在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。

摘要

小胶质细胞是属于骨髓细胞系并驻留在中枢神经系统（CNS）中的细胞¹这些细胞在与神经炎症相关的多种疾病的病理过程中发挥着重要作用，例如多发性硬化症（MS）。²在正常中枢神经系统中，小胶质细胞表达巨噬细胞标志物 CD11b，并通过低水平表达 CD45 等活化标志物而呈现静息表型。当中枢神经系统发生病理事件时，小胶质细胞被激活，表现为 CD45 及其他标志物的表达上调。³影响中枢神经系统中小胶质细胞表型和功能的因素尚未得到充分研究。微小RNA（miRNAs）是一类长度约22个核苷酸、不断扩展的保守分子家族，参与多种正常的生理过程，如细胞生长和分化。⁴ 以及炎症等病理状况⁵miRNA 通过与靶 mRNA 的互补序列结合，下调特定靶基因的表达，在包括巨噬细胞在内的天然免疫细胞活化过程中发挥重要作用⁶ 和小胶质细胞⁷为了研究定义小胶质细胞表型和生物学功能以及区分小胶质细胞与其他类型巨噬细胞的miRNA介导通路，对中枢神经系统（CNS）驻留小胶质细胞不同亚群中特定microRNA的表达水平进行定量评估至关重要。目前用于检测中枢神经系统中miRNA表达的常用方法包括对全脑组织进行定量PCR以及 原位 杂交。然而，对整个组织匀浆进行定量PCR无法评估小胶质细胞中miRNA的表达，因为小胶质细胞仅占神经组织细胞的5–15%。杂交 原位 可在组织切片中评估特定细胞类型内microRNA的表达，但该方法并非完全定量。本文报道一种定量且灵敏的方法，通过实时PCR检测从正常中枢神经系统（CNS）或实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种多发性硬化症的小鼠模型）诱导的神经炎症状态下分离的小胶质细胞中的miRNA。该方法可用于测量在正常中枢神经系统或与多种病理状态（包括多发性硬化症、脑卒中、创伤性损伤、阿尔茨海默病和脑肿瘤）相关的神经炎症过程中，小胶质细胞内microRNA的表达水平。

方案

1. 从正常中枢神经系统中分离小胶质细胞

小胶质细胞的分离按照先前所述方法进行修改后操作³。

1. 准备解剖和灌注所需的器械：剪刀、镊子、带有27G针头的10 ml注射器、15 ml Dounce匀浆器（特氟龙/玻璃）、40 μm尼龙细胞筛、40%和70% Percoll溶液、1X PBS。
2. 通过在CO₂麻醉舱中快速窒息（缺氧）处死小鼠，并立即转移至实验台进行手术操作和灌注。
3. 进行手术操作（使用剪刀和镊子，并以70%乙醇作为消毒剂）：切开腹腔，剪开膈肌，打开胸腔，并用剪刀剪开右心房。
4. 通过将10 ml注射器插入左心室并施加压力，进行全身心内灌注。以缓慢而稳定的速度将8–10 ml的1X PBS经血液循环灌注。
5. 对组内所有小鼠重复步骤1.2–1.4（通常为5–10只小鼠）。灌注完成后，将小鼠置于冰上，直至所有小鼠均完成灌注。
6. 所有小鼠灌注完成后，分离脑组织和脊髓。（可选：若需研究miRNA在脑不同区域的表达情况，可分别解剖5–10只小鼠脑中的特定区域，如小脑、海马等，并将组织合并后进行匀浆。）
7. 使用15 ml Dounce匀浆器匀浆脑组织和脊髓。将一只小鼠的脑组织和脊髓放入匀浆器中，加入5 ml 1X PBS，轻柔研磨10–20次；将匀浆液经细胞筛滤入50 ml锥形管中，在大离心机上以2000 rp....

讨论

近年来，小胶质细胞及其在与神经炎症和神经退行性病变相关多种病理过程中的作用受到广泛关注。此外，微小RNA（microRNA）在免疫细胞和癌细胞分化中的作用在过去几年中显著增加^5,10。我们此前已报道miR-124在维持正常中枢神经系统中小胶质细胞非活化或静息表型中的作用⁷，但其他类型微小RNA在小胶质细胞表型及活化状态中的作用仍有待揭示。这需要开发新的方法，以特异性检测小胶质细胞中微小RNA的表达水平。

小胶质细胞在实验中难以处理，因为它们从中枢神经系统（CNS）分离后会迅速活化并发生显著改变。此前已有文献发表过从正常中枢神经系统分离小胶质细胞的方案^11,12。尽管这些方案可用于RNA提取，但我们认为它们更适合mRNA表达分析，而不适用于microRNA表达的检测。首先，许多研究者采用对匀浆组织进行酶消化或磁珠分选纯化的方法，这些操作会激活小胶质细胞，导致microRNA表达发生显著变化（未发表观察结果）。其次，作者使用基于Trizol的方法提取RNA¹¹，而这种方法在处理少量小胶质细胞时，尤其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X PBS	GIBCO	14190	可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4
10X PBS	Thermo Scientific	SH30258.02	可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4
DMEM；FBS	GBCO	11965；10438
miRVana 试剂盒	Invitrogen	AM1561
Percoll	Sigma	P4937-500 ml	通过将10 ml 10X PBS与90 ml Sigma公司的Percoll混合，配制100 ml 100% Percoll。通过将35 ml 100% Percoll与15 ml DMEM混合，配制50 ml 70% Percoll。通过将20 ml 100% Percoll与30 ml 1X PBS混合，配制50 ml 40% Percoll
MOG35-55 肽	AnaSpec Inc	60130-5
CFA	DIFCO	263810
百日咳毒素	Sigma	P7208
FcR 封闭抗体	BD Biosciences	553142	克隆号 2.4G2
Anti-CD11b-PE 单克隆抗体	BD Biosciences	553311	可使用不同荧光染料（例如 AF488）标记
Anti-CD45-APC-Cy7 单克隆抗体	Biolegend	103116	可使用不同荧光染料（例如 APC）标记
多聚甲醛（16%）	EMS Inc	15710	用1X PBS按1:15稀释
15% TBE-尿素凝胶	Life Technologies Inc.	EC68855BOX
TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒	Life Technologies Inc	4366596
TaqMan 通用 PCR 主混合液	Life Technologies Inc	4304437
TaqMan MicroRNA 检测试剂 mmu-miR-124a	Life Technologies Inc	4427975 ID 001182
TaqMan MicroRNA 检测试剂 snoRNA-55	Life Technologies Inc	4427975 ID 001228
无核酸酶水	Life Technologies Inc	AM9937	无核酸酶水
384孔透明光学反应板	Life Technologies Inc.	4309849	可根据不同实时PCR仪器替换为其他规格板（例如96孔板）
Dounce 匀浆器（15 ml）	Wheaton Science Products.	358044	聚四氟乙烯/玻璃材质
40 μ 尼龙细胞筛	Falcon	352340
大型离心机	Sorval	RT 6000B	转子直径 18.5 cm
小型离心机	Eppendorf	5415 R	转子直径 6.5 cm
实时PCR仪	Life Technologies Inc.	AB 7900 HT	可替换为其他仪器
流式细胞仪	BD Biosciencess	LSR II	可替换为其他仪器
FACS	BD Biosciences	FACSAria	可替换为其他仪器
Nanodrop 分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop 1000