Summary
Nous avons développé un test de fusion cellulaire qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion membranaire activé par l'expression de la β-galactosidase.
Abstract
Les interactions des SNARE (s oluble N-éthylmaléimide facteur sensible à un ceptor re IÈCE JOINTE protéines) sur les protéines des vésicules (v-SNARE) et sur les membranes cibles (t-SNARE) catalyser la fusion des vésicules intracellulaires 1-4. Essais de reconstitution sont essentiels pour disséquer le mécanisme et la régulation de la fusion membranaire médiée SNARE 5. Dans un dosage de 6,7 fusion cellulaire, les protéines sont exprimées SNARE ectopique à la surface cellulaire. Ces "retourné" SNARE entraînement protéines de fusion cellule-cellule, ce qui démontre que SNAREs sont suffisantes pour faire fondre les membranes cellulaires. Parce que le dosage de la fusion cellulaire est basée sur l'analyse microscopique, il est moins efficace lorsqu'il est utilisé pour analyser les multiples v-et t-SNARE interactions quantitativement.
Nous décrivons ici un nouveau dosage 8 qui quantifie SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase. Deuxles composants du système Tet-Off expression génique 9 sont utilisées comme un système de lecture: le transactivateur de tétracycline-commandé (tTA) et un plasmide rapporteur qui code pour le gène LacZ sous le contrôle de l'élément de réponse à la tétracycline (TRE-LacZ). Nous transfecter tTA en cellules COS-7 exprimant v-SNARE retournées protéines à la surface cellulaire des cellules (v) et transfecter TRE-LacZ dans les cellules COS-7 exprimant retournées t-SNARE protéines à la surface cellulaire (cellules T) . SNARE dépendant de la fusion des v-et t-cellules entraîne la liaison de tTA au TRE, l'activation de la transcription de LacZ et d'expression de la β-galactosidase. L'activité de la β-galactosidase est quantifié en utilisant une méthode colorimétrique par absorbance à 420 nm.
Les protéines de la membrane des vésicules associées (Vamps) sont v-SNARE qui résident dans différents post-Golgi compartiments vésiculaires 10-15. En exprimant Vamps 1, 3, 4, 5, 7 et 8 du même niveau, on compare leur fusion membranaireactivités à l'aide du dosage enzymatique cellule de fusion. Basé sur la mesure spectrométrique, cet essai propose une approche quantitative pour l'analyse de la fusion membranaire médiée SNARE et à haut débit études.
Protocol
1. Culture cellulaire et transfection
- Cellules COS-7 sont cultivées dans du milieu de Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplémenté avec 4,5 g / l de glucose et 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
- Transfection de plasmide est fait avec la Lipofectamine conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen).
2. Fluorescence Analyse microscopique d'expression à la surface cellulaire SNARE
- Le jour avant la transfection, 3 × 10 4 cellules COS-7 sont ensemencées sur des lamelles de verre stériles de 12 mm (Fisher Scientific) contenues dans des plaques 24 puits.
- Pour v-cellules dans chaque puits, 0,25 pg du plasmide qui code tTA (pTet-Off, CLONTECH) est co-transfecté avec 0,25 ug des plasmides qui expriment retournées Vamps.
- Pour T-cellules dans chaque puits, 0,25 ug de plasmide codant TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) est co-transfecté avec 0,25 pg de chacun des plasmides qui expriment retournées SNAP-25 et syntaxins 1 ou 4.
- 24 h après le transfection, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS + + (PBS additionné de 0,1 g / l de CaCl 2 et 0,1 g / l de MgCl 2) pendant 10 min, puis bloqué dans FBS à 10% dans du PBS + + pendant 30 min.
- Les cellules sont incubées pendant 1,5 heure avec les 9E10 anti-Myc anticorps monoclonaux (soigné surnageant de culture d'hybridome).
- Après quatre lavages avec du PBS + +, les cellules sont incubées pendant 1 heure avec FITC anticorps secondaires conjugués (Jackson Laboratories Immunoresearch) à une dilution de 1:500.
- Après quatre lavages avec du PBS + +, les cellules marquées sont montés dans Prolongez réactif antifade Gold (Invitrogen).
- Les images confocales sont collectées sur un microscope confocal à balayage laser Olympus. Les images sont traitées avec le logiciel Adobe Photoshop.
3. Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire SNARE
- Le jour avant la transfection, 2 × 10 5 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque puits de plaques 6 puits.
- 24 h après le transfection avec la position relevée SNARE, pTet-Off et pBI-G plasmides, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde à 1% dans du PBS + + pendant 15 min, puis bloqué dans FBS à 10% dans du PBS + + pendant 15 min.
- Les cellules sont incubées avec les anti-Myc 9E10 anticorps monoclonaux pendant 60 min.
- Après trois lavages avec du PBS + +, les cellules sont marquées avec FITC anticorps secondaires conjugués (1:200 dilution) pendant 45 min.
- Après trois lavages avec du PBS + +, les cellules sont raclées des plaques avec un grattoir à cellules.
- 15,000 cellules sont analysées à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences). L'intensité de fluorescence moyenne de chaque échantillon est obtenue en utilisant le logiciel Pro CellQuest.
4. Dosage enzymatique Fusion cellulaire
- Le jour avant la transfection, 1,2 × 10 6 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque plat de 100 mm de culture de tissu, et 2 × 10 5 cellules COS-7 sont ensemencées dans chaque puits de plaques 6 puits.
- Pour v-cellules, de 0,5 à 5 ug de chacun de Flipped plasmide VAMP est co-transfecté avec 5 pg de pTet-Off dans les cellules de chaque boîte de culture de 100 mm. Les cellules témoins sont co-transfectées avec le vecteur vide pcDNA3.1 (+) et pTet-Off. Pour éviter que la N-glycosylation des Vamps 1, 4, 5, 7 et 8, la tunicamycine (10 pg / ml) est inclus dans un milieu de culture cellulaire pendant la transfection.
- Pour T-cellules dans chaque puits des plaques de 6 puits, 1 ug d'retournée SNAP-25 plasmide et pBI-G sont co-transfectées avec 0,5 ug de plasmide ou retourné syntaxin1 0,05 pg de plasmide syntaxin4 retourné.
- 24 heures après la transfection, les cellules sont v-détaché de boîtes de culture avec l'enzyme cellulaire sans tampon de dissociation (Invitrogen). Cellules individuelles sont comptées avec un hémocytomètre et remises en suspension dans du tampon HEPES DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 6,7 mg / ml et 0,67 tunicamycine mM de DTT.
- 4,8 × 10 5 cellules remises en suspension v-sont ajoutés à chaque puits contenant déjà les t-cellules.
- Après 6, 12 ou 24 heures chez le rat 37 ° C dans 5% de CO2
- Après 90 min, la réaction colorimétrique est arrêtée par addition de carbonate de sodium 1 M.
- L'absorbance à 420 nm est mesurée en utilisant un spectrophotomètre HITACHI 100-40.
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Representative Results
De développer un test cellulaire quantitative de fusion, nous profitons de l'activation transcriptionnelle forte par la liaison de tTA au TRE. En l'absence de tTA, la transcription du gène LacZ dans TRE-LacZ est silencieux. Lorsque tTA est présent, il se lie à la TRE et active la transcription de LacZ. La figure 1 montre un organigramme du test de fusion cellulaire enzymatique. tTA est transfecté dans v-cellules qui expriment v-SNARE protéines à la surface cellulaire, et TRE-LacZ est transfecté dans des cellules T qui expriment t-SNARE protéines à la surface cellulaire. Fusion des v-et t-cellules entraîne la liaison de tTA au TRE, l'activation de la transcription de LacZ, et l'expression de β-galactosidase.
La figure 2A illustre la structure du domaine des constructions SNARE retournées. La séquence signal preprolactin est fusionnée à l'extrémité N-terminales des collets. Ces SNARE d'ingénierie sont appelés "basculé"SNARE parce que l'orientation de leurs motifs SNARE contre les membranes cellulaires est retournée. Lorsque cellules COS-7 sont transfectées avec des plasmides SNARE renversé, retourné protéines SNARE sont exprimés à la surface cellulaire (figure 2B). La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer les niveaux d'expression des protéines SNARE à la surface cellulaire (figures 2C et D). Afin de comparer leurs capacités de fusion membranaire, vamps doivent être exprimés au même niveau. Par conséquent, nous titré et optimisé la concentration de chaque retourné SNARE plasmide utilisé dans la transfection. Flipped plasmides sont transfectés SNARE aux concentrations suivantes (pour 10 cm 2 zone de croissance, c'est à dire, par puits dans des plaques 6 puits): VAMP1, 0,2 pg; VAMP3, 0,5 ug; VAMP4, 0,5 ug; VAMP5, 0,05 g; VAMP7, 1,0 pg; VAMP8, 0,1 pg; syntaxin1, 0,5 g; syntaxin4, 0,05 pg. tTA, TRE-LacZ et a renversé la SNAP-25 ont été co-transfectés à 1 pg par 10 cm 2 zone de croissance. En vertu de succèsh Conditions Vamps, 1, 3, 4, 5, 7 et 8 sont exprimés au même niveau, tandis que syntaxins 1 et 4 sont exprimés au même niveau à la surface cellulaire (figure 2D). Comme l'a montré l'analyse contraste de l'image confocale et la phase (figure 2E), 80% des cellules COS-7 sont transfectées avec des plasmides SNARE retournées. Analyse d'imagerie à double marquage (figure 2F) indique que 70% des cellules transfectées v-tTA et exprimer à la fois les protéines VAMP renversé. Parce que le gène LacZ dans TRE-LacZ n'est pas exprimé avant la fusion cellulaire, nous ne sommes pas en mesure de déterminer le pourcentage de cellules transfectées t-exprimer à la fois que les TRE-LacZ et renversé t-SNARE protéines.
Les SNARE neuronales (v-SNARE VAMP2, et t-SNARE syntaxin1 et SNAP-25) qui interviennent dans l'exocytose synaptique sont utilisés pour tester la faisabilité de l'essai. En effet, lorsque les cellules exprimant v-t-VAMP2 et des cellules exprimant syntaxin1/SNAP-25 sont combinés, robuste β-galactosetosidase expression est détectée (figure 3). Toutefois, lorsque l'VAMP2 ou SNAP-25 n'est pas exprimé, seulement référence β-galactosidase est détectée, indiquant que la fusion cellulaire et l'expression de la β-galactosidase s'appuyer sur les interactions entre v-et t-SNARE. Ces résultats indiquent que le dosage enzymatique de fusion cellulaire identifie paires fusogènes entre v et t-SNARE efficacement.
En exprimant les protéines VAMP au même niveau à la surface cellulaire (figure 2D), nous comparons leurs activités de fusion membranaire. Avec le t-SNARE syntaxin1/SNAP-25, vamps 1, 3, et 8 ont comparable et les activités les plus fusion, alors que VAMPS 4 et 7 ont 50% et 30% des activités de fusion plus bas, respectivement (figure 4). En revanche, lorsque VAMP5 est combiné avec les t-SNARE, seule base β-galactosidase est détectée (figure 4), ce qui suggère que VAMP5 ne pas conduire la fusion membranaire avec la syntaxin1/SNAP-25.
Figure 1. Dosage enzymatique fusion cellulaire. tTA est cotransfecté avec retournées v-SNARE plasmides et TRE-LacZ est cotransfecté avec retournées t-SNARE plasmides. La fusion de V-et t-cellules conduit à la liaison de tTA à TRE et l'expression de la β-galactosidase, qui est mesurée par une méthode colorimétrique.
Figure 2. Expression des SNARE renversé à la surface cellulaire. (A) Structure domaine des retourné SNARE. La séquence signal preprolactin (SS) est fusionnée à l'extrémité N-terminales des pièges, et une étiquette myc est inséré entre la séquence signal et les motifs anse (coiled-coil). (B) cellules COS-7 sont co-transfectées par tTA et le vecteur vide pcDNA3.1 (+) ou retournée VAMP5 plasmide. 24h après la transfection, les cellules sont colorées unpermeabilized avec un anticorps monoclonal anti-myc. Représentant une seule tranche images confocales sont affichés. (C et D) 24 heures après co-transfection avec tTA et pcDNA3.1 (+) ou retournée Vamps (v-cellules), ou 24 heures après co-transfection avec TRE-LacZ, a renversé la SNAP-25 et syntaxins 1 ou 4 (cellules T ), les cellules sont colorées unpermeabilized avec l'anticorps anti-Myc et analysées par cytométrie en flux. (C) représentant profils FACS des cellules transfectées avec pcDNA3.1 (+) ou retournée VAMP1 plasmide. L'intensité de fluorescence moyenne de chaque échantillon est déterminée en utilisant le logiciel Pro CellQuest. (D) Pour exprimer vamps au même niveau et expresse syntaxins 1 et 4 au même niveau à la surface des cellules, plasmides retourné SNARE sont transfectées à des concentrations titrées. Indiqués sont les intensités moyennes de fluorescence de coloration de la surface cellulaire des protéines SNARE. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de 4 expériences indépendantes. (E et F) 24 heures après cotransfe ction de tTA et déplacé VAMP5 plasmide, les cellules sont permeablized avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS + + et (E) colorées avec l'anticorps anti-Myc, ou (F) teinté double avec l'anticorps monoclonal anti-myc et un anticorps polyclonal de le répresseur tet (pour détecter tTA). (E) indiquées sont confocale représentant et des images à contraste de phase. Le nombre de cellules transfectées qui sont marquées par l'anticorps anti-Myc (VAMP5) et le nombre total de cellules dans la chaîne sont comptées à contraste de phase (n = 60 cellules), et l'efficacité de transfection est calculée (80%). (F) Le nombre de cellules transfectées qui expriment à la fois VAMP5 et tTA, et le nombre total de cellules transfectées qui expriment VAMP5, tTA ou les deux sont comptés (n = 75 cellules transfectées). Le pourcentage des cellules transfectées qui expriment à la fois VAMP5 et tTA est alors calculée (70%). Barres d'échelle, 20 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Fusion cellulaire dépend des interactions de v-et t-SNARE. v-cellules qui expriment tTA et VAMP2 sont incubées avec des lymphocytes T qui expriment TRE-LacZ, syntaxin1 et SNAP-25. Après 24 h, les cellules sont lysées et l'activité de la β-galactosidase dans les lysats cellulaires est déterminée en utilisant une méthode colorimétrique par absorbance à 420 nm. Seulement base b-galactosidase est détectée lorsque soit retourné VAMP2 ou SNAP-25 plasmide est omis de la transfection.
Figure 4. Comparaison des activités de fusion des vampires. Dans des conditions de transfection optimisées, vamps 1, 3, 4, 5, 7 et 8 sont exprimés au même niveau à la surface cellulaire des cellules v. 24 heures après la combinaison des v-cellules avec les cellules T que les ancienssyntaxin1/SNAP-25 presse, la fusion cellulaire est quantifiée en utilisant le test enzymatique cellule de fusion. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de 4 expériences indépendantes. ** P <0,01; *** p <0,001 vs VAMP1.
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Discussion
Le dosage de la fusion cellulaire d'origine 6 détermine SNARE médiation événements de fusion de cellules par microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici un test innovant qui permet de quantifier SNARE médiées par les événements de fusion cellulaire activé par l'expression de la β-galactosidase et la mesure spectrométrique. En utilisant ce test, nous avons l'habitude d'analyser 15 à 20 V et t-SNARE combinaisons en une seule expérience. En utilisant la cytométrie en flux pour mesurer l'expression SNARE à la surface cellulaire, nous titrer les niveaux d'expression des vamps et de comparer leurs capacités de fusion membranaire (figures 2 et 4). De plus, en utilisant le test enzymatique de fusion cellulaire, on détermine la dépendance de l'activité de la densité de la fusion cellulaire de surface cellulaire de la protéine VAMP1, et observé aucune coopérativité de VAMP1 protéine dans la cellule de réaction de fusion 8, ce qui suggère que l'action concertée de plusieurs complexes SNARE n'est pas nécessaire de fusionner les membranes cellulaires.
Il ya putatif de N-glycosylation motivationfs (Asn-X-Ser/Thr) dans les protéines SNARE. Parce que la N-glycosylation inhibe l'activité de fusion des protéines SNARE retourné 6, deux approches ont été utilisées pour empêcher la glycosylation des protéines SNARE retournées. Tout d'abord, le site de glycosylation des mutations sont introduites dans retournée SNARE construit 6. Deuxièmement, comme décrit dans le protocole actuel, la tunicamycine inhibiteur de N-glycosylation (6,7 pg / ml) est inclus dans la réaction de fusion cellulaire. En outre, 0,67 mM de DTT est ajouté dans la réaction de fusion cellulaire pour empêcher la formation de ponts disulfures entre les protéines SNARE renversé, qui inhibent les activités de fusion piège. Nos expériences montrent que l'ajout de 6,7 mg / ml et 0,67 tunicamycine mM de DTT dans un milieu de culture cellulaire n'interfère pas avec la prolifération et la survie des cellules COS-7. Nous avons régulièrement mettre fin à la réaction de fusion cellulaire à 24 h après la combinaison de v et t-cellules. Toutefois, la fusion cellulaire significative SNARE médiation est détecté 6 heures après la combinaison de v-ae t-cellules 8. Parce que la réaction enzymatique cellule de fusion dépend de l'expression de la β-galactosidase après la fusion cellulaire, l'évolution dans le temps de ce système de lecture en retard sur le cours du temps de la fusion membranaire médiée par des protéines SNARE retournées.
Le dosage enzymatique de fusion cellulaire offre un essai de reconstitution quantitative de l'examen des activités de fusion membranaire des potentiels V et t-SNARE interactions dans les cellules de mammifères. Par des protéines co-exprimant réglementaires (par exemple, Munc18) et les embûches à la surface cellulaire ou en incluant des protéines recombinantes de réglementation dans la réaction de fusion cellulaire, ce test peut être utilisé pour élucider les mécanismes de régulation de la fusion membranaire médiée SNARE. En outre, ce test devrait avoir des applications dans criblage à haut débit d'inhibiteurs ou des activateurs de la fusion membranaire médiée SNARE.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage de l'Université de Louisville et CA135123 du National Institutes of Health (au CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
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