rac til et membranbundet flavocytochrome (bestående af en gp91 phOx og P22 phOx heterodimer). Tabaf funktion mutationer i nogen af disse NADPH oxidase komponenter resulterer i CGD. Svarende til patienter med CGD, gp91 phOx-deficiente mus og P47 phOx-deficiente mus har defekt fagocyt NADPH-oxidaseaktivitet og nedsat værtsforsvar 13, 14. Ud over fagocytter, som indeholder NADPH-oxidase ovenfor beskrevne komponenter, udtrykke en række andre celletyper forskellige isoformer af NADPH-oxidase.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til kvantificering ROS produktion i levende mus, og for at afgrænse bidrag NADPH-oxidase til ROS-generering i modeller for inflammation og skader. Denne metode er baseret på ROS omsætning med L-012 (en analog af luminol) til at udsende luminescens, der registreres af et charge-coupled device (CCD). I den oprindelige beskrivelse af L-012-proben, blev L-012-afhængig kemiluminescens fuldstændigt ophævet af superoxiddismutase, hvilket indikerer, at den største ROS påvist i denne reaktion var superoxid anion 15. Efterfølgende undersøgelser har vist, at L-012 kan detektere andre frie radikaler, herunder reaktive nitrogenforbindelser 16, 17. Kielland et al. 17 viste, at topisk anvendelse af phorbolmyristatacetat, en potent aktivator af NADPH-oxidase, førte til NADPH-oxidase-afhængig ROS-generering, der kunne påvises i mus under anvendelse af luminescerende probe L-012. I denne model, viste de, at L-012-afhængig luminescens blev afskaffet i P47 phOx-deficiente mus.
Vi sammenlignede ROS-generering i vildtype-mus og NADPH-oxidase-deficient P47 phOx-/ - mus 2 i de følgende tre modeller: 1) intratracheal administration af zymosan, en pro-inflammatorisk svampens cellevæg-afledt produkt, der kan aktivere NADPH-oxidase, 2) cecal ligering og punktering (CLP), en model af intra-abdominal sepsis med sekundær akut lunge-betændelse og skade, og 3) oral carbontetrachlorid(CCI4), en model af ROS-afhængig leverskade. Disse modeller blev specifikt udvalgt til at vurdere NADPH-oxidase-afhængig ROS-generering i forbindelse med ikke-infektiøs inflammation, polymikrobiale sepsis og toksin-induceret organ skade hhv. Sammenligning af bioluminescens i vildtype-mus til P47 phOx-/ - mus gør det muligt at afgrænse de specifikke bidrag ROS genereret af P47 phOx-holdig NADPH-oxidase til det bioluminescerende signal i disse modeller.
Bioluminescens billeddannelse resultater, der viste forøget ROS-niveauer i vildtype-mus sammenlignet med P47 phOx-/ - mus viste, at NADPH-oxidase er den vigtigste kilde til ROS-generering som respons på inflammatoriske stimuli. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en minimalt invasiv fremgangsmåde til "real-time" overvågning af ROS-generering under inflammation in vivo.
Protocol
1. Dyremodeller
- Mus: Brug P47 phOx-/ - mus og alder-og køn-matchede C57BL6/DBA mus. Opnå godkendelse af forsøg fra Institutional Animal Care og Use Udvalg.
- Anæstesi: Brug et kontinuerligt isofluran administration system til at fremkalde anæstesi. Fordamperen system (VetEquip) er fyldt med isofluran (2-3%). Bekræfter, at mus er fuldt bedøvet ved iagttagelse af respiration, bevægelse, og corneal refleks som reaktion på ydre stimuli.
- Kirurgiske procedurer: Skrub det kirurgiske område (benchtop) med 70% ethanol. Bær sterile handsker og en ren kirurgisk kjole og maske. Forbered musene ved klipning af håret og anvendelse Betadine skiftevis med 70% ethanol til området, hvor snittet skal foretages. Udføre kirurgi på en steril overflade og bruge sterile instrumenter. Monitor mus postoperativt indtil vågen og bevæger sig frit.
- Intratracheal zymosan administration
- Indgiv anæstesisom beskrevet i 1.2.
- Desinficere kirurgiske område (halsen) med betadin og 70% ethanol og blotlægge trachea ved kirurgisk dissektion.
- Pierce trachea med en 27-gauge nål og injicere zymosan (St. Louis, MO) i en dosis på 1 ug / g under anvendelse af en 0,5 ug / ul opløsning (totalvolumen 50 ul en 25 g mus) opløst i sterilt PBS.
- Luk mus hals viklet med 5-0 sterile silkesuturer under aseptiske forhold.
- Billede efter 4 timer og 24 timer.
- Cecal ligering og punktering
- Indgiv anæstesi som beskrevet i 1,2.
- Klippet hår på det kirurgiske område (underliv) og desinficere med betadin og 70% ethanol.
- Udfør en midtlinie laparotomi og identificere coecum.
- Ligere den distale 50% af eksponeret coecum med 4-0 silkesutur, og punktere cecum distalt for ligering med en passage af en 21-gauge nål.
- Lukke snittet med 4-0 sterile silkesuturer.
- Billede efter 4 timer og24 timer.
- Oral carbontetrachlorid (CCI4) administration
- Indgiv anæstesi som beskrevet i 1,2.
- Administrere CCI4 (2 ug / g, St. Louis, MO) opløst i majsolie ved oral sondeernæring. Proceduren for CCI4 administration bør foretages i et dertil indrettet område i overensstemmelse med IBC / EHS-politikker.
- Billede efter 4 timer og 24 timer.
2. Erhverve en Bioluminescent billede
- Initialiser IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, indstillet til luminescens mode, og vent på charge-coupled device (CCD) temperatur for at låse.
- Vælg eksponeringstid, binning (medium) og f / stop (8)-indstillinger.
- Sted mus i rygleje i den billeddannende kammeret på en opvarmet fase at opretholde normal kropstemperatur. Administrere anæstesi som beskrevet i 1.2 via næsekonus, mens mus i IVIS billeddannelse kammeret.
- Indgiv L-012 (20 ug / g) opløst i sterilt PBS (10 pg / pl) intravenøst via retroorbital injektion ved hvert tidspunkt valgt til billeddannelse.
- Tag billeder begynder ved 2 min efter L-012 injektion. Vi bruger typisk en 40 sek eksponering.
3. Dataanalyse med Region of Interest
- Analysere data ved hjælp Living Billede software v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
- Åbn et billede, og vælg måling af regionen af interesse værktøjer.
- Vælg Region of Interest form og størrelse på brystet og / eller maven efter overlejring af et pseudo-farvet digital image (som repræsenterer photon detektion) over et fotografisk billede af musen.
- Kvantificere signalintensitet (photon flux) fra regionen af interesse.
4. Statistik
- Brug statistisk analyse software pakke til at udføre to-vejs ANOVA med Bonferroni post-test på de enkelte tidspunkter.
Zymosan er et pro-inflammatorisk gærcellemembraner produkt og en potent aktivator af NADPH-oxidase 3. Vi har tidligere vist, at intratracheal zymosan inducerer en mere robust neutrofil lungebetændelse og pro-inflammatorisk cytokinproduktion i P47 phOx-/ - i forhold til vild-type mus 1. Her vores mål var at sammenligne ROS generation i lungerne hos vildtype og P47 phOx-/ - mus efter zymosan udfordring. Ved 4 timer efter intratracheal zymosan administration, observerede vi en signifikant stigning i fotonemission over brystet i vildtype-mus sammenlignet med basislinien og en forøgelse af fotonemission i vildtype sammenlignet med P47 phOx-/ - mus ved 4 timer og 24 timer. I modsætning hertil bioluminescens signaler i P47 phOx-/ - forblev musene på basisniveau ved 4 timer efter zymosan behandling (Fig.1 AB). Således NADPH-oxidase tilsyneladende be den største kilde til ROS-generering i lungerne efter zymosan administration.
Næste, vi vurderede ROS produktion i CLP-induceret sepsis model. Sepsis er en livstruende syndrom associeret med end-organ-skader, herunder akut lungeskade (ALI) og akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) 4, 5. ROS-medieret skade er blevet betragtet som en vigtig faktor, sepsis-induceret multi-organsvigt. Vi fandt, at ROS blev væsentligt forøget over brystet (4 timer), og over maven (24 timer) efter CLP i vildtype mus sammenlignet med baseline. Men ROS niveauer i P47 phOx-/ - mus svarede til baseline-niveau på begge tidspunkter (Fig.2 AC). Disse resultater viser, at ROS-generering i CLP-induceret sepsis musemodellen er NADPH-oxidase-afhængig.
Endelig brugte vi bioluminescerende billeddannelse til at opdage ROS produktion i et cci 4-induceret leverskade tilstandl. CCI4 forårsager hepatocellulær nekrose, og er blevet anvendt til at simulere både akut leverskade og leverfibrose 6. I modsætning til de tidligere beskrevne modeller for inflammation og skade, fandt vi, at ROS produktion i maven var moderat (ca. 35%) i forhold til basislinien i P47 phOx-/ - mus ved 4 timer efter CCI4 administration. Men størrelsen af CCl4-induceret ROS generation var signifikant større i vildtype-mus end i P47 phOx-/ - mus (Fig.3 AB). Disse data antyder, at både P47 phOx-holdig NADPH-oxidase-afhængige og-uafhængige ROS-generering forekommer i akut CCI4-induceret leverskade.
Fig. 1. ROS produktion i lungerne efter zymosan behandling. A) repræsentant bioluminescence billeddannelse af ROS produktion. Bemærk, at ud af thorax luminescensen er påviselig over maven i både vildtype-og P47 phOx-/ - mus og abdominal luminescens er uændret efter zymosan behandling. B) fotontællinger fra brystet af vildtype-og P47 phOx-/ - mus efter en enkelt intratracheal (IT) injektion med zymosan. Bioluminescens billeddannelse blev udført ved basislinie, 4 timer og 24 timer. Lysemission fra området af interesse over brystet blev identificeret ved anvendelse af angivne pseudo-farveskala. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SE, n = 6-9 per gruppe, * = p <0,05. her for større tal .
Figur 2. ROS detektion efter CLP. A) repræsentant bioluminescens billeddannelse af ROS produktion, B) Fotontællinger fra brystet, og C) fotontællinger fra maven af vildtype og P47 phOx-/ - mus ved baseline, 4 timer og 24 timer efter CLP. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SE, n = 4-5 per gruppe, * = p <0,05. her for større tal .
Figur 3. ROS produktion i maven efter cci 4-induceret leverskade. A) repræsentant bioluminescens billeddannelse af ROS produktion og B) fotontællinger fra maven af vild-type-og P47 phOx-/ - mus ved baseline, 4 timer og 24 timer efter oral CCl4 behandling. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SE. N = 4-5 per gruppe, * = p <0,05 her for større beløb
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
"Real-time" måling af reaktive oxygenarter (ROS) i levende dyr kan opnås ved anvendelse af fluorescerende og kemiluminescerende prober. Mens fluorescerende prober lider med svage signal-til-støj-forhold 12, den billeddannende beskrevne teknik er mere følsom til detektering af lysemission efter en kemisk reaktion af ROS med luminol-baseret substrat L-012. Som alle bioluminescerende billeddannelsesteknikker, er denne metode begrænses af bølgelængde-afhængig lys absorption og spredning af organer og væv. Disse eksperimenter blev fokuseret på at etablere ordentlige eksperimentelle betingelser for måling af ROS i vildtype og P47 phOx-/ - mus. Anvendelsen af disse genetisk modificerede mus gør det muligt at differentiere ROS genereret af P47 phOx-indeholdende NADPH-oxidase fra ROS genereret af andre veje.
Selv om funktionelle NADPH oxidase indeholdende P47 phOx eren væsentlig kilde til ROS, andre NADPH-oxidase isoformer findes, og yderligere ROS-frembringende systemer, herunder xanthinoxidase og mitokondriel respiration, kan producere ROS. NADPH oxidase og andre ROS-generering veje kan have vigtige og interaktive effekter på antimikrobielt værtsforsvar og downstream signalveje, der modulerer inflammation og skade 7-10. Anvendelse af bioluminescens billeddannelse, var vi i stand til at måle kinetikken af ROS produktion in vivo og for at afgrænse bidrag NADPH-oxidase til ROS-niveauer i forskellige inflammatoriske modeller.
En begrænsning ved denne fremgangsmåde angår rumlig opløsning af bioluminescens. Selvom vi kan måle luminescens inden for specifikke anatomiske rum (f.eks., Thorax, abdomen), er det vanskeligt at lokalisere det anatomiske område af luminescens på organniveau. I hver af vores eksperimentelle modeller vi valgte 3 tidspunkter for bioluminescerende målinger: baseline, 4 timer, og 24 timer. Vi ved ikke, om bioluminescerende billeddannelse kan identificere små forskelle i ROS generation end kortere intervaller af analysen, eller om forholdet mellem in vivo ROS produktion og bioluminescens er lineær. Disse spørgsmål kræver yderligere undersøgelser. I de modeller, der anvendes til disse undersøgelser, formoder vi, at fagocytceller, rekrutteret neutrofiler og makrofager, er primært ansvarlige for ROS produktion via den fagocyt NADPH oxidase system. Fremtidige undersøgelser, hvor bestemte celletyper er udtømte eller knogle kimærer genereres kunne give yderligere viden om de relative niveauer af ROS generation fra forskellige cellepopulationer. En anden potentiel begrænsning af undersøgelser under anvendelse af L-012 er, at andre radikaler (foruden ROS) kan reagere med det luminescerende probe, reducerer specificitet for ROS detektion i nogle tilfælde.
Efter zymosan injektion manglen på ROS produktion i P47 phOx-/ - mus viser, at NADPH-oxidase erDen største kilde til ROS i denne model af lungebetændelse. CLP er en af de mest almindelige dyremodeller for sepsis 11 og bioluminescens billeddannelse afslørede forøget ROS-signaler i både lungerne og maven, som var NADPH-oxidase-afhængig. I modsætning til zymosan og CLP-modeller blev ROS forøget i maven af både vildtype-og P47 phOx-/ - mus sammenlignet med basislinien, men i højere grad i vildtype-mus, hvilket indikerer, at CCI4 inducerer ROS produktion af P47 phOx - indeholder NADPH oxidase og andre mekanismer.
Sammenfattende viser vores data, at en luminol-baseret bioluminescens imaging metode til påvisning af ROS kan være værdifuldt værktøj til forskning i regulering og følgerne af ROS produktion in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH RO1 AI079253 og Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| Zymosan | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| carbon tetrachloride | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
References
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631 (2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
