وقد وضعنا مقايسة الانصهار خلية يحدد مقدار كمين بوساطة الانصهار غشاء من الأحداث تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-.
تفاعلات الفخ (ق oluble N-ethylmaleimide تراعي عامل البروتين إعادة متقبل ttachment) البروتينات على حويصلات (V-الافخاخ) وعلى الأغشية الهدف (T-الافخاخ) تحفيز الخلايا الانصهار الحويصلة 1-4. المقايسات ضرورية لإعادة تشريح آلية وتنظيم الانصهار غشاء كمين بوساطة 5. في خلية الانصهار 6،7 الفحص، يتم التعبير عن البروتينات الفخ ectopically على سطح الخلية. هذه "انقلبت" محرك الخلية البروتينات الفخ خلايا الانصهار، مما يدل على أن الافخاخ تكفي لصهر الأغشية الخلوية. لأنه يعتمد الفحص على خلية الانصهار التحليل المجهري، فمن أقل كفاءة عندما تستخدم لتحليل متعددة V-T-والتفاعلات كمين كميا.
نحن هنا وصف الفحص الجديدة 8 يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-. اثنانوتستخدم عناصر منظومة الجينات التعبير تيت أوف 9 بمثابة نظام قراءات: في transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها (TTA) ومراسل البلازميد الذي يشفر الجين LacZ تحت سيطرة العنصر التتراسيكلين والاستجابة (TRE-LacZ). نحن بالنقل نقل واكتساب التكنولوجيا في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس V-كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا V-) وبالنقل TRE-LacZ في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس تي في كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا التائية) . التي تعتمد على الانصهار كمين للV-والنتائج (خلايا تي) في ملزمة من نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE، تفعيل الترانسكربتي من LacZ والتعبير عن غالاكتوزيداز β-. وكميا نشاط غالاكتوزيداز β-اللونية باستخدام طريقة الامتصاص من قبل في 420 نانومتر.
غشاء الحويصلة البروتينات المرتبطة (الرقعات) هي V-الافخاخ الموجودة في حجرات بعد غولجي مختلف حويصلي 10-15. بالإعراب عن الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 على نفس المستوى، على قارنا الانصهار الغشاءأنشطة باستخدام الانصهار خلية الأنزيمية فحص. القياس الطيفي على أساس هذا الفحص يوفر النهج الكمي لتحليل كمين بوساطة الانصهار غشاء والإنتاجية العالية للدراسات.
انصهار الخلية الأصلية مقايسة 6 يحدد كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية بواسطة المجهر مضان. نحن هنا وصف لفحص مبتكرة يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-وقياس الطيفي. باستخدام هذا الاختبار، نحن نحلل بشكل روتيني 15 حتي 20-V و T…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من جامعة لويزفيل وCA135123 من المعاهد الوطنية للصحة (لCH).
Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
pTet-Off | Clontech | K1620-A |
pBI-G | Clontech | 6150-1 |
lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |