High-throughput screening for små-molekyl modulatorer av Inderlige likeretter kaliumkanaler

Summary

Metoder for å utvikle og validere en kvantitativ fluorescens analysen for å måle aktiviteten til indre likeretter kalium (Kir) kanaler for high-throughput sammensatte screening er presentert.

Abstract

Bestemte medlemmer av den innovervendte likeretter kalium (KIR) kanal familie er postulert stoffet mål for en rekke lidelser, inkludert hypertensjon, atrieflimmer, og smerte ^1,2. For det meste har imidlertid fremgang mot å forstå deres terapeutiske potensialet eller selv grunnleggende fysiologiske funksjoner blitt bremset av mangel på gode farmakologiske verktøy. Faktisk har den molekylære farmakologien innover likeretter familien ligget langt bak at av S4 superfamily av spenningsstyrte kaliumkanaler (Kv) kanaler, som en rekke nanomolar affinitet og svært selektive peptid toksin modulatorer har blitt oppdaget ^tre. Bee venom toxin tertiapin og dets derivater er potente inhibitorer av Kir1.1 og Kir3 kanaler ^4,5, men peptider er av begrenset bruk terapeutisk samt eksperimentelt grunnet deres antigene egenskaper og dårlig biotilgjengelighet, metabolsk stabilitet og vev penetrans. Utviklingen av potenteog selektive små-molekyl sonder med forbedrede farmakologiske egenskaper vil være en nøkkel til fullt ut å forstå fysiologi og terapeutiske potensialet i Kir-kanaler.

Molecular Libraries Sonder produksjon sentrum Network (MLPCN) støttet av National Institutes of Health (NIH) felles fond har skapt muligheter for faglig forskere å starte probe discovery kampanjer for molekylære mål og signalveier som har behov for bedre farmakologi ^6. Den MLPCN gir forskerne tilgang til industri-skala screening sentre og medisinsk kjemi og informatikk støtte for å utvikle små-molekyl sonder for å belyse genenes funksjoner og gen nettverk. Det kritiske i å få adgang til MLPCN er utviklingen av en robust mål-eller sti-spesifikk metode som er mottagelig for high-throughput screening (HTS).

Her beskriver vi hvordan du kan utvikle en fluorescens-basert thallium (Tl ⁺⁾ flux assay av Kir kanalfunksjon for high-throughput screening sammensatte ^7,8,9,10. Forsøket er basert på permeabiliteten av K ⁺ kanal pore til K ⁺ kongenerprofil Tl ^+. En kommersielt tilgjengelig fluorescerende Tl ⁺ reporter fargestoff brukes til å oppdage transmembrane fluks av Tl ⁺ gjennom pore. Det er minst tre kommersielt tilgjengelige fargestoffer som er egnet for Tl ⁺ flux analyser: BTC, FluoZin-2, og FluxOR ^7,8. Denne protokollen beskriver analysen utvikling ved hjelp FluoZin-2. Selv opprinnelig utviklet og markedsført som en sink indikator, FluoZin-2 viser en robust og doseavhengig økning i fluorescensemisjon på Tl ⁺ binding. Vi begynte å jobbe med FluoZin-2 før FluxOR var tilgjengelig ^7,8 og har fortsatt å gjøre det ^9,10. Men trinnene i analysen utvikling er i hovedsak identisk for alle tre fargestoffer, og brukerne bør avgjøre hvilken farge er mest hensiktsmessig for deres spesifikke needs. Vi diskuterer også analysen er ytelsestester som må nås for å bli vurdert for innreise til MLPCN. Siden Tl ⁺ lett gjennomtrenger fleste K ^+-kanaler, bør analysen kunne tilpasses de fleste K ⁺ kanal mål.

Protocol

1. Generasjon Stabile Polyklonale Cell Lines

1. Etableringen av en høy kvalitet stabil cellelinje som uttrykker Kir-kanalen i området er et viktig første skritt mot å utvikle en robust high-throughput screening-analysen. Konstituerende K ⁺ kanalen overexpression kan føre til aktivering av celledød, stabil cellelinje degenerasjon og tap av analyseytelsen. Å unngå disse potensielle problemer og gir en praktisk internkontroll for analysen utvikling (se nedenfor), er et tetracyklin-induserbare ekspresjonssystem anbefales ^8.
2. Kultur foreldrenes T-Rex-HEK293 celler ved hjelp av standard teknikker i B-medium (DMEM dyrkningsmedium inneholdende 10% FBS, 50 U / ml penicillin, 50 ug / ml Streptomycin og 5 ug / ml Blasticidin S). Bruk tidlig passasje celler (f.eks 3-4 passasjer siden tining fra flytende nitrogen lagring) for transfeksjon og stabil klone utvalg.
3. Plate 4000000 T-Rex-HEK293 celler i en75 cm ² kolbe slik at kolben er ca 80% konfluent følgende dagen. Kultur natten i en 5% CO ₂ inkubator ved 37 ° C.
4. Transfektere cellene ved hjelp 10-15 ug pcDNA5/TO-Kir DNA og Lipofectamine LTX / Plus reagens ifølge produsentens protokoll. Etter 5 timer, erstatte transfeksjon mediet med B-medium.
5. 24 timer etter den transfeksjon, erstatte B-medium med B-medium inneholdende 250 ug / ml Hygromycin (BH-medium) for å begynne stabil klone utvalg. Mate cellene hver 2-3 dager med frisk BH-medium.
6. Større enn 90% av cellene dør over de neste 7 dagene, etterlater små kolonier av stabilt transfekterte celler. Tillat koloniene å vokse ytterligere 10-14 dager før splitting til en 175 cm ² kolbe for ekspansjon.
7. For nedfrysing, fryse 3 x 10 ⁶ celler / ml i media inneholdende 45% conditioned BH-medium, 45% antibiotika-fri, serum-inneholdende DMEM og 10% DMSO. Fryscellene natten ved -80 ° C i en celle frysing beholder, og deretter flytte til flytende nitrogen for langtidslagring. Tine celler fra flytende nitrogen ved hjelp Invitrogen anbefalte protokoll. Merk at levedyktigheten av cellene vil bli lavere hvis de er frosne fra en kolbe som er større enn 75% konfluent på tidspunktet for behandlingen.

2. Generasjon Stabile Monoklonale Cell Lines

1. Vaske en sub-confluent 75 cm ² kolbe stabile polyklonale celler med toverdig-frie HBSS. Tilsett 1 ml av trypsin og inkuber i 3-5 minutter i en 5% CO ₂ inkubator ved 37 ° C. Tilsett 5 ml av BH-medium til kolben til å hemme trypsinaktivitet og triturate gjentatte ganger (f.eks 5 ganger) for å fullstendig dissosiere cellene. Nøye inspisere cellene under et mikroskop for å sikre at suspensjonen består nesten utelukkende av enkeltceller. Dette vil øke sannsynligheten for å skaffe monoklonale cellelinjer.
2. Bestem celletetthet og fortynnsuspensjonen til en konsentrasjon på 0,7 celler pr 20 ul. Ved hjelp av en multi-kanals pipetten, 20 pipette ul av cellesuspensjonen i hver brønn av BD PureCoat amin-belagt (eller tilsvarende poly-D-lysin belagt) 384-brønners plater. I prinsippet bør 70% av brønnene motta en celle med disse plating forhold. Derfor bør en 384-brønners plate inneholder mer enn 200 kloner å analysere. Fortsett dyrking cellene i en 5% CO ₂ inkubator ved 37 ° C.
3. Etter en uke, inspisere platene under et mikroskop for brønner inneholdende enkle kolonier. Oppmerksom på deres posisjon på lokket med en permanent markør for fremtidig referanse. Pass på å også oppmerksom og inkluderer brønner som inneholder flere kolonier. Disse er mest lett gjenkjent av utseendet av kolonier vokser fra flere sider av brønnen. Vær oppmerksom på at fordampning tendens til å oppstå raskere fra brønner nær kanten av platen. Legg BH-middels til brønner hvor betydelig fordampning har oppstått. Ellers er det unødvendig to mate cellene.
4. Overvåke brønnene oftere i løpet av de neste 7-10 dager. Cellene vil være klar til å splitte når brønnene av interesse er minst 50% konfluent.
5. Splitte cellene å duplisere 384-brønners plater, en plate for bestemmelse med Tl ⁺ fluks og den andre for å fortsette de monoklonale linjer i kultur. Aspirer mediet fra brønnene inneholdende cellelinjene av interesse. Vask cellene med toverdige-frie HBSS, tilsett 20 ul av trypsin til hver brønn og overføre platen til en 37 ° C inkubator i 15-20 min. Etter flytting av platen tilbake til cellekultur hette, tilsett 20 ul til BH-medium til hver brønn og triturate flere ganger for å dissosiere cellene. Inspisere brønnene under et mikroskop for å sikre at cellene er fullstendig dissosiert. Dette kan kreve flere runder med pipettering, som cellene vil være tett tilhenger. Når cellene er dissosiert, overfør 10 pl av hver cellesuspensjon for å duplisere brønner i en ny BD PureCoat amin-belagt 384-brønns plate. Være sikker på å merke seg sammenhengen mellom kilden godt og duplisere destinasjon brønner slik at kloner utviser robuste Kir kanal aktivitet (se nedenfor) kan spores tilbake til den opprinnelige brønnen. Tilsett 20 pl av BH-medium til den opprinnelige kilden godt å mate de gjenværende cellene og viderefører dem i kultur i 5% CO ₂ inkubator ved 37 ° C.
6. La cellene i bestemmelsesstedet plate å overholde og vokse i opptil en uke. Når de fleste av de kloner være på minst 50% konfluens, kan de bli vurdert for Kir kanalaktivitet bruker Tl ⁺ flux analysen beskrevet nedenfor.
7. Dagen før analysen, aspirer kulturmediet og erstatte den med BH medium inneholdende 10% dialysert FBS. Dette hindrer utilsiktet kanal uttrykk som kan oppstå fra tetracyklin forurenset serum. Induser Kir kanal ekspresjon i bare én av de duplikatbrønner for hvert klon ved å inkludere 1 ug / ml tetracyklin. Den duplikat uninduced Brønnen vil tjene som en"Bakgrunn" kontroll. Utfør Tl ⁺ flux analyser som beskrevet neste.

3. Generell Tl ⁺ Flux Analyseprosedyre

1. Dagen før en Tl ⁺ flux eksperimentet, distansere cellene og kvantifisere tettheten av cellesuspensjonen som beskrevet i avsnitt 2.1 og 2.2. Plate 20000 monoklonale celler stabilt transfektert med en Kir-kanal gen av interesse i hver brønn av en BD PureCoat amin-belagt 384-brønners plate med en Thermo Multidrop Combi eller en multi-kanal pipetten. Bruk BH medium inneholdende 10% dialysert FBS for plating. Merk at noen celler vil bli dyrket over natten med 1 ug / ml tetracyklin for å indusere Kir kanal uttrykk, mens andre vil ikke. Plasseringen av induserte og uninduced cellene vil variere for hver type eksperiment og er vist i Figur 1.
2. Neste dag, inspisere platene under et mikroskop for å sikre at cellene er vedheftende og jevnt fordelt over bunnenav brønnene. Brønnene skal være 80-90% confluent.
3. Bruk en ELx405 mikrotiterplatevasker å erstatte cellekulturmedium med 20 pl pr brønn av HBSS analysebuffer inneholdende 20 mM HEPES og bufret til pH 7,3 med NaOH. Alternativt kan man bruke en "flick og slam"-metoden, hvor platen er invertert og klikket ned kraftig for å løse ut mediet i en avfallsbeholder, og deretter klappet inn stablet papirhåndklær for å fjerne de gjenværende media. Straks legge tilbake HBSS analysebuffer til platen for å forhindre cellene fra desiccating.
4. Forbered FluoZin-2, AM dye lasting løsning. Etter kort sentrifugering røret, oppløse 50 ug FluoZin-2 pulver i 100 ul vannfritt DMSO. På dette punktet, kan alikvoter av 1000 x stamoppløsningen lagres ved -20 ° C for senere bruk. Når ferdig til bruk, tilsett 50 pl av en 20% vekt pr volum Pluronic F-127/DMSO løsningen til fargestoff og bland med forsiktig pipettering. Ikke frys fargestoff gang Pluronic F-127 har blitt lagt til, somlav temperatur kan føre til det overflateaktive å utfelle fra oppløsningen. Tilsett 150 pl volum FluoZin-2, AM/Pluronic-F127 til 100 ml HBSS analysebuffer og bland forsiktig å gjøre fargestoffet lasting buffer. Ved hjelp av en Multidrop Combi eller flerkanals pipetten, legge til 20 pl fargestoff lasting buffer til hver brønn allerede inneholder 20 pl HBSS analysebuffer. Inkuber cellene ved romtemperatur i omtrent 1 time (typisk inkubering har blitt gjort i mørket, men det er ingen direkte bevis på at det er nødvendig).
5. Mens cellene legger med fargestoff, utarbeide en Tl ⁺ stimulans plate. Fersk oppløse 0,5 g natrium-bikarbonat i 50 ml av 5x Tl ⁺ stimulans buffer inneholdende 1 mM magnesiumsulfat, 1,8 mM kalsium-sulfat, 5 mM glukose, 10 mM HEPES og 12 mM Tl ⁺ sulfat. Alternativt kan natriumbikarbonat erstattes med natriumglukonat dersom, for eksempel, må løsningen pH holdes innenfor et meget smalt område og tap av karbondioksider en bekymring. Cap røret tett å begrense utslipp av karbondioksid og invertere flere ganger til natriumbikarbonat går i løsning. Ved hjelp av en multi-kanal pipetten, tilsett 50 pl av løsningen til hver brønn av en polypropylen 384-brønners plate (Tabell 1).
6. Etter at cellene er blitt lastet med FluoZin-2, AM, vaske platene med en ELx405 mikrotiterplatevasker eller ved hjelp av "flick og slam"-metoden, som beskrevet ovenfor i seksjon 3.3. Avhengig av typen av Tl ⁺ fluks eksperiment som skal utføres, legge tilbake 20 ul eller 40 pl HBSS analysebuffer til hver brønn. Platene er nå klar for eksperimenter.
7. Cellen og Tl ⁺ platene i en Hamamatsu Funksjonell Drug Screening System (FDSS) eller tilsvarende kinetisk bildebehandling plate leseren med integrerte flytende dispensering evner. Bruk egnede filtre for fluorescein / fluorescein-baserte fargestoffer som Fluo-4.
8. Sette opp en enkelt-add-protokollen slik at 10 ul den 5x Tl ⁺serien er tilsatt til de tilsvarende brønner i cellen plate inneholdende 40 pl HBSS analysebuffer. Record baseline fluorescens ved 1 Hz samplingfrekvens minst 10 sek. Godt-til-brønn fluorescens bør være ensartet og stabil over platen en gang optimal celle plating, vask og fargestoff belastningsforhold er etablert. En integrert 384-kanals pipetten brukes til samtidig legge Tl ⁺ stimulans buffer til hver brønn.
9. Posten for minst 2 minutter, slik at hastigheten og toppen av Tl ^+-indusert økning i fluorescens fanges for off-line-analyse.

4. Bestemmelse av Optimal Tl + Konsentrasjon

1. Tl ⁺ gjennomsyrer lett mest innover likeretter K ^+-kanaler. For å sikre at Tl ⁺ konsentrasjon ikke overstiger det dynamiske området av Tl ⁺ reporteren dye FluoZin-2, bør en empirisk å bestemme den optimale Tl ⁺ konsentrasjon som skal brukes i en høy-throughput skjermen. Vi anbefaler en Tl ⁺ konsentrasjon som fremkaller 80% av den maksimale respons fluorescens (EC ₈₀₎ under betingelser hvor kanalen er maksimalt aktivert.
2. Plate, fargestoff last og vaske cellene i BD PureCoat amin-belagte eller tilsvarende poly-D-lysin-belagte 384-brønns plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 3, forlater 40 pl HBSS analysebuffer i hver brønn. Som vist i platen kartet i figur 1A, kolonne 1 og rader A1-A23 bør inneholde celler som ikke har blitt indusert med tetracyklin og derfor ikke uttrykke Kir kanalen av interesse. De FluoZin-2 fluorescens signaler fra de uninduced brønnene vil bli benyttet for å bestemme nivået av Tl ⁺ fluks gjennom endogene reaksjonsveier, slik som Na ⁺ - K ^{+-ATPase-pumpe} og spenning gated K ^+-kanaler, som er normalt uttrykt i HEK- 293 celler.
3. Bruk en Agilent Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuell pipettering å utarbeide enelleve-punkts Tl ⁺ konsentrasjon fortynningsserie i HBSS analysebuffer. Vanligvis er en 3-ganger seriell fortynning serie strekker seg fra 100% til 0,002% Tl ⁺ evaluert i analysen. Serien bør sammensettes ved en 5x konsentrasjon fordi Tl ⁺ løsninger vil bli fortynnet i forholdet 1:5 i den endelige analysen. Klargjør fortynningsserie ved fortynning av standardløsning 5x Tl ⁺ buffer beskrevet i pkt. 3 med en 5x Tl ^+-fri buffer inneholdende 1 mM magnesiumsulfat, 1,8 mM kalsium-sulfat, 5 mM glukose og 10 mM HEPES. Igjen, ferskt oppløse 0,5 g natrium-bikarbonat i 50 ml av den endelige Tl ⁺ buffer umiddelbart før plettering i et polypropylen 384-brønners plate i samsvar med platen kart vist i figur 2A.
4. Last cellen og Tl ⁺ stimulans plater i FDSS. Sette opp en enkelt-add protokollen slik at 10 pl 5x Tl ⁺ series er lagt til de tilsvarende brønner i cellen plate inneholdende 40 ul HBSS analysebuffer. Record baseline FluoZin-2 fluorescens for 10 sek før tilsetning Tl ⁺ til plate. Gjenta eksperimentet på 3 separate dager å etablere reproduserbarheten av resultatene.

5. Bestemmelse av Assay Sensitivity til DMSO

1. De små molekyler avhørt i en high-throughput skjerm oppløses i det organiske løsningsmiddel dimetylsulfoksyd (DMSO), som i seg selv kan påvirke ytelsen til analysen. Derfor må analysen følsomhet for DMSO første bli undersøkt for å etablere den høyeste DMSO konsentrasjonen tillatte i skjermen.
2. Plate, fargestoff last og vaske cellene i BD PureCoat amin-belagt 384-brønns plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 3, forlater 20 pl HBSS analysebuffer i hver brønn. Hele platen skal inneholde celler som har blitt indusert med tetracyklin (Figur 3A).
3. Bruk en Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuell pipettering å forberede en elleve-punkt DMSO konsentrasjon fortynningsserie i HBSS analysebuffer. Vanligvis er en 2-gangers fortynning serie strekker seg fra 10% til 0,01% v / v DMSO evaluert for aktivitet i analysen. Serien bør gjøres opp på en 2x konsentrasjon fordi DMSO løsningene vil bli fortynnet til det halve i den endelige analysen. Fortynningen serien skal bli belagt i en polypropylen 384-brønners plate, i henhold til platen kart vist i figur 3A.
4. Utarbeide en 5x Tl ⁺ stimulans plate basert på EC ₈₀ eller optimal Tl ⁺ konsentrasjonen fastsatt i § 4.
5. Last cellen, DMSO og Tl ⁺ stimulans plater i FDSS. Sette opp en to-add protokollen slik at 20 pl av den 2x konsentrasjon DMSO series er lagt til de tilsvarende brønner i cellen plate inneholdende 20 pl HBSS analysebuffer. La DMSO på cellene for samme tidsperiode cellene vil bli utsatt for lite molekyl kjøretøyet under en skjerm. Record baseline FluoZin-2 fluorescens for atminst 10 sek før tilsetning 10 pl 5x Tl ⁺ buffer til hver brønn av cellen plate. Gjenta eksperimentet på 3 separate dager å etablere reproduserbarheten av resultatene.
6. Analysen må være tolerant å DMSO konsentrasjoner på minst 0,1% v / v for en typisk høy-throughput skjermen der forbindelsene testet ved en konsentrasjon på 10 uM.

6. Bestemmelse av Assay Sensitivity til kjente farmakologiske Modulatorer

1. Etter å ha bestemt den optimale Tl ⁺ konsentrasjon og DMSO toleranse av analysen, virkningene av kjente farmakologisk aktive midler på Kir-medierte Tl ⁺ fluks bør undersøkes. Denne serien av eksperimenter vil vurdere analysen sensitivitet, evne til rang-etter forbindelser basert på deres potens, evne til å kategorisere forbindelser basert på deres modus av effekt (f.eks aktivator, inhibitor), og identifisere veldresserte kontroll forbindelser som skal brukes senere i analysen development og skjerm.
2. Plate, fargestoff last og vaske cellene i BD PureCoat amin-belagt 384-brønns plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 3, forlater 20 pl HBSS analysebuffer i hver brønn. Kolonne 1 og radene A1-A23 bør inneholde celler som ikke har blitt indusert med tetracyklin (figur 4A).
3. Bruk en Bravo Automated Væskehåndtering Platform eller manuell pipettering å forberede en elleve-punkts konsentrasjon fortynningsserie kjente modulatorer i HBSS analysebuffer. Vanligvis er en 3-ganger fortynning serie fra 100 uM til 2 nM evaluert for aktivitet i analysen. Serien bør gjøres opp på en 2x konsentrasjon fordi DMSO løsningene vil bli fortynnet til det halve i den endelige analysen. Fortynningen serien skal bli belagt i triplikat i en polypropylen 384-brønners plate, i henhold til platen kart vist i figur 4A. Være sikker på at fortynninger blir laget slik at den endelige DMSO konsentrasjonen er den samme mellom medikamentell behandling og mindre tha n eller lik den maksimale tillatte DMSO konsentrasjonen definert i avsnitt 5.
4. Utarbeide en 5x Tl ⁺ stimulans plate basert på den optimale Tl ⁺ konsentrasjonen fastsatt i § 4.
5. Last cellen, sammensatte og Tl ⁺ stimulans plater i FDSS. Sette opp en to-add protokollen slik at 20 pl 2x konsentrasjon sammensatte series er lagt til de tilsvarende brønner i cellen plate inneholdende 20 pl HBSS analysebuffer. Legg forbindelsene til cellen plate og inkuberes i opptil 20 min. Merk at den optimale inkubasjonstid for forbindelsene å detektere det beste signalet til bakgrunn forholdet kan bestemmes ved å kjøre en serie eksperimenter hvor par forskjellige inkubasjonstider velges. Record baseline FluoZin-2 fluorescens for minst 10 sekunder før tilsetning av 10 ul 5x Tl ⁺ buffer til hver brønn av cellen plate. Gjenta eksperimentet på 3 separate dager å etablere reproduserbarheten av resultatene.

_title "> 7. Checkerboard Analyse

1. I den neste serie av eksperimenter, vil jevnheten og reproduserbarheten til analysen evalueres av et "sjakkbrett" analyse. Vanligvis er en kontroll-inhibitor belagt i annenhver godt av hver kolonne og rad i en 384-brønners plate, som vist i figur 5A. Å strengt vurdere støy i analysen, bør en EC ₈₀ konsentrasjon av inhibitor brukes. DMSO tilsettes til de andre brønner som en kjøretøy kontroll. Tl ⁺ flux i DMSO-og narkotika-behandlede celler brukes til å beregne en verdi for Z prime, et statistisk mål på brønn-til-brønn variasjon mellom de to bestandene av brønner. Z prime beregnes ved hjelp av formelen:
   Z prime = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | bety _p + betyr _n |
   hvor SD er standardavvik, er p hemningsløs fluks og n er fullt hemmet flux verdier. Analysesett med Z 'verdier større enn eller lik 0,5 for 3 separate dager regnes suitable for high-throughput screening.
2. Plate, fargestoff last og vaske cellene i BD PureCoat amin-belagt 384-brønns plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 3, forlater 20 pl HBSS analysebuffer i hver brønn. Oppmerksom på at hele platen bør induseres med tetracyklin.
3. Lag en forbindelse / DMSO plate ved pipettering i en 384-brønners plate med en polypropylen flerkanals pipetten, 80 ul / brønn av en kjent inhibitor av målet Kir kanal på konsentrasjonen bestemmes i avsnitt 6.5, og 0,1% v / v DMSO kjøretøy som vist i figur 5A. Legg den kjente inhibitor starter i brønn A1 med flerkanals pipetten og alternativ til godt B2 og så videre opp til godt B24. Gjenta denne prosedyren med DMSO starter i godt B1 og så videre opp til godt A24. Den endelige utformingen av platen skal matche det av en sjakkbrett.
4. Utarbeide en 5x Tl ⁺ stimulans plate basert på den optimale Tl ⁺ bestemt i § 4.
5. Last cellen, sammensatte og Tl ⁺ stimulus plater i FDSS. Sette opp en to-add protokollen slik at 20 pl 2x konsentrasjon sammensatte series er lagt til de tilsvarende brønner i cellen plate inneholdende 20 pl HBSS analysebuffer. Legg forbindelsene til cellen plate og inkuberes i opptil 20 minutter ved romtemperatur. Record baseline FluoZin-2 fluorescens for minst 10 sekunder før tilsetning av 10 ul 5x Tl ⁺ buffer til hver brønn av cellen plate. Gjenta eksperimentet på 3 separate dager å etablere reproduserbarheten av resultatene.

8. Pilot Screen

1. I sluttfasen av analysen utvikling, utfør en pilot skjerm på noen få tusen forbindelser å evaluere analysen ytelse under forhold som vil bli brukt til slutt i storskala high-throughput skjerm.
2. Plate, fargestoff last og vaske cellene i BD PureCoat amin-belagte 384-brønns plater som beskrevet ovenfor i avsnitt 3), forlater 20 pl HBSS analysebuffer i hver brønn.Merk at hele platen skal dyrkes over natten med tetracyklin for å indusere Kir kanal uttrykk.
3. Velg lag 2000 til 3000 strukturelt ulike forbindelser som skal prøves. Det er ofte hensiktsmessig og praktisk å bruke forbindelser samlinger med kjente aktiviteter potensielt beriket for ionekanal modulatorer. Slike samlinger omfatter Spectrum Collection (MicroSource) og LOPAC samling (Sigma). I tillegg, er det klokt å inkludere kjente modulatorer av Kir av interesse i piloten skjermbildet. Ideelt disse forbindelsene vil bli lagt til brønner i en blindet måte for å gi en objektiv testing av den populære plukke metodene som er beskrevet senere. Fremstille forbindelsene i 384-brønners plater (polypropylen destinasjon plater) ved hjelp av en Labcyte Echo Flytende Handler eller egnet pin verktøyet til å overføre et egnet volum av utvalgte forbindelser i DMSO fra MLPCN samlingen (kilde plater) til destinasjonen platene Merk at testforbindelsene er bare i kolonner 3-22;I annenhver brønn av kolonnene 1, 2, 23, 24 til en kjent inhibitor ved en konsentrasjon kjent for å fullt hemme Kir som bestemt i § 7. I de resterende brønner kolonnene 1, 2, 23, og 24 legge til riktig volum av DMSO for å produsere DMSO konsentrasjonen-matchet kjøretøy kontroller. Fortynn alle brønner med Assay Buffer med Multidrop Combi. Vanligvis testforbindelser blir 20 uM, 2-fold ovenfor målet screening konsentrasjon.
4. Gjør Tl ⁺ stimulans plater basert på den optimale Tl ⁺ konsentrasjonen fastsatt i § 4.
5. Utfør pilot skjermen. Ta vare å forbløffe trinn i protokollen henrettelse å opprettholde konsistent timing mellom platene i pilot screening løp.
6. Når piloten skjermbildet er fullført, analysere dambrett brønner fra kolonnene 1, 2, 23, og 24 ved hjelp av Z-prime ligningen. Inspisere platene som viser Z-prime verdier på mindre enn 0,5 for å bestemme kilden til dårlig separasjon av kontroll populasjoner. Hits kan be valgt å bruke en rekke metoder. For pilot skjermer er det vanlig å beregne gjennomsnitt og standardavvik av kjøretøyet kontroll befolkningen og plukke treff basert på brønner verdier> / = 3 standardavvik fra gjennomsnittet av bilen kontrollene.
7. Etter hit plukking, retest utvalgte treff i to eksemplarer i 2 sett med plater. Ett sett med plater inneholder stabile Kir cellen i fravær av tetracyklin og den andre inneholder den stabile Kir cellelinje i nærvær av tetracyklin. Treff som retest positiv i minst ett av de to retest platene og ikke klarer å vise betydelig aktivitet i uninduced platene kan vurderes verifisert treff. Undersøke bekreftet trefflisten for å avgjøre hvor mange av de "skjulte" kontrollprøvene ble oppdaget. Unnlatelse av å oppdage kontrollene i pilot-skjermen indikerer behovet for ytterligere optimalisering av screening eller hit-plukking parametere.

Representative Results

Bruken av en tetracyklin-induserbare ekspresjonssystem gir en praktisk internkontroll for skille Tl ⁺ fluks gjennom endogene trasé og Kir kanal av interesse. Figur 1 viser noen eksempler på celle plating kartene som brukes i forskjellige typer av eksperimenter. Posisjonene til brønner inneholdende uninduced eller tetracyklin-indusert celler er angitt med forskjellige farger. Figur 2A viser kilden plate kart brukes til å bestemme den optimale Tl ⁺ konsentrasjon for analysen utvikling og sammensatte screening. Fargen gradient representerer 3-ganger fortynning serie strekker seg fra 100% til 0,002% Tl ^+. En representant fluorescensintensitet kart er vist i figur 2B, med kule-til-varme farger indikerer lav-til-høy Tl ⁺ flux verdier, henholdsvis. Cellen Plating kart vist i figur 1C ble brukt for dette eksperiment. En tilpasning av en 4-parameter logistikk funksjon til than Tl ⁺ CRC (Figur 2C) blir brukt for å bestemme en EC ₈₀ verdi på 15% Tl ^+. Fig. 3A viser kilden plate kart brukes til å bestemme den DMSO toleranse av et assay. Kolonne 1 og 24 inneholder analysebuffer bare, mens fargen gradient angir to-gangers fortynning serie strekker seg fra 10% til 0,01% DMSO. En representant fluorescensintensitet kart er vist i Figur 3b, med lave Tl ⁺ flux verdier angitt med mørkere blå. Cellen Plating kart vist i figur 1B ble brukt i dette eksperimentet. Gjennomsnittlig Tl ⁺ flux målte fra brønner inneholdende de indikerte konsentrasjoner av DMSO er oppsummert i figur 3C. Dataene er plottet som prosentandelen av Tl ⁺ fluks nedtegnet i fravær av DMSO. For denne bestemte Kir kanalen hadde DMSO konsentrasjoner opptil 2,5% ingen effekt på Tl ⁺ fluks og kan derfor brukes i eksperimenter. Figure 4A viser kilden plate kart brukes til å etablere konsentrasjon-responskurvene for kjente inhibitorer av en Kir kanal. Hver forbindelse er angitt med en annen farge, og er vanligvis belagt som en 3-gangers fortynning serie. En representant fluorescensintensitet kart er vist i figur 4B. Cellen Plating kart vist i figur 1C ble brukt for dette eksperiment. Et representativt eksperiment som viser doseavhengig inhibering av Tl ⁺ fluks av en inhibitor er vist i figur 4C. Robusthet av et assay bestemmes i såkalte "Sjakkbrett" analyser, som er oppsummert i figur 5.. I kilden plate kart vist i figur 5A, er en maksimalt effektiv konsentrasjon av en inhibitor eller 0,1% DMSO som en kjøretøy kontroll er belagt i vekslende brønner. Figur 5B viser et representativt fluorescensintensitet kart. Et spredningsdiagram av peak Tl ⁺ flux registreres fra individeral brønner er plottet i Figur 5C. De gjennomsnittlige fluorescens verdiene er angitt med heltrukket linje, mens tre standardavvik er angitt med en stiplet linje. Z prime verdi, et statistisk mål på hvor godt skilt de to cellepopulasjoner er separert, beregnet for denne platen er 0,75, noe som er godt over 0,5 terskelen kreves for high-throughput screening.

Figur 1. Cell plating over brukes for Tl ⁺ flux analysen utvikling. (A) Cell plating kart bruker for å bestemme den optimale analysen Tl ⁺ konsentrasjon. Brønnene i kolonne 1, rader A1-23, K1-12, F13-23, og P13-23 inneholder uninduced celler (-Tet). De resterende brønnene inneholder celler som ble behandlet med tetracyklin (+ Tet) å indusere Kir kanal uttrykk. (B) Cell plaTe kartet bruk å bestemme analysen DMSO toleranse og utføre dambrett analyse. Merk at alle brønnene behandlet med tetracyklin (+ Tet). (C) Cell plate kart brukes til å bestemme målemetodens sensitivitet til kjente farmakologiske modulatorer. Brønnene i kolonne 1 og rad A1-23 inneholder uninduced celler (-Tet). De resterende brønnene inneholder celler som ble behandlet med tetracyklin (+ Tet). Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Bestemmelse av optimal assay Tl ⁺ konsentrasjon. (A) Kilde plate kart brukes til å bestemme Tl ⁺ konsentrasjon som fremkaller 80% av den maksimale FluoZin-2 fluorescens økning (EC _80). Rad og COLUMns 1 og 24 (gul) inneholde en 5x konsentrasjon av 12 mM Tl ₂ SO _4. De resterende radene inneholder en 3-ganger fortynning serie strekker seg fra 12 mm (100%) til 0,024 mM (0,002%) Tl ₂ SO _4. Serien er gjentatt i kolonne 2-12 og 13-23. (B) fluorescensintensitet kart skildrer Tl ⁺ fluks for hver brønn omtrent 1 min etter TL ⁺ tillegg. Pseudo-farge på høyre side viser omfanget av Tl ⁺ flux, med kjøligere og varmere farger som representerer lav og høy flux verdier, henholdsvis. Merk at de kjøligere farger i kolonne 1, rader A1-23, K1-12, F13-23, og P13-23 er på grunn av lav Tl ⁺ flux i uninduced celler. De resterende brønner, inkludert de i kolonne 24, inneholder celler som ble behandlet med tetracyklin for å indusere Kir kanal uttrykk (se celle Plating kart i figur 1A). (C) Gjennomsnitt ± SEM CRC for Tl ^+-avhengige endringer i fluorescens (n = 3). Passer til en fire-parameter logistikk funksjon til dataene ga en IC ₈₀ på 15% Tl ^+. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Assay toleranse for DMSO. (A) Kilde plate kart brukes til å bestemme assay toleranse for DMSO. Kolonne 1 og 24 inneholder HBSS analysebuffer. Radene inneholder en 2x konsentrasjon av en 2-fold DMSO fortynningsserie fra 10% til 0,01% v / v. (B) Representative fluorescensintensitet kart skildrer Tl ⁺ fluks i hver brønn registrert omtrent 1 min etter TL ⁺ tillegg. Pseudo-farge på høyre side viser omfanget av Tl ⁺ flux, med kjøligere og varmere farger som representerer lav og høy flux verdier, henholdsvis. (C) Mean ±; SEM (n = 9) Tl ⁺ fluks normalisert til som registrert i nærvær av HBSS analysebuffer alene. Klikk her for å vise større figur .

Figur 4. Assay følsomhet til kjente farmakologisk aktive forbindelser. (A) Kilde plate kart brukes til å vurdere aktiviteten av kjente farmakologisk aktive forbindelser i Tl ⁺ flux assay. Ro en og kolonner 1 og 24 inneholder 0,1% v / v DMSO. Platen oppsettet tillater testing av 10 forbindelsene i triplikat i kolonnene 2-23. Radene inneholder en 2x konsentrasjon av en 3-ganger seriell fortynning serie forbindelser som strekker seg fra 100 uM til 2 nM (B) fluorescensintensitet kart skildrer Tl ⁺ fluks for hver brønn approximately 1 min etter Tl ⁺ tillegg. Pseudo-farge på høyre side viser omfanget av Tl ⁺ flux, med kjøligere og varmere farger som representerer lav og høy flux verdier, henholdsvis. Vær oppmerksom på at brønner i kolonne 1 og rad A1-23 inneholder uninduced celler. De resterende brønnene inneholder tetracyklin-induserte celler som uttrykker Kir kanalen av interesse (Se celle plate kart i Figur 1C). (C) Representative Tl ^+-induserte endringer i FluoZin-2 fluorescens i brønner forbehandles med den indikerte konsentrasjon av en Kir kanal inhibitor. Klikk her for å vise større figur .

Figur 5. Bestemmelse av analysen egnethet for HTS. (A) Kilde platekart brukes til å evaluere den brønn-til-brønn variasjon blant brønner inneholdende 0,1% DMSO (kjøretøy) eller en maksimalt effektiv konsentrasjon av en kjent inhibitor. (B) fluorescensintensitet kart skildrer Tl ⁺ fluks i hver brønn ca 1 min etter TL ⁺ tillegg. Legg merke til at alle brønner inneholder tetracyklin-induserte celler uttrykker Kir kanal av interesse (Se celle plate kartet i figur 1B). (C) Representative spredningsdiagram av steady-state fluorescens verdier hentet fra kjøretøy-eller hemmer behandlet brønner. Gjennomsnittlig fluorescens amplitude for hver prøve befolkningen er markert med en heltrukket linje, er tre standardavvik fra gjennomsnittet vist med en stiplet linje, og vekslende prøver for kjøretøy (VHL) og hemmer (INH) er grafisk som enkelte punktene. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Data behandling: Etter at data blir samlet inn, innebærer en vanlig trinn i analysen normalisere hver brønnens fluorescens respons, F, til sin opprinnelige verdi ved begynnelsen av eksperimentet, ₀ F. Dette er ofte referert til som "statiske ratio" og symbolisert "F / F ^_0". I tilfeller der F ₀ er dominert av indikatoren fargestoff den statiske ratio operasjonen vil vesentlig korrigere for mange faktorer som disuniformities i belysning, signal samling, og celle nummer. I tilfeller der fargestoff signalet er svakt eller bakgrunnsfluorescens eller refleksjoner i systemet er høye, vil det statiske forholdet ikke være effektiv med mindre bakgrunnen kan behandles på tilsvarende måte før beregning av statiske forhold. Når dataene normalisering, er det vanlig å redusere fluorescensen bølgeform til en enkelt verdi som vil bli brukt til å kvantifisere aktivitet og plukke treff. Hyppigst dette vil bli gjort ved å plassere de dataenepunkter i 10 sekunder etter tilsetning av Tl ⁺ å oppnå en første skråningen av fremkalt fluorescens økning. For hit plukking, er en populær tilnærming til å anta at det store flertallet av forbindelser i testen befolkningen er inaktive (nullhypotesen er i kraft). En gjennomsnitt og standardavvik er beregnet for testen befolkningen og treff er valgt som er tre standardavvik fra gjennomsnittet.

Splitting protokollen for lange sammensatte inkubasjoner: For påvisning Kir kanal inhibitorer, spesielt de som opptrer ved intracellulære bindingsseter, kan det være verdifullt å inkubere cellene med testforbindelsene i en lengre tid (f.eks 20 min) før tilsetningen av Tl ^+. Dersom forbindelser tilsettes "offline" før analysen er introdusert til plateavleseren, kan de optiske egenskapene av testforbindelser (f.eks fluorescens) ikke lett gjenkjennes og kan påvirke bruktedata normalisering tilnærminger slik som "statisk ratio" F / F ₀ beskrevet ovenfor resulterer i falske positiver og / eller falske negativer. For å unngå dette problemet samtidig unngår å måtte holde en assay plate i en leser for en lang inkubasjon, er en løsning å anvende en "to read" protokollen. Den første lese er en kort (f.eks 30 sek) eksperiment der forbindelsen tilsettes etter 10 sekunder for å tillate rensing av pre-forbindelsen tillegg F _0, og for å vurdere forbindelsene 'optiske effekter på systemet. Platen blir deretter fjernet fra leseren og inkuberes i ønsket periode og returnerte til leseren for thallium tillegg. Etter begge lesninger er fullført, den første les F ₀ kan benyttes til å normalisere data fra andre leser følgelig unngå mange problemer forbundet med å legge forbindelser "offline" samtidig som muligheten til å holde leseren opptatt datainnsamlingen dermed forbedre screening gjennomstrømming. De to read tilnærmingen er lettest implemlønnsom når en automatisk screening system. Det er viktig å merke seg at to leste tilnærming ikke vil eliminere problemene forårsaket av fluorescerende forbindelser som metter detektoren og / eller forårsake utlesing artefakter i CCD-kameraet.

Konfigurere en test for aktivatorer: Ikke alle Kir-kanaler er maksimalt aktiveres under hvile på, og dermed kan det være mulig å utforme en metode som kan påvise små-molekyl aktivatorer. I disse tilfellene, velge en EC ₈₀ konsentrasjon av Tl ⁺ ikke kan gi nok "headroom" for analysen til pålitelig oppdage aktivatorer. Således kan man velge å bruke en lavere konsentrasjon av Tl ⁺ (f.eks EC ₂₀₎ i aktivator-analyser. I noen tilfeller kan analysen vise lav nok variasjon med hensyn til å tillate bruk av en EC ₅₀ konsentrasjon av Tl ⁺ og likevel gi passende oppløsning av både aktiverte og hemmet kanal populasjoner. I dette tilfellet, analysen may foregå i dual aktivator / inhibitor-modus. Når tilgjengelig, kan en kjent aktivator brukes til å fastslå riktig Tl ⁺ konsentrasjon for å maksimere sjansene for å oppdage kanal aktivatorer.

Begrensninger: Det er noen begrensninger som bør vurderes under utvikling og gjennomføring av en Tl ⁺ flux-baserte high-throughput skjerm. For eksempel, avhengig av analysen på et indirekte mål på Kir kanal aktivitet ved hjelp av en fluorescerende probe hvis optiske egenskaper kan være direkte påvirket av forbindelser i en skjerm. Derfor må viktige observasjoner fra Tl ⁺ flux eksperimenter bekreftes ved hjelp spenning klemme elektrofysiologi, som regnes som den "gull-standard" metode for ionekanal farmakologi. Videre kan små-molekyler har direkte effekter på endogene Tl ⁺ flux stier uttrykt i HEK-293 celler, som fører til identifisering av falske positive treff. Den tetracykline-induserbare system er spesielt nyttig for å skille falske positive treff fra Kir kanal-rettet modulatorer fordi treff raskt kan screenes i uninduced celler for effekter på endogene trasé. Endelig, den lave oppløselighet av Tl ⁺ i klorid-holdige buffere begrense konsentrasjonen av Tl ⁺ som kan brukes i en analyse, som krever bruk av en ikke-fysiologisk Tl ⁺ stimulans buffer som kan forsterke farmakologien av målet ^11. Kompatibiliteten til ulike buffere med mål av interesse må vurderes nøye i løpet analysen utvikling. Dette kan gjøres ved å etablere CRC for kjente modulatorer med forskjellige Tl ⁺ stimulans buffere og velge tilstander hvor farmakologi ligner mest som ble observert ved hjelp av fysiologiske buffere.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.