Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren zur ex-vivo-Kultivierung von Drosophila ganze Gehirn. Dies kann als Kontrapunkt zu chronischen genetische Manipulationen zur Untersuchung der Zellbiologie und der Entwicklung der zentralen Gehirnstrukturen, indem akute pharmakologische Interventionen und Live-Imaging von zellulären Prozessen verwendet werden. Als ein Beispiel für die Technik, vor aus unserem Labor ein Arbeiten haben gezeigt, dass ein bisher nicht berücksichtigter subzellulären Kompartiment zwischen den Axonen und somatodendritischen Fächer von Axonen des zentralen Drosophila Gehirn liegt. Die Entwicklung dieser Kammer, die als das Axon ersten Segment (AIS) 2, wurde genetisch auf dem Neuronen-spezifischen Cyclin-abhängige Kinase, Cdk5 abhängen gezeigt. Wir zeigen hier, dass Ex-vivo-Behandlung von Wildtyp Drosophila Larve Gehirn mit dem Cdk5-spezifische pharmakologische Inhibitoren Roscovitin und Olomoucin 3 akuten Veränderungen im Aktin-Organisation verursacht, undin Lokalisation des Zelloberflächenprotein Fasciclin 2, die die Änderungen in Mutanten, die Cdk5 Aktivität fehlt genetisch gesehen zu imitieren.
Ein zweites Beispiel für die Ex-vivo-Kultur Technik wird für Umbau der Verbindungen von embryonalen Pilzkörper (MB) Gamma-Neuronen während der Metamorphose von der Larve zum erwachsenen Verfügung gestellt. Der Pilzkörper ist das Zentrum des olfaktorischen Lernen und Gedächtnis in-the-fly 4, und diese Gamma-Neuronen beschneiden ihre Axonen und Dendriten Filialen während der gesamten Entwicklung und dann wieder verlängern Zweige zu einem späteren Zeitpunkt, um die erwachsenen Innervationsmuster 5 zu etablieren. Beschneiden dieser Neuronen des MB hat sich gezeigt, über lokale Degeneration von Neuriten Zweigen 6 auftreten, durch einen Mechanismus, durch Ecdyson, ein Steroidhormon, ausgelöst wird, prüft auf Ecdyson-Rezeptor B1 7, und das ist abhängig von der Aktivität der Ubiquitin-Proteasom-System 6. Unsere Methode der Ex-vivo-Kultivierung kann be verwendet werden, um weiter zu befragen, den Mechanismus der Entwicklungspsychologie Umbau. Wir fanden, dass in der ex vivo-Kultur Einstellung, Gamma-Neuronen des MB den Prozess der Entwicklung Beschneiden rekapituliert mit einem zeitlichen Verlauf ähnlich der in vivo. Es war jedoch wesentlich, um bis 1,5 Stunden nach Puparium Bildung vor Explantation des Gewebes, damit die Zellen irreversibel zu verpflichten, Metamorphose warten; Sezierung von Tieren zu Beginn der Puparium führten zu wenig oder gar keine Metamorphose in der Kultur. So, mit entsprechender Modifikation kann die Ex-vivo-Kultur-Ansatz angewendet, um zu studieren dynamische als auch stationäre zentrale Aspekte der Biologie des Gehirns werden.
Protocol
A. Herstellung der Medien
- Planen kompletten Medien durch das Filter-Sterilisation Drosophila Schneider Medien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Die Medien sollten jedes Mal frisch zubereitet werden. Alternativ kann ein frisches Aliquot der vorgefrorene Medien vor jedem Gebrauch aufgetaut werden.
- Vor der Kultivierung, fügen Sie 10 pg / ml Insulin und 2 pg / ml Ecdyson zu den Medien. Die Medikamente wurden als konzentrierte Bestände vorbereitet und in kleinen Portionen tiefgefroren. Aliquote aufgetaut waren nicht wieder eingefroren werden.
- Alle arbeiten Lösungen sollten bei 25 ° C gehalten werden
Die Züchtung von Larven Brains
1. Auswahl und Präparation der Larven Brains
- Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern.
- Fügen Sie eine kleine Menge von präparierten Medien zu einer Dissektion Uhrglas.
- Usingen einen kleinen Spachtel, abholen wandernden dritten Larvenstadium und legen Sie sie in das Uhrglas. (Wir gehen davon aus, dass die Ex-vivo-Kultur-Methode würde genauso gut auf erste oder zweite Larvenstadium, aber wir haben nicht getestet.)
- Halten Sie das hintere Ende der Larve mit einer Pinzette vorsichtig öffnen, das vordere Ende mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange.
- Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt.
2. Ex vivo Kultivierung der zerlegten Larven Brains
- Mit Pre-nass Pipettenspitzen, übertragen das Gehirn vorsichtig in die Zellkultur-Einsätzen, mit den Medien bereits ausgefüllt.
- Transfer-Gehirn, in den Medien, zu einem Brutschrank bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist. Diese Methode funktioniert effizient für bis zu 48 h in Kultur.
- Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien alle 5-6 Stunden.
3. Pharmakologische Manipulation vonLarven Brains
Diese Methode der Ex-vivo-Kultivierung verwendet werden, um pharmakologisch bestätigen genetischen Interaktionen zuvor in unserem Labor 1 nachgewiesen werden.
- In 100 uM Roscovitin und 100 uM Olomoucin auf vorbereitete Medien.
- Übertragen Sie sezierten Gehirne zu diesem Medium.
- Kultur Gehirn bei 25 ° C für 24 Stunden.
- Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien (mit Drogen) alle 5-6 Stunden.
Die Anzucht von Puppenstadium Brains
1. Die Auswahl der Puppen für Dissection
- Mark White Puppen auf Flaschen / Vials.
- Wählen Sie nur Puppen, die komplett weiß sind. Puppen mit jeder Art von Färbung sollten nicht einbezogen werden.
- Diese Phase ist 0 Stunden Nach Puparium Formation (APF).
- Diese Puppen werden bereit sein für die Dissektion 1,5 Stunden nach der Markierung. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Entwicklungsstörungen Rebschnitt erfolgt in ex vivo
2. Dissektion der Puppen
- Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. (Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern).
- Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht worden ist, eine kleine Menge von zubereiteten Medien zu einer Dissektion Uhrglas.
- Mit einem kleinen, nassen Spachtel, abholen Puppen zuvor für die Dissektion markiert und legen Sie sie in das Uhrglas.
- Halten Sie das hintere Ende der Puppen mit einer Pinzette, öffnen Sie vorsichtig das vordere Ende der Puppe Fall mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange.
- Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt und angeschlossen.
3. Ex vivo Kultivierung von Dissected Puppenstadium Brains
- Übertragen des Gehirns vorsichtig in die Zellkultur-Inserts, mit Medien vorgefüllt.
- Übertragen Gehirn, in den Medien, in einen Inkubator bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-pSalben erreicht ist. Wir verwendeten diese Methode bis zu 10 Stunden in Kultur für das gezeigte Experiment, aber es können längere Beobachtung und Behandlung verlängert werden, wenn nötig.
- Für Zeit-Punkte mehr als 8 Stunden APF, Medien ersetzen alle 5-6 Stunden.
Von diesem Schritt auf, bleibt das Protokoll unverändert sowohl für Larven und Puppen.
B. Befestigung Dissected Brains
- Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist, zu entfernen Medien und fügt 500 ul 4% Formaldehyd in 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST) für 30 Minuten, Ersetzen mit frischem Formaldehyd nach 15 Minuten.
- Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, Hirn, um zu trocknen, während Ersatz von Medien mit Fixativ.
- Abwaschen Formaldehyd mit vier 10-minütige Waschungen von 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST).
C. Färbung Feste Brains
- Nach Formaldehyd gewaschen worden ist ausgeschaltet, blockiert Gehirne für 1 Stunde in einer Blocking-Lösung aus 1x PBS mit 1% NormalZiegenserum und 1% Rinderserumalbumin.
- In primären Antikörper in Blockierungslösung gemacht.
- Inkubieren Gehirne über Nacht bei 4 ° C.
- Am nächsten Morgen abwaschen primäre Antikörper mit vier 10-minütige Waschungen PBST.
- Fügen Sie Sekundärantikörper in Blocking-Lösung gemacht.
- Lassen Sie bei Raumtemperatur für 4 Stunden.
- Abwaschen Sekundärantikörper mit vier 10 minütige Waschungen PBST.
D. Montage fixiert und gefärbt Brains für die Mikroskopie
- Äquilibrieren Gehirne in Vectashield Eindeckmittel für 1 Stunde.
- Montieren Gehirne auf Glasplättchen mit den Medien Vectashield Montage.
- Legen Glaschips auf beiden Seiten des Gehirns vor der Montage des Deckglases. Dies verhindert, dass die Gehirne nicht gequetscht, unter Beibehaltung Probe dünn genug, um alle Fokalebenen mit einem konfokalen Mikroskop zu scannen. Brains waren grob orientiert sich bei der Montage zu erleichtern Betrachtung der Merkmale von Interesse. Wenn nötig,Gehirn Bilder waren verdreht Imaris Software, um eine optimale Sicht für die Dokumentation und Messung zu liefern.
- Seal Deckgläser mit klarem Nagellack.
- Shop gleitet weg vom Licht.
E. repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt ein Panel von dritten Larvenstadium larvalen Gehirnen von (A) Wildtyp-Fliegen und (B) Fliegen, die eine dominant-negative Ableitung des Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000) zum Ausdruck bringen. Beide drücken Aktin-GFP (grün) in MB Gamma Neuronen. Wie zuvor beschrieben (Trunova et al., 2011), gibt es eine Region in den proximalen Axone von Wildtyp-Gamma-Neuronen, die an Aktin-GFP akkumulieren fehl, so zeigt sich als ein "clear zone" (A, Klammer), und fasciclin 2-Protein (rot) sammelt sich in den Axonen nur bis zu dem ventralen dieser Zone (weiße horizontale Linie). Die gepunktete Linie in der dritten Platte der 1 (A) zeigt die Position des MB, Hervorhebung der Tatin "freien Zone" und seine ventrale Grenze. In Fliegen exprimieren Cdk5DN ist das Actin freien Bereich nicht vorhanden (B) und Fasciclin 2 (FasII) Immunreaktivität breitet dorsal durch diese Region. (Beachten Sie, dass variable Anzahl von FasII-positive Axone Projekt horizontal über die MB; diese sind nicht relevant für den Phänotyp). Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
Mit unserem Verfahren der Ex-vivo-Kultivierung, behandelten wir Wildtyp-Fliegen mit einer Kombination aus Roscovitin und Olomoucin, pharmakologische Inhibitoren von Cdk5 Aktivität. Abbildung 2 zeigt eine Gruppe von Dritt-Stadiums larvalen Gehirnen der Kontrolle (A) und Arzneimittel-behandelten (B ) Wildtyp-Fliegen. Ähnlich wie bei Fliegen Expression einer dominant negativen Cdk5 Konstrukt, Gehirne mit Cdk5 Inhibitoren für 24 Stunden behandelt wurden, zeigen die charakteristische Verlust von Aktin-freien Bereich und Verschiebung FasII Grenze (eckige Klammern). Weiße Linien zeigen Position des Wildtyp-FasII Grenze. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
FiguRE 3 zeigt eine repräsentative Reihe von Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF, mit Membran-gezielte mCD8-GFP (grün) gekennzeichnet. Klammern geben den Kelch, das heißt, die dendritischen Projektionen des MB. Vor der Metamorphose, kann man sehen MB Axone Coursing dorsoventral in dicken Bündeln, sowie einem 'Haze' von Fluoreszenz-Signal aus dem dichten dendritischen Dorn (Bügel). Feld A zeigt Gehirne seziert zum Zeitpunkt angegeben. Beachten Sie, das Beschneiden von Dendriten in der Region angedeutet durch die Klammern, (obwohl die axonale Signal bleibt unberührt), so dass von 6-8 Std. APF, die Trübung der dendritischen Signal weg ist. Brains in Panel B wurden bei 0 Stunden APF seziert, bevor der interne Ecdyson Spike (Truman und Riddiford, 2002), ex vivo kultiviert und, wie angegeben. Diese zeigen keine Entwicklungsstörungen Beschneiden von Dendriten, sondern die dendritischen Signal bestehen bleibt bei 10 Stunden APF. Um dies zu umgehen, sind Puppen bei 0 Stunden APF markiert, aber seziert bei 1,5 Stunden APF und kultiviert. Scheibel C zeigt eine repräsentative Reihe dieser Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF. Wie in den nicht-kultivierten Proben, wird das durch dendritische 8 Stunden APF nicht nachweisbar. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
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Discussion
Chronische genetische Manipulationen von Gewebe Struktur und Funktion, einschließlich Mutationen und Expression von Transgenen, erzeugen in der Regel eine Kombination aus sofortiger Wirkung und späten indirekte Folgen, die nur sehr schwer zu trennen sind. Als Ergänzung zu genetischen Methoden können mit Pharmakologie erleichtern Verhör des zeitlichen Verlaufs hinter einem Phänotyp. Zum Beispiel, war dies ein starker Ansatz zum Präparieren der Beiträge der verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts während der Spermatogenese von Drosophila 10. In dem vorliegenden Beispiel hat es uns erlaubt, dass ein anhaltender Bedarf an Cdk5, um die Struktur des AIS in Drosophila zu halten. In anderen Experimenten haben wir auch Erfolg gehabt mit Drogen, die anderen zellulären Komponenten, darunter Proteinkinasen (Imatinib), Aktin-Polymerisation (Cytochalasin, Latrunculin und Jasplakinolid) und Mikrotubuli (Vinblastin und Taxol).
"> Ex vivo-Kultur-Methoden können hochauflösende Analyse der Dynamik von Entwicklungsprozessen. Frühere Studien haben kurzfristige Livebild des zentralen Gehirns 11 oder längerfristigen Abbildung anderer Abschnitte des Nervensystems beschrieben, wie die Thoracalganglien 12 und Retina / optischen Loben Verbindungen 13. Hier, während wir auf der Analyse von Gewebe durch Immunfärbung von festen Material konzentriert haben, sollte die Methode beschreiben wir anwendbar sein langfristiges Live-Bildgebung des zentralen Gehirns. Zum Beispiel einen speziellen Schnitt von Axonen und Dendriten bei der Entwicklung der Drosophila Pilzkörper ist unerlässlich für den Aufbau richtigen Anschlüsse und Innervationsmuster im zentralen Nervensystem. Zusätzlich Anomalien in der neuronalen Organisation und Umbau gedacht werden, um mehrere neurodegenerative Erkrankungen, wie Alzheimer, ALS und Parkinson zugrunde liegen. Die hier beschriebene Technik ermöglicht es uns, in emulieren vivo Umbau von Neuriten in der Drosophila Pilzkörper ex vivo, in der Kultur. Wir können jetzt Bild ändert sich in der Entwicklung als Reaktion auf genetische Veränderungen, pharmakologische Behandlungen oder Veränderungen im Umfeld.
Abbildung 1. Die Überexpression von Cdk5DN führt zum Verlust des Aktin "freien Zone" und eine Verschiebung der Grenze in FasII Gamma-Neuronen des Drosophila Pilzkörper. Feld A zeigt drei Beispiele von Wildtyp-Gehirne für die Aktin-GFP (grün) und FasII (rot) gefärbt, während Panel B zeigt zwei Beispiele von Gehirnen überexprimierenden Cdk5DN. Notieren Sie sich den Verlust des Aktin "freien Zone" (Klammer) und verlagern in der FasII ventralen Rand (horizontale weiße Linie) in (B). Die gestrichelte Linie in (A) zeigt die Position der Pilzkörper. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
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Abbildung 2. Die Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren Cdk5 Roscovitin Olomoucin und ahmt die Cdk5DN Überexpression Phänotyp in Drosophila Pilzkörper. Abbildung A zeigt zwei Steuerleitungen Wildtyp-Gehirn während Panel B zeigt zwei Arzneimittel behandelten Gehirn, für 24 Stunden kultiviert. Notieren Sie sich den Verlust des Aktin "freien Zone" (Klammer) und Verschiebung der Grenze FasII (horizontale weiße Linie) in (B). Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
Abbildung 3. In-vivo-Umbau von Dendriten der Drosophila Pilzkörper Dendriten können ex vivo rekapituliert werden. Abbildung A zeigt Gehirn an den angegebenen Zeitpunkten und gefärbt für membrangebundene GFP (grün) präpariert. Beachten Sie, Verschwinden von dendritischen Signal (diffus, grünes Signal, durch die Klammer hervorgehoben) von 8h APF. Tafel B zeigt Gehirne bei 0 Stunden APF und ex vivo kultiviert seziert ex vivo für die angegebenen Zeiten. Diese Gehirne zeigen Dendriten Schnitt ähnlich der in vivo (A) gesehen. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten alle Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Beratung, die hilfreichen Diskussionen und Kommentare zum Manuskript danken. Wir würden uns auch besonders gerne Marta Koch und Bassem Hassan für den ausgezeichneten Vorschlag, dass wir warten, bis 1,5 Stunden vor dem Sezieren APF Gehirne für die Kultivierung im Umbau Experimente danken. Wir danken auch dem NHGRI bildgebenden Einrichtung für die Nutzung ihrer konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der Basic Neuroscience Program der NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
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