Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des nicht-viralen
Abstract
Die piggyBac Transposonsystem ist natürlich aktiv, ursprünglich aus dem Kohlspannerraupe Motte 1,2 abgeleitet. Diese nicht-viralen Plasmid basierten System ist, am häufigsten unter Verwendung von zwei Plasmide mit einer Expression der Transposase piggyBac Enzym und ein Transposon-Plasmid beherbergt, der das Gen (e) von Interesse zwischen invertierten Wiederholung Elemente, die für den Gentransfer-Aktivität erforderlich sind. PiggyBac vermittelt Gentransfer durch "cut and paste"-Mechanismus, wobei die Transposase integriert das Transposon-Segment in das Genom der Zielzelle (n) von Interesse. piggyBac hat effizienten Gentransfer-Aktivität in einer breiten Vielzahl von Insekten 1,2, Säuger 3-5 gezeigt, und Menschen cells6 einschließlich der primären menschlichen T-Zellen 7,8. Kürzlich wurde ein hyperaktives piggyBac Transposase erzeugt Verbesserung Gentransfereffizienz 9,10.
Menschliche T-Lymphozyten sind von klinischen interest für Immuntherapie von Krebs 11. Zu beachten ist, hat die erste klinische Studie mit Transposon Veränderung der menschlichen T-Zellen mit dem Dornröschen Transposon System 12 zugelassen. Wir haben zuvor die Nützlichkeit piggyBac als nicht-viralen Methoden zur genetischen Modifikation von menschlichen T-Zellen ausgewertet. Wir fanden piggyBac zu einer genetischen Veränderung von menschlichen T-Zellen mit einem Reportergen und eine nicht-immunogene Suizidgen induzierbar 7 effizient. Analyse von genomischen Integration Seiten offenbart einen Mangel an Präferenz für die Integration in oder in der Nähe bekannter Proto-Onkogene 13. Wir verwendeten piggyBac Gen-modify zytotoxische T-Lymphozyten, um einen chimären Antigen-Rezeptor gegen den Tumor-Antigen HER2 gerichteten tragen, und festgestellt, dass Gen-modifizierten T-Zellen gezielt vermittelte Abtötung von HER2-positiver Tumorzellen in vitro und in vivo in einem orthotopen Mausmodell 14. Wir haben auch verwendet piggyBacdie menschliche T-Zellen resistent gegen Rapamycin, die nützlich sein sollen von Krebstherapien, wo Rapamycin 15 ausgenutzt wird zu erzeugen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung piggyBac genetisch zu verändern primären humanen T-Zellen. Dies beinhaltet Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus menschlichem Blut durch Kultur, genetischen Veränderung, und Aktivierung von T-Zellen folgt. Für die Zwecke dieser Bericht wurden T-Zellen mit einem Reportergen (eGFP) zur Analyse und Quantifizierung der Genexpression durch Durchflusszytometrie modifiziert.
PiggyBac kann zum menschlichen T-Zellen mit einer Vielzahl von Genen von Interesse zu modifizieren. Obwohl wir verwendet piggyBac an T-Zellen gegen Tumorantigene 14 lenken sind, haben wir auch verwendet, um einen induzierbaren piggyBac Sicherheitsschalter zuzusetzen, um Gen-modifizierten Zellen zu eliminieren, wenn nötig 7. Die große Ladekapazität von piggyBac auch Gentransfer aktivierteine große Rapamycin resistenten mTOR-Molekül (15 kb) 15. Daher stellen wir eine nicht-viralen Methodik für stabile Gen-Modifikation von primären humanen T-Zellen für eine Vielzahl von Zwecken.
Protocol
Tag 0
Ein. Isolierung von PBMCs aus menschlichem Blut
- Collect 20 ml frischem menschlichem Blut mit Venenpunktion in Na-Heparin Vacutainer-Röhrchen.
- Mischung Blut und erweiterte RPMI 1640 in 1:1 (v / v)-Verhältnis.
- 20 ml Lymphoprep Mediums auf eine 50 ml-Zentrifugenröhrchen (25 ° C). Langsam Schicht 25-30 ml Blut-RPMI 1640 Mix auf der Oberseite des Lymphoprep.
- Zentrifugation bei 400 xg für 40 min ohne Bremsen.
- Sammeln Sie beide unterschiedliche und Fuzzy-Schichten mit einem Einweg-Pipette in 10 ml 1x PBS (25 ° C) und bringe das Volumen von bis zu 50 ml mit 1x PBS.
- Zentrifuge bei 450 × g für 10 min.
- Überstand vollständig und 20 ml Erweiterte RPMI 1640.
- Zentrifugation bei 400 xg für 5 min.
- Überstand. 10 ml vollständige T-Zell-Medien mit 5 ng / ml rhIL-15 ergänzt vorgewärmt auf 37 ° C.
- Zählen der Anzahl von Zellen und die Platte in einer 24-Well-Gewebekulturplatten coated Platte bei 2 x 10 6 Zellen / Vertiefung in komplettem T-Zell-Medium mit 5 ng / ml rhIL-15 In sterilem Wasser zu umgebenden Vertiefungen ergänzt. Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
Tag 1
2. Lackierplatten mit anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper zur Stimulation von T-Zellen
- Verdünnte anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper in sterilem Wasser in einer Konzentration von 1 pg / ml gelöst.
- Hinzufügen jeweils 500 ul Antikörperlösung bis 5 gekennzeichneten Wells einer nicht beschichteten Gewebekulturplatten 24-Well-Platte.
- Fügen sterilem Wasser der Brunnen ausruhen. Wickeln Sie die Platte in Schrumpffolie und Ort in einem 4 ° C Kühlschrank.
3. Nukleofektion von unstimulierten T-Zellen
- Vorwärmen T-Zell-Medium bei 37 ° C und Ergänzung mit 5 ng / ml rhIL-15. Bereiten komplette Nucleofector Lösung durch Zugabe von 500 ul Nucleofector Supplement 1 bis 2,25 ml Nucleofector Lösung.
- Aliquot 5 ug jedes Transposon (Zeo-pT-CMV-eGFP) und Transposase (pCMV-piggyBac) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: es kann notwendig sein, die Transposase und Transposon-DNA für eine optimale Menge Genabgabe zu optimieren und zu minimieren Zelltoxizität. Die Plasmide können von den Autoren auf Anfrage erhältlich.
- Ernte PBMCs aus der 24-Well-Gewebekulturplatten Platte in eine 50 ml Tube. Zählen Sie die Anzahl der Zellen. Sparen Sie 2 x 10 6 Zellen zur Verwendung als Kontrolle während der Durchflusszytometrie.
- Hinzufügen 7-10 x 10 6 Zellen in ein 15 ml-Tube und Zentrifuge bei 400 xg, 5 min, Überstand entfernen und Finger-Flick das Pellet.
- Fügen Sie 100 ul der T-Zell komplette Nukleofektion Lösung gelöst Zellpellet.
- Fügen Sie die Lösung Zellgemisch auf das Rohr mit den Plasmiden.
- Hinzufügen der Lösung-Zell-Plasmid Mischung auf dem Boden der Küvette Nukleofektion. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen.
- Nucleofect die Zellen mit program U-014 (Unstimulierte T-Zellen, menschliche, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Sofort im 500 ul vorgewärmtes Medien mit rhIL-15 in die Küvette. Übertragen der Zellen an einer Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 1,5 ml vorgewärmtem Medium mit rhIL15.
- Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
Tag 2
4. Unspezifische Stimulation von T-Zellen
- Ernten Sie die Zellen und bestimmen Zellzahlen. Beiseite 0,5 x 10 6 Zellen für die Durchflusszytometrie, um die Frequenz von GFP-positiven Zellen zu bestimmen. Verwenden Sie die nicht-transfizierten PBMCs als Kontrollen.
- Saugen Sie die CD3/28 Antikörper-Lösung aus dem nicht Gewebekultur beschichtete Platte und spülen jede Vertiefung mit T-Zell-Medien.
- Resuspendieren der Zellen nucleofected bei 0,5 x 10 6 Zellen pro ml in vollständigem Medium CTLsupplementiert mit 5 ng / ml rhIL-15. 2,0 ml jeder der nucleofected Zellen in 4 Vertiefungen der nicht Gewebekulturplatte. Fügen Sie 0,5 x 10 6 nicht nucleofected Zellen an der 5 th gut.
- Inkubieren für 3 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
Tag 5
- Ernte der stimulierten T-Zellen aus dem nicht-Gewebekulturplatte.
- Zählen und replate die Zellen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 0,7 x 10 6 Zellen / ml in T-Zell-Medium mit 5 ng / ml IL-15.
Tag 7
7. Analysis of Gene Expression
- Ernten Sie die Zellen und Flecken mit anti-human CD8 Antikörper (könnte auch anti-CD3 und anti-CD4) und analysieren mit Durchflusszytometrie% GFP-Expression.
Tag 8 (Optional)
8. Expansion von T-Zellen
- Am Tag 8 nach der Transfektion, können T-Zellen in T replattiert werden-Zell-Medium mit IL-15 in einer Dichte von 0,7 x 10 6 Zellen pro Well für 16 weitere Expansion.
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Representative Results
Eine schematische demonstrieren die Schritte in genetisch modifizierenden menschlichen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist in Abbildung 1 gezeigt. Diese Plasmide sind auf Anfrage bei den Autoren. Ein schemtic demonstrieren die Schritte in gentechnisch veränderten humanen T-Lymphozyten mit einem Reportergen (eGFP) ist showin in 2. Es ist notwendig, T-Zellen zu aktivieren, um sie zu teilen, zu erweitern, und Propagation in Kultur. Modifiziertes humanes T-Zellen wurden dann gezüchtet und analysiert unter Verwendung von Durchflusszytometrie zur Genexpression an Tag 1 und Tag 7. Gezeigt sind die Ergebnisse von einem Spender in 3. Zellen wurden mit Allophycocyanin (APC)-konjugierten anti-CD8, für eGFP (das Transgen) und APC Fluoreszenz von einem FACSCalibur mit dem Filtersatz für vier Fluoreszenzsignale ausgestattet analysiert gefärbt unter Verwendung Cell Quest Software (Becton Dickinson). Wir haben zuvor gentechnische Veränderung von sowohl CD4-und CD8-positiven T-Zellen und hierin Dämon beobachtetStrate CD8-positiven Zellen als Beispiel 7. Obwohl wir für einzelne Transgenexpression hier analysiert, hat piggyBac auch für Multi-Gen (oder Multiplex) Gentransfer in menschliche Zellen 17 verwendet worden. Die Abnahme der eGFP-Expression zwischen Tag 1 und Tag 7 ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß nicht alle Zellen transfiziert stabile Integration Transposon-DNA unterzogen.
Abbildung 1. Schematische von Plasmiden für piggyBac vermittelten gentechnische Veränderung von menschlichen T-Zellen verwendet. CMV, CMV-Promotor; Intron, SV40 Intron für mRNA Stabilisierung; piggyBac, Transposase cDNA; SV40 pA, Polyadenylierungsstelle; pUC, Replikationsursprung, b-Lactamase, Ampicillin-Resistenzgen; PB3'IR, piggyBac 3 'invertierte Wiederholung; PB5' IR, piggyBac.. 5 'invertierten Wiederholung; ZeoR, Zeocin-Resistenz-Gen; R6K Ori, Replikationsursprung; IVS, dazwischenliegende Sequenz; eGFP, Fluorescent Reportergen Anmerkung: Antibiotika wurden für bakterielle Selektion und Wachstum verwendet, aber nicht in T-Zell-Kulturen verwendet hier Klicken größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Schematische Beschreibung der Modifikation von primären menschlichen T-Zellen mit dem piggyBac Transposon-System.
Abbildung 3. Stabile Transgenexpression in T-Zellen mit dem piggyBac Transposon systematisch modifiziertMeter Linke Panels: eGFP-Expression an Tag 1. Rechts-Panels:. EGFP-Expression am Tag 7 Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Das hierin beschriebene Verfahren erlaubt eine stabile Modifikation Transgen von primären humanen T-Lymphozyten. Wir haben zuvor die Verwendung des piggyBac Transposonsystem getestet, um T-Zellen zu modifizieren, um ein Reporter-Gen (für mehr als 4 Wochen), eine nicht-immunogene Suizidgen, einem chimären Antigenrezeptors für adoptive Immuntherapie (länger als 100 Tage) ausdrücken, und um den Widerstand gegen immunsuppressive Medikamente 7,13-15 konstruieren. Nicht-virale Modifikation von T-Zellen für die adoptive Immuntherapie und anderen Anwendungen sollte viel weniger aufwendig und daher weiter verbreitet verwendet als retrovirale Transduktion. Der Einsatz neuer hyperaktiven piggyBac Elemente erhöhen sollte die Machbarkeit der Herstellung von stabilen Transgen modifizierten humanen T-Zellen 9. Obwohl hierin nicht beschrieben, kann man erreichen erforderlichen Anzahl von stabil transfizierten T-Zellen für mögliche klinische Anwendung. Verwendung einer Kombination von piggyBac-vermittelten Gentransfer und aK562 (künstliche Antigen präsentierende) Feeder-Zellen, eine anfängliche Ausbeute von etwa 2 x 10 6 stabil transfizierten T-Zellen können von 4 bis 5 Logs über 10 10 transduzierten T-Zellen in 4 bis 5 Wochen und 12 bis 10 werden in 6 bis 7 erweitert Woche 7. Analyse piggyBac Integration Standorten in humanen T-Zellen zeigten keine Tendenz zu Proto-Onkogene, aber tat es zeigen eine Vorliebe für die Integration in hoch exprimierten Gene in aktivierten T-Zellen bei der Verwendung des Nukleofektion Technologie über 13 skizziert. PiggyBac stellt eine viel versprechende Methode zur stabilen genetische Modifikation von menschlichen T-Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
SS wird teilweise durch die HHMI Med in Grad Training Grant durch die TBMM Programm unterstützt. MHW wird teilweise durch einen Career Development Award vom Department of Veterans Affairs und der großzügigen Unterstützung der Dr. and Mrs. Harold M. Selzman unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch von NIH Lymphom SPORE Gewährung P50CA126752 und NIH R01 DK093660 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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