Human Neuro-endocriene tumor cellijnen als een drie-dimensionaal model voor de studie van de mens Neuro-endocriene Tumor Therapy

Summary

We presenteren een eenvoudige agarose overlay platform voor 3D-meercellige sferoïden met behulp van neuro-endocriene kankercellijnen groeien. Deze methode biedt een zeer handige manier om het effect van therapeutische geneesmiddelen te onderzoeken op de neuro-endocriene tumor cellen. Het kan ons ook helpen om de menselijke neuro-endocriene tumoren sferoïden vast te stellen voor de behandeling van kanker.

Abstract

Neuro-endocriene tumoren (NET) zijn zeldzame tumoren, met een incidentie van twee per 100, 000 personen per jaar, en zijn zij goed voor 0,5% van alle menselijke maligniteiten. ^Een andere dan een operatie voor de minderheid van de patiënten die zich presenteren met gelokaliseerde ziekte, is er weinig of geen overlevingsvoordeel van systemische therapie. Daarom is er een grote behoefte beter begrip van de biologie netten, in het bijzonder bepalen nieuwe therapeutische targets voor patiënten met nonresectable of metastatische neuroendocriene tumoren. 3D-celkweek wordt steeds meer een populaire methode voor drug discovery wegens de relevantie ervan in het modelleren van de in vivo tumorweefsel organisatie en de micro-omgeving. ^2,3 De 3D meercellige sferoïden kan waardevolle informatie te bieden in een meer tijdige en minder dure manier van rechtstreeks gaan van 2D celkweek experimenten van dieren (muizen) modellen.

Om de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen te vergemakkelijken voor de NET-patients, hebben we een in vitro 3D meercellige sferoïden model met behulp van de menselijke NET cellijnen. De NET cellen uitgeplaat in een niet-klevende agarose beklede 24-well plaat en geïncubeerd onder fysiologische omstandigheden _(5% CO2, 37 ° C) met een zeer langzaam roeren gedurende 16-24 uur na platen. De cellen vormen meercellige sferoïden vanaf de 3 ^e of 4 ^e dag. De sferoïden meer bolvormige door de 6 ^e dag, op welk punt de behandelingen met medicijnen worden gestart. De werkzaamheid van de behandelingen met geneesmiddelen op het net bewaakt sferoïden gebaseerd op de morfologie, vorm en grootte van de sferoïden met een fase contrast lichtmicroscoop. De grootte van de sferoïden automatisch geschat met behulp van een speciaal ontwikkelde MATLAB programma gebaseerd op actieve contour algoritme. Verder tonen wij een eenvoudige methode om het inbedden HistoGel deze 3D sferoïden, waardoor het gebruik van standaard histologische en immunohistochemie.

Protocol

1. Bereiding van 1% agarose bekleed 24-well plaat

1. Voeg 1 g agarose (RPI, A20090-500) tot 100 ml gedeioniseerd water op 250 tot 500 ml fles en de autoclaaf agarose steriliseren (121 ° C, 15 psi, 15 minuten in een autoclaaf machine). Breng de fles met gesteriliseerde agarose in een 70 ° C waterbad. De agarose kan nu worden gegoten wanneer het gekoeld tot 70 ° C, die ongeveer een uur duurt. Zorg ervoor dat de agarose steriel te houden te allen tijde.
2. Het verkrijgen van de 24-well vlakke bodem platen (Falcon, 353047), elke vorm van 24-well vlakke bodem platen zou werken als de platen kunnen worden afgebeeld onder een fase-contrast microscoop.
3. Breng 200 pi van agarose aan elk putje met een repeater Eppendorf pipet in een bioveiligheid kast en draai de agarose rond de put te maken dekking van de goed gelijkmatig. 200 pi van agarose moet een concave oppervlak te vormen, zodat sferoïden kunnen vormen de consistente bolvormen. Minder dan 200 ul agarose mag nietbetrekking op de goed geheel, maar meer dan 200 ul agarose dan niet zijn het concave oppervlak en de sferoïden gegroeid kan geen deel bolvorm.
4. De agarose-beklede platen met 24 putjes zijn klaar voor gebruik in ongeveer 10 minuten. (Optioneel) Voeg 100 ul medium om de agarose evenwicht met kweekmedium voorafgaand aan het zaaien cellen.
5. Ook na de agarose volledig gestold worden 100 pi groeimedium aan elk putje en sluit de platen met steriel tape (Nunc, 236,366). Deze platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende een week.

2. Voorbereiding van de Single Cell Schorsingen

1. Alle experimenten worden uitgevoerd met de standaard in een aseptische bioveiligheid kast en de culturen gekweekt in een 37 ° C bevochtigde incubator met _5% CO2 in lucht, tenzij anders aangegeven.
2. Human pancreas NET BON-1 cellen worden gehandhaafd in DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) met 10% foetaal bovine serum (FBS, Invitrogen,16000-044) medium in een 100 mm x 20 mm steriele cultuur schotel (Corning, 430167).
3. Wanneer monolaag BON-1-cellen te bereiken 70-80% confluentie, wordt medium verwijderd. De cellen gewassen met PBS tweemaal en losgemaakt van de schotel door 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12604) met 5 minuten incubatie bij 37 ° C. TrypLE is vergelijkbaar met trypsine maar stabiel is bij 15 - 30 ° C en bij 4 ° C. Controleer onder de microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de schotel.
4. Voeg toe 9 ml groei medium om de getrypsiniseerd cellen en gebruik maken van een pipet om cellen pipetteren op en neer een paar keer op een nog enkele cel suspensie blijft.
5. Gebruik 70-um cel zeef (Fisher, 22363548) om de cellen te filteren.
6. Verzamel cellen en het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van Guava PCA-96 Base System (Millipore).
7. Bereid een suspensie van 5.000 cellen per ml in fenolvrij DMEM/F12 met 10% FBS groeimedium.

3. Sferoïde Cultuur

1. Overlay 200 pi van de internecelsuspensies de agarose-beklede 24-well plaat en sluit de 24-well platen met steriel afdichtband om verdamping te voorkomen.

Opmerking: - het aantal cellen worden uitgeplaat dient empirisch te worden bepaald op basis van de grootte van de sferoïden op dag 6, 300-400 urn diameter van de sferoïden de ideale maat voor het starten van de drug behandeling, 1000 BON-1 en H727-cellen worden uitgeplaat.

- Het is niet raadzaam te beginnen medicamenteuze behandelingen na dag 6, omdat de levensvatbaarheid van de 3D-cellen begint te dalen op ongeveer dag 10 (gegevens niet getoond, manuscript in voorbereiding).

2. Plaats bovengenoemde agarose beklede platen met 24 putjes met BON-1 cellen op een schudapparaat heel langzaam bewegen van minder dan 40 toeren per minuut gedurende een nacht in 37 ° C bevochtigde incubator met _5% CO2 in lucht. Ga dan deze platen op een stabiel platform om de culturen groeien.
3. Voeg 200 ul groeimedium aan elk putje van de boven de plaats om de 3 dagen. Niet storen de sferoïden. Probeer medium toe door de wand van elke well van contact met de pipet op de zijkant van de put en laten de mediumstroom in de bron.
4. Controleer de sferoïde vorming in de 24-well platen onder een microscoop.

4. Medicamenteuze behandeling

1. Wanneer de sferoïden te bereiken ongeveer 300-400 micrometer diameter op dag 6 worden de 3D sferoïden behandeld met medicijnen. Dit wordt aangeduid als dag 0 van medicatie.
2. Op dag 6 elk putje van de plaat is ongeveer 400 ul medium. Om ervoor te zorgen dat de medicamenteuze behandelingen zijn op 1x uiteindelijke concentratie in elk putje, 3x seriële verdunningen van elke dosis van de behandelingen worden gemaakt van het geneesmiddel voorraad in 5 ml groeimedium in een 15 ml conische buis, wat genoeg is voor 8 herhalingen.
3. De sferoïden in elke rij van de 24-well plaat gecategoriseerd als voertuig dosis 1, 2, 3, 4 en 5. Er zijn vier replicaten voor elke dosis behandelingen op een 24 wei-plaat (zie
4. Spin down de 24-wells plaat bij 800 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C om ervoor te zorgen dat alle verdichtingen op de tape goed in gaat. Door de drijvende kenmerk van de 3D sferoïden, wordt het medium in elke well niet verwijderd om de verstoring van de sferoïden te voorkomen.
5. Voeg voorzichtig 200 pi van de hierboven gemaakte behandelingen van elke dosis in de geschikte putjes langs de wand van elk putje.
6. Sluit de 24-well platen met de tape en de culturen in de 37 ° C incuberen bevochtigde incubator met _5% CO2 in lucht.
7. Indien nodig kunnen de sferoïden terugtrekken van elke well met de respectievelijke dosis behandelingen na 72-96 uur.

5. Monitor 3D Spheroid culturen

1. Bij elk gekozen tijdstip na behandelingen met geneesmiddelen (0, 24, 48, 72 uur) de sferoïden te elk putje van thij 24-wells plaat worden afgebeeld met een Zeiss Axiovert 200/M-based fase-contrast microscoop met een 5x doelstelling.

Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden genomen op een licht microscoop met een gekalibreerde schalen tussen de urn en pixel. Een 5x doel is ideaal omdat de sferoïden snel de beeldvorming veld ontgroeien met een 10x doelstelling.

2. Sferoïde analyse kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van Zeiss AxioVision 4.8.2 software met de RAW-afbeeldingen.
3. Als alternatief wordt een speciaal ontwikkelde MATLAB programma dat de grootte van de sferoïden te schatten automatisch / semi-automatisch. Het automatische programma voert de actieve contour algoritme ⁴ tot en met contour van de sferoïde nauwkeurig te lokaliseren in een bepaald beeld en automatisch meten van de belangrijkste (L) en kleine (W) assen. Een semi-automatische versie van hetzelfde algoritme stelt gebruikers in staat om te helpen het programma te starten wanneer sterke artefact aanwezig is. Alle beelden moeten worden geëxporteerd als TIFF of JPEG-bestand formaten vande RAW-afbeeldingen worden gelezen door het programma. Het volume van de bolvormige geschat op 0,5 x L x W ^2.

6. HistoGel-inbedding van de NET 3D Steroiden

1. 10-24 sferoïden worden uit de 24-well platen, gewassen in PBS tweemaal gefixeerd in 10% formaline 2 uur, gewassen met 50% en 70% ethanol gedurende 15 minuten tweemaal, respectievelijk, en klaar voor HistoGel insluiten. Alternatief kunnen deze worden gehouden in 70% ethanol bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
2. Een buis van koude HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) wordt gesteld in een bekerglas gevuld met water. De beker wordt verwarmd in een magnetron een min of tot de gel volledig vloeibaar vervolgens opgeslagen in dezelfde water gevulde beker te allen tijde.
3. De sferoïden in 70% ethanol van bovenaf worden overgebracht in een biopsie cryomold (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) met behulp van een tandenstoker. Zorg ervoor dat alle sferoïden worden overgedragen. Laat de sferoïden zitten een minuut zinken naar de bodem van de biopsy cryomold. Probeer om zich te ontdoen van de vloeistoffen in het biopt cryomold te komen met Kimwipes en ondertussen, heel voorzichtig de sferoïden duwen om het midden aan de onderkant van de biopsie cryomold met behulp van de wegwerp plastic Pasteur pipet. Deze stap kan het gemakkelijker zijn om te doen onder een stereomicroscoop.
4. Een dunne laag verwarmde HistoGel wordt toegevoegd aan de biopsie cryomold de sferoïden onderaan de biopsie cryomold stabiliseren; intussen de tandenstoker wordt gebruikt om de sferoïden te houden in het midden op de bodem van de biopsie cryomold zachtjes. Voeg geen teveel HistoGel maar voldoende voor het stabiliseren van sferoïden onderaan de biopsie cryomold.
5. Laat de sferoïden / HistoGel zitten voor 1-2 min bij kamertemperatuur of tot de HistoGel is gestold. Vul dan de rest van de biopsie cryomold met de verwarmde HistoGel.
6. Laat het bij kamertemperatuur gestold ongeveer 10 minuten.
7. Vlak voor ze springt uit de sferoïden / HistoGel blok van de biopsie cryomold, leave het bij 4 ° C gedurende 1 minuut, waardoor springt uit de intacte sferoïden / HistoGel blok. De sferoïden / HistoGel blok wordt vervolgens verpakt in een stuk van Bio-wraps (Surgipath, 01.090) en in een tissue en biopsie cassette (Fisher Scientific, 15-182-701D). Het weefsel en biopsie cassette wordt opgeslagen in een houder met 70% ethanol. Dan is de routine weefsel verwerking procedures voor paraffine inbedding worden gevolgd. ⁵
8. De paraffineblok kan worden ingedeeld in drie-um dikke laag dia. De dia's kunnen worden gekleurd met hematoxyline en eosine voor histologische veranderingen bepalen en kan ook worden gebruikt voor immunocytochemische kleuring.

7. Representatieve resultaten

Human pancreatische neuro-endocriene tumor cellijnen BON-1 (die aan Verto Instituut door Kjell Oberg, Uppsala University, Zweden), QGP-1 (Japanse Health Sciences Foundation, Osaka, Japan), en de menselijke long neuro-endocriene tumor cellijn H727 (ATCC) waren gekweekt op een agarose gecoate 24-wells plaat. Zoals in figuur 1 de drie cellijnen tonen verschillende morfologie. BON-1 en H727 cellen gevormd 3D sferoïden. Onder de microscoop, H727-cellen toonde strakker en compacter sferoïden dan BON-1-cellen. Onze hypothese is dat H727-cellen een verhoogde capaciteit voor cel-cel adhesie te hebben en te vormen strakker knooppunten als resultaat. QGP-1-cellen vertonen grote druif-achtige poreuze massa's, die niet worden gezien als sferoïden. Door de toenemende belang van pancreatische neuroendocriene tumoren onderzoek van de laatste jaren zijn BON-1 cellen die voor de rest van de figuren. Na enten BON-1 cellen op agarose beklede 24 wells plaat, meercellige Steroiden vorming treedt gewoonlijk op ^de 3e ^of 4e dag en de sferoïden worden ronder de ^6e dag. Door de voedingsstoffen en zuurstof beperking cellen in de dichte kern van de sferoïden beginnen te sterven rond dag 10 en dag 17 de sferoïden gaan door de grootte of zodanig desintegrerenme gevallen de uitvoer van het necrotische kern. De sferoïden meestal kan tot 1000 um in diameter. Figuur 2 toont de delen van de vorming, groei en desintegratie van BON-1 3D sferoïden.

Medicamenteuze behandelingen waren begonnen toen sferoïden waren ongeveer 300 tot 400 micrometer en cellen behouden hoge levensvatbaarheid (manuscript in voorbereiding). Dag 6 3D sferoïden werden gekozen als het startpunt voor de behandeling met geneesmiddelen. Er werd gemeld dat de histon deacetylase inhibitoren antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten op de NET-cellen toonde. ⁶ Wij hebben gekozen voor de histon-deacetylase inhibitor-trichostatine A (TSA) als een voorbeeld om het effect van medicamenteuze behandelingen op 3D-NET sferoïden te illustreren. Figuur 3A toont de morfologie van de 3D ​​sferoïden bij de behandeling van TSA. figuur 3B wordt het volume van de 3D ​​sferoïden op TSA (Sigma, T8552) behandeling. De grootte van elke individuele sferoïde werd automatisch geschat door een klantentom ontwikkelde MATLAB computerprogramma. ⁴ Een handmatige verstrekstap toegevoegd om de sferoïden, die dicht aan de rand zich in een bepaald beeld te verkrijgen. Ten minste 8 sferoïden gemeten per dosis aan TSA behandeling op elk tijdstip. Het volume van elke 3D sferoïde werd berekend als 0,5 x Lengte x Breedte ^2. Zoals in figuur 3A en 3B opzichte van het voertuig, alle doses TSA weergegeven in de figuren blijkt bepaalde mate van groeiremming van BON-1 3D sferoïden. Onder hen zijn de concentraties van 125 nM en 250 nM TSA sterk onderdrukt de groei van 3D sferoïden en tot celdood bij 96 uur tijdstip.

Om de histologie van de NET 3D sferoïden begrijpen een H & E en immunohistochemische (IHC) kleuring werden uitgevoerd op 3D sferoïden die waren gekweekt gedurende 17 dagen. Figuur 4A toont een methode om 3D sferoïden te verwerken voor HistoGel insluiten, die de belangrijkste stap voor paraffine inbedding van 3D spher OIDs. Figuur 4B toont de H & E kleuring de immunohistochernische kleuring van de gesplitste caspase-3 (een merker voor apoptotische cellen) en Ki-67 (een merker voor prolifererende cellen) antilichamen op 3D sferoïden, die was gekweekt gedurende 17 dagen . De cellen in de kern van de 3D sferoïden meestal necrotische / apoptotische en de buitenste laag cellen actief vermenigvuldigen.

Figuur 1. De morfologie van NET 3D Steroiden. De 3D sferoïden van drie humane neuroendocrine tumorcellijnen gevormd op agarose beklede platen met 24 putjes. 1.000 BON-1, H727 en QGP-1 cellen werden gezaaid op agarose-gecoate 24-well platen en gekweekt in een normale fysiologische toestand zoals beschreven in het protocol. Dit zijn de beelden van 3D-sferoïden voor BON-1 en H727 of mobiele aggregaten voor QGP-1, die werden gekweekt gedurende 10 dagen.

18/4218fig2.jpg "alt =" Figuur 2 "/>
Figuur 2. De groei Tracking van BON-1 3D Steroiden De groei volgen van BON-1 3D sferoïden:. Vorming, groei en verval van 3D sferoïden. Zoals beschreven in het protocol is 1000 BON-1-cellen uitgeplaat op een agarose-gecoate 24-wells plaat. Cellen gekweekt in een standaard DMEM/F12 medium met 10% FBS op een schudapparaat in een fysiologische toestand s nachts dan bewogen in een stabiele en gekweekt in dezelfde toestand. De groei volgen van de 3D-cellen werden gevolgd door beeldvorming cellen elk uur voor de eerste 5 uur na plating, en daarna om de 1-3 dagen met een Zeiss Axiovert 200/M-based fase-contrast microscoop met een 5x doelstelling. De cellen in de totale massa's eerst, dan vormen meercellige aggregaten, kleine sferoïden, grotere sferoïden, en uiteindelijk de sferoïden desintegreren.

Figuur 3. TSA behandeling op BON-13D sferoïden. (A) beelden van 3D sferoïden op TSA behandeling. Behandelde groep: V - Voertuig (0,0025% DMSO); D1-dosis 1 (15,625 nM TSA), D2-dosis 2 (31.25 nM TSA); D3: dosis 3 (62,5 nM TSA); D4: dosis 4 (125 nM TSA ); D5: dosis 5 (250 nM TSA). Tijd van de behandeling: 0 H - Tijd punt dat behandelingen gestart op dag 6 3D sferoïden, 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur zijn de tijdstippen na de behandelingen begonnen. 3D sferoïden werden afgebeeld op elk tijdstip als voorheen. (B) De groei van de 3D-sferoïden op TSA-behandeling. De belangrijkste (L) en secundaire (W) assen van de 3D sferoïden in (A) werden automatisch geschat door Matlab programma op elk tijdstip van behandelingen (0, 24, 48, 72 en 96 uur). Het volume van de 3D ​​sferoïden geschat op 0,5 x L x W ^2. Het volume van de bolvormige in de grafiek is het gemiddelde van 8 replicaten en de fout bar werd berekend op basis 8 replicaten.

Tabel 1.Lay-out van de medicamenteuze behandelingen op een 24-wells plaat

Figuur 4A. Illustratie van een methode om 3D-Steroiden voor HistoGel Embedding te verwerken. Een methode om 3D sferoïden verwerken voor HistoGel inbedding en immunohistochemische kleuring van de 3D ​​sferoïden (A) Een overzicht van een methode om 3D-sferoïden voor HistoGel inbedding te verwerken. 3D sferoïden werden ingekapseld in een HistoGel te zijn op hetzelfde niveau in de biopsie cryomold, dan is de HistoGel / sferoïden blok is verpakt in een blauwe Bio-wraps en overgebracht in een gele biopsie cassette voor paraffine inbedding.

Figuur 4B. H & E kleuring en immunohistochemische kleuring van de dag-17 3D sferoïden. (B) H & E kleuring, Immunohistochemische kleuring van Ki-67 en gesplitst caspase-3 van de 17-daagse 3D sferoïden. De paraffin ingebedde coupes dia's waren ontdaan en antigen herstel werd uitgevoerd met behulp van CCI (Cell Conditioning Solution, Verana Medical System, # 711-065-152). Konijn polyclonaal Ki-67 antilichaam (Abcam. # Ab833) en gekliefde caspase 3 antilichaam (Cell signalering Technology, # 9661) werden toegepast in een concentratie van 1:75 1:200 en respectievelijk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De anti-konijn secundair antilichaam (Jackson Immunolab, # 711-065-152) werd toegepast 1:500 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door chromogene detectiekit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Dia's werden met hematoxyline en uitgedroogd en opgeruimd voordat afdekken van Xyleen.

Discussion

We hebben aangetoond een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare werkwijze voor het vormen 3D meercellige sferoïde van humane tumorcellen neuroendocriene met agarose-beklede platen met 24 putjes. Het succes van deze techniek is de mogelijkheid om een ​​sferoïde verkrijgen met homogene grootte en uniforme vorm van dag 6 vanaf een vast aantal cellen. De belangrijkste stap de langzame beweging van de plaat met NET cellen gedurende de eerste 16 tot 24 uur na platen. Deze methode kan ook van toepassing op gemeenschappelijke menselijke borstkanker cellijn MCF-7, de menselijke dikke darm adenocarcinoom cellijn HT-29, menselijke niet-kleincellig longcarcinoom cellijn H1299 en menselijke embryonale nier cellijn HEK-293. Ze kunnen allemaal vormen een uniforme en compacte 3D sferoïden voor therapeutische drug-scherm (gegevens niet getoond). Hoewel er verschillende methoden worden gemeld op het genereren van 3D sferoïden, ^7-10 van de methode die hier vereist geen speciale platen of reagentia en is dus eenvoudig en kosteneffectief. Onze ongepubliceerde gegevens aangetoond wane dat de netto 3D sferoïden geteeld op agarose de na te bootsen in vivo NET xenograft tumor geometrisch en moleculair, in vergelijking met de monolaag 2D-cellen. Dit is vergelijkbaar met wat er is gerapporteerd voor de 3D-sferoïden gemaakt van op andere menselijke kankercellen. ^11,12 De beperking van de 3D-celkweek model is dat het niet volledig kan vervangen het testen van de in vivo werkzaamheid van drugs of therapeutische behandelingen, omdat 3D sferoïden zijn als avasculaire tumoren, die verschilt van de in vivo tumor in dit aspect. Toch zal deze methode helpen de kloof en beoordelingen van NET therapeutische medicijnen uit in vitro in vivo in een aantal aspecten.

Immunofluorescentiekleuring op meercellige sferoïden is moeilijk uit te voeren vanwege de grootte en vorm van de drijvende 3D sferoïden en de beperking van de confocale microscoop. Hier illustreren we een methode om HistoGel inbedding te verwerken voor paraffineinbedding, waardoor immunohistochemische kleuring van de seriële doorsnede dia's van de 3D-sferoïden. Trouwens, onze op maat ontwikkelde MATLAB programma helpt nauwkeurig en reproduceerbaar een schatting van de grootte van de sferoïden, efficiënt toezicht op de werkzaamheid van het geneesmiddel, en kan worden opgenomen in een high-throughput scherm in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor NET patiënten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 Media	Gibco	10565-018
TrypLE	Gibco	12604
24-well plates	Falcon	353047
70 mM cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Sterile sealing tape	Nunc	236366
Trichostatin A	Sigma	T8552
Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-402-12