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Biology

जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन के विश्लेषण से एक enzymatic सेल फ्यूजन परख का उपयोग

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4378
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

Summary

हम एक सेल संलयन परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन घटनाओं quantifies विकसित किया है.

Abstract

जाल (एस एन ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील oluble कारक एक ttachment प्रोटीन फिर नाड़ी का अंतिम सिरा) vesicles (v-snares) पर और लक्ष्य झिल्ली पर प्रोटीन की बातचीत (टी Snares) intracellular पुटिका संलयन 1-4 उत्प्रेरित. पुनर्गठन assays तंत्र और जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन 5 के विनियमन विदारक के लिए आवश्यक हैं. एक सेल संलयन परख में 6,7, जाल प्रोटीन ectopically कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं. ये जाल प्रोटीन ड्राइव संलयन सेल सेल "रूप से फ़्लिप", प्रदर्शन है कि Snares सेलुलर झिल्ली को फ्यूज करने के लिए पर्याप्त हैं. है क्योंकि सेल में विलय परख सूक्ष्म विश्लेषण पर आधारित है, यह कम कुशल है जब कई v-और टी जाल बातचीत मात्रात्मक विश्लेषण किया.

यहाँ हम एक नया 8 परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं quantifies का वर्णन करता है. दोटेट्रासाइक्लिन नियंत्रित (TTA) transactivator और एक प्लाज्मिड पत्रकार कि टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व के नियंत्रण (TRE lacZ) के तहत lacZ जीन encodes: Tet ऑफ जीन अभिव्यक्ति 9 प्रणाली के घटकों के एक readout प्रणाली के रूप में किया जाता है. क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त टी जाल प्रोटीन रूप से फ़्लिप (टी कोशिकाओं) में व्यक्त v-जाल प्रोटीन कोशिका की सतह पर (v-कोशिकाओं) और TRE lacZ transfect रूप से फ़्लिप में हम transfect TTA . V-और TTA TRE, lacZ के transcriptional सक्रियण और β-galactosidase की अभिव्यक्ति करने के लिए बाध्य में टी कोशिकाओं के परिणामों के संलयन जाल पर निर्भर है. β-galactosidase की गतिविधि absorbance 420 एनएम पर वर्णमिति पद्धति का उपयोग करके मात्रा निर्धारित है.

पुटिका से जुड़े झिल्ली प्रोटीन (पिशाचों) v-Snares है कि विभिन्न पद Golgi vesicular डिब्बों में 10-15 रहते हैं. Vamps 1, 3, 4, 5, 7 और 8 में एक ही स्तर पर व्यक्त की, हम उनके झिल्ली संलयन की तुलनागतिविधियों enzymatic सेल संलयन परख का उपयोग कर. Spectrometric माप के आधार पर, इस परख जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन का विश्लेषण करने के लिए और उच्च throughput अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

Protocol

1. सेल संस्कृति और प्रोटोकॉल

  1. COS-7 कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक में संवर्धित कर रहे हैं.
  2. प्लास्मिड अभिकर्मक Lipofectamine साथ निर्माता के निर्देशों (Invitrogen) के अनुसार किया जाता है.

2. कोशिका की सतह जाल अभिव्यक्ति की सूक्ष्म विश्लेषण प्रतिदीप्ति

  1. अभिकर्मक के पहले दिन, 3 × 10 4 कोशिकाओं COS-7 बाँझ 12 मिमी ग्लास (फिशर साइंटिफिक) 24 अच्छी तरह प्लेटें में निहित coverslips पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
  2. V प्लाज्मिड कि TTA encodes के प्रत्येक अच्छी तरह से, 0.25 ग्राम में कोशिकाओं के लिए (PTET ऑफ, CLONTECH) प्लास्मिड है कि एक्सप्रेस पिशाचों रूप से फ़्लिप 0.25 ग्राम के साथ cotransfected है.
  3. प्रत्येक में अच्छी तरह से टी कोशिकाओं के लिए प्लाज्मिड एन्कोडिंग TRE lacZ (PBI जी, CLONTECH) की 0.25 ग्राम 0.25 ग्राम plasmids कि एक्सप्रेस SNAP-25 और 1 syntaxins या 4 रूप से फ़्लिप प्रत्येक के साथ cotransfected है.
  4. टी के बाद 24 घंटापीबीएस में 4% paraformaldehyde + + (पीबीएस 0.1 एल / छ 2 CACL और 0.1 एल / छ 2 MgCl के साथ 10 मिनट के लिए पूरक), और फिर पीबीएस में 10% FBS में अवरुद्ध + + 30 मिनट के लिए के साथ ransfection कोशिकाओं, तय कर रहे हैं.
  5. कोशिकाओं विरोधी Myc मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 9E10 (स्वच्छ हाइब्रिडोमा संस्कृति तैरनेवाला) के साथ 1.5 घंटे के लिए incubated हैं.
  6. के साथ चार washes के बाद PBS + +, कोशिकाओं FITC संयुग्मित 1:500 का एक कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी (जैक्सन Immunoresearch प्रयोगशालाओं) के साथ 1 घंटे के लिए incubated हैं.
  7. के साथ चार washes के बाद PBS + +, लेबल की कोशिकाओं लम्बा गोल्ड antifade अभिकर्मक (Invitrogen) में बढ़ रहे हैं.
  8. Confocal छवियों एक ओलिंप लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन पर एकत्र होते हैं. छवियों Adobe Photoshop सॉफ्टवेयर के साथ कार्रवाई कर रहे हैं.

3. कोशिका की सतह जाल अभिव्यक्ति की FACS विश्लेषण

  1. अभिकर्मक पहले दिन, 2 × 10 5 कोशिकाओं COS 7 6 अच्छी तरह प्लेटें प्रत्येक कुएं में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
  2. टीआरए के बाद 24 घंटासाथ nsfection जाल, PTET ऑफ और PBI - जी plasmids रूप से फ़्लिप, कोशिकाओं पीबीएस में 1% paraformaldehyde के साथ 15 मिनट के लिए तय कर रहे हैं, और फिर पीबीएस में 10% FBS में 15 मिनट के लिए बंद है.
  3. कोशिकाओं विरोधी Myc 60 मिनट के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 9E10 साथ incubated हैं.
  4. के साथ तीन washes के बाद PBS + +, कोशिकाओं FITC संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200 कमजोर पड़ने) के साथ 45 मिनट के लिए दिया जाता है.
  5. पीबीएस के साथ तीन washes के बाद + +, कोशिकाओं बंद scraped एक सेल खुरचनी के साथ प्लेटें.
  6. 15,000 कोशिकाओं एक FACSCalibur प्रवाह cytometer (बी.डी. बायोसाइंसेज) का उपयोग का विश्लेषण कर रहे हैं. प्रत्येक नमूने का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता CellQuest प्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त की है.

4. Enzymatic सेल फ्यूजन परख

  1. अभिकर्मक एक दिन पहले 1.2 × 10 6 कोशिकाओं COS-7 प्रत्येक ऊतक 100 मिमी संस्कृति डिश में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, और 2 × 10 5 COS-7 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटें प्रत्येक कुएं में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
  2. - 5 ग्राम flipp के प्रत्येक v कोशिकाओं, 0.5 के लिएएड प्लाज्मिड खलनायिका प्रत्येक 100 मिमी संस्कृति डिश में कोशिकाओं में PTET ऑफ की 5 ग्राम के साथ cotransfected है. नियंत्रण कक्ष खाली सदिश (+) pcDNA3.1 और PTET ऑफ के साथ cotransfected हैं. पिशाचों 1, 4, 5, 7 और 8, tunicamycin एन ग्लाइकोसिलेशन रोकने के लिए (10 ग्राम / एमएल) अभिकर्मक दौरान सेल संस्कृति माध्यम में शामिल है.
  3. छह अच्छी तरह प्लेटें के प्रत्येक अच्छी तरह से टी कोशिकाओं के लिए, 1 ग्राम SNAP-25 प्लाज्मिड रूप से फ़्लिप किया और PBI जी 0.5 के ग्राम के साथ cotransfected हैं प्लास्मिड syntaxin1 या 0.05 syntaxin4 रूप से फ़्लिप प्लाज्मिड के ग्राम फ़्लिप किया.
  4. अभिकर्मक के बाद 24 घंटा, v-कोशिकाओं संस्कृति व्यंजन से एनजाइम मुक्त सेल हदबंदी बफर (Invitrogen) के साथ अलग कर रहे हैं. असम्बद्ध कोशिकाओं एक hemacytometer के साथ गिना जाता है और में resuspended HEPES बफर DMEM 10% FBS, 6.7 / ग्राम मिलीलीटर tunicamycin और 0.67 मिमी डीटीटी के साथ पूरक है.
  5. 4.8 × 10 resuspended 5 वी कोशिकाओं प्रत्येक पहले से ही अच्छी तरह से टी कोशिकाओं से युक्त करने के लिए जोड़ रहे हैं.
  6. 12, 6, या 24 घंटे 37 चूहे के बाद ° C 5% सीओ 2 में
  7. 90 मिनट के बाद, वर्णमिति प्रतिक्रिया 1 एम सोडियम कार्बोनेट जोड़कर बंद कर दिया है.
  8. 420 एनएम पर Absorbance एक HITACHI 100-40 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर मापा जाता है.

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Representative Results

एक मात्रात्मक सेल संलयन परख विकास, हम TTA की TRE के बंधन से मजबूत transcriptional सक्रियण का लाभ ले लो. TTA के अभाव में, TRE lacZ में lacZ जीन का प्रतिलेखन चुप है. जब TTA मौजूद है, यह TRE करने के लिए बांध और lacZ का प्रतिलेखन सक्रिय चित्रा 1 enzymatic सेल संलयन परख की एक प्रवाह संचित्र से पता चलता है. TTA v-कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त v-जाल, प्रोटीन और TRE - lacZ टी कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त टी जाल प्रोटीन. V-और TTA TRE, lacZ के transcriptional सक्रियण, और β-galactosidase की अभिव्यक्ति करने के लिए बाध्य में टी कोशिकाओं के परिणामों के फ्यूजन.

चित्रा 2A रूप से फ़्लिप जाल constructs के डोमेन संरचना दिखाता है. preprolactin संकेत अनुक्रम Snares एन टर्मिनी जुड़े हुए है. ये इंजीनियर Snares रूप से फ़्लिप 'कहा जाता हैSnares क्योंकि सेलुलर झिल्लियाँ के खिलाफ अपने जाल रूपांकनों के उन्मुखीकरण फ़्लिप किया है. COS-7 कोशिकाओं रूप से फ़्लिप जाल plasmids साथ ट्रांसफ़ेक्ट रूप से फ़्लिप, जाल प्रोटीन कोशिका की सतह (चित्रा 2B) में व्यक्त कर रहे हैं. प्रवाह cytometry कोशिका की सतह (आंकड़े 2C और डी) में जाल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए किया जाता है. आदेश में उनके झिल्ली संलयन क्षमता की तुलना करने के लिए, पिशाचों के लिए एक ही स्तर पर व्यक्त किया की जरूरत है. इसलिए, हम titrated और अनुकूलित प्रत्येक की एकाग्रता जाल रूप से फ़्लिप अभिकर्मक में प्लाज्मिड इस्तेमाल किया. रूप से फ़्लिप जाल plasmids निम्नलिखित (प्रति 10 सेमी 2 विकास क्षेत्र, यानी, 6 अच्छी तरह प्लेटें में प्रति), सांद्रता में ट्रांसफ़ेक्ट हैं:; VAMP3, 0.5 ग्राम, VAMP4, 0.5 ग्राम, VAMP5, 0.05 ग्राम, VAMP1, 0.2 ग्राम VAMP7 1.0 ग्राम, VAMP8, 0.1 ग्राम, syntaxin1, 0.5 ग्राम, syntaxin4, 0.05 ग्राम. TTA, TRE lacZ और SNAP-25 रूप से फ़्लिप 1 ग्राम प्रति 10 सेमी 2 विकास क्षेत्र में cotransfected थे. सफलता के तहतघंटे शर्तों, पिशाचों 1, 3, 4, 5, 7 और 8 के एक ही स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, जबकि 1 और 4 syntaxins कोशिका की सतह (चित्रा 2 डी) में एक ही स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं. Confocal और चरण विपरीत छवि विश्लेषण (चित्रा 2E) में दिखाया गया है, COS-7 कोशिकाओं के 80% रूप से फ़्लिप जाल plasmids साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. दोहरी लेबलिंग इमेजिंग विश्लेषण (चित्रा 2 एफ) इंगित करता है कि ट्रांसफ़ेक्ट v-कोशिकाओं के 70% दोनों TTA व्यक्त और खलनायिका प्रोटीन रूप से फ़्लिप. क्योंकि TRE lacZ में lacZ जीन सेल संलयन से पहले व्यक्त नहीं है, हम टी कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट का प्रतिशत है कि दोनों TRE lacZ व्यक्त और टी जाल प्रोटीन रूप से फ़्लिप निर्धारित करने में सक्षम नहीं हैं.

neuronal (v-VAMP2 जाल, और टी - Snares syntaxin1 और स्नैप - 25) Snares है कि synaptic exocytosis मध्यस्थता परख की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए किया जाता है. दरअसल, जब v कोशिकाओं व्यक्त VAMP2 और टी कोशिकाओं syntaxin1/SNAP-25 व्यक्त संयुक्त रहे हैं, मजबूत β galactosidase अभिव्यक्ति (3 चित्रा) का पता चला है. हालांकि, जब या तो VAMP2 या तस्वीर-25 व्यक्त नहीं है, केवल आधारभूत β-galactosidase गतिविधि का पता चला है, यह दर्शाता है कि सेल संलयन और β-galactosidase की अभिव्यक्ति v-और टी Snares की बातचीत पर निर्भर है. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि enzymatic सेल संलयन परख v-और टी Snares कुशलता के बीच fusogenic pairings को पहचानती है.

कोशिका की सतह (चित्रा 2 डी) में एक ही स्तर पर खलनायिका प्रोटीन व्यक्त करके, हम उनके झिल्ली संलयन गतिविधियों की तुलना करें. टी Snares syntaxin1/SNAP-25, vamps 1, 3, और 8 तुलनीय और उच्चतम संलयन गतिविधियों में है, जबकि 4 पिशाचों और 7 50% है और 30% कम संलयन गतिविधियों, क्रमशः (चित्रा 4) के साथ. इसके विपरीत, जब VAMP5 टी Snares के साथ संयुक्त है, केवल आधारभूत β-galactosidase गतिविधि (4 चित्रा) का पता चला है, सुझाव है कि VAMP5 synt साथ झिल्ली संलयन ड्राइव नहींaxin1/SNAP-25.

चित्रा 1
चित्रा 1 Enzymatic सेल संलयन परख. TTA रूप से फ़्लिप v-जाल plasmids के साथ cotransfected है, और TRE lacZ रूप से फ़्लिप टी जाल plasmids के साथ cotransfected है. वी और टी कोशिकाओं के संलयन TTA की TRE और β-galactosidase, जो एक वर्णमिति विधि द्वारा मापा जाता है की अभिव्यक्ति करने के लिए बाध्य करने के लिए होता है.

चित्रा 2
चित्रा 2 अभिव्यक्ति की कोशिका की सतह पर snares फ़्लिप किया. (ए) डोमेन की संरचना Snares फ़्लिप किया. preprolactin संकेत अनुक्रम (एसएस) Snares एन टर्मिनी जुड़े हुए है, और एक Myc टैग संकेत अनुक्रम और जाल रूपांकनों (coiled तार) के बीच में डाला जाता है. (बी) क्योंकि 7-कोशिकाओं TTA के साथ cotransfected हैं और खाली सदिश pcDNA3.1 (+) या VAMP5 रूप से फ़्लिप प्लाज्मिड. 24अभिकर्मक के बाद घंटा, unpermeabilized कोशिकाओं एक विरोधी Myc मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं. प्रतिनिधि एकल टुकड़ा confocal छवियों दिखाए जाते हैं. (सी और डी) TTA और pcDNA3.1 (+) के साथ cotransfection के बाद 24 घंटे या रूप से फ़्लिप (v-कोशिकाओं) पिशाचों, या TRE lacZ साथ cotransfection बाद 24 घंटा, रूप से फ़्लिप SNAP-25 और 1 syntaxins या 4 (टी कोशिकाओं ), unpermeabilized कोशिकाओं विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया. (सी) कोशिकाओं के प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल pcDNA3.1 (+) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या VAMP1 रूप से फ़्लिप प्लाज्मिड. प्रत्येक नमूने का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता CellQuest प्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. (डी) एक ही स्तर पर पिशाचों को व्यक्त करने के लिए और कोशिका की सतह पर एक ही स्तर पर व्यक्त syntaxins 1 और 4 के रूप से फ़्लिप, जाल plasmids titrated सांद्रता में ट्रांसफ़ेक्ट रहे हैं. दिखाया सेल जाल प्रोटीन की सतह धुंधला हो जाना का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं. त्रुटि सलाखों 4 स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ई और एफ) cotransfe के बाद 24 घंटे TTA साथ ction और रूप से फ़्लिप VAMP5 प्लाज्मिड, कोशिकाओं के साथ permeablized हैं 0.2% ट्राइटन पीबीएस में X-100 + + और (ई) विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ दाग, या (एफ) के साथ दोहरी दाग ​​विरोधी Myc मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी TET repressor (TTA का पता लगाने के लिए). (ई) प्रतिनिधि confocal और चरण विपरीत छवियों दिखाए जाते हैं. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं है कि विरोधी Myc (VAMP5) एंटीबॉडी और चरण विपरीत चैनल में कोशिकाओं की कुल संख्या (n = 60 कोशिकाओं) गिना, और अभिकर्मक दक्षता (80%) की गणना के द्वारा चिह्नित कर रहे हैं की संख्या. (एफ) कि दोनों VAMP5 और TTA व्यक्त ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या, और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कुल संख्या है कि एक्सप्रेस VAMP5, TTA या दोनों (n = 75 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं) में गिने जाते हैं. कि दोनों VAMP5 और TTA व्यक्त ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का प्रतिशत (70%) की गणना की जाती है. स्केल सलाखों, 20 सुक्ष्ममापी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

"के लिए: रखने together.within पृष्ठ ="> हमेशा " चित्रा 3
चित्रा 3 सेल संलयन v-और टी Snares की बातचीत पर निर्भर करता है. v कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस TTA और VAMP2 टी कोशिकाओं के साथ incubated हैं कि व्यक्त TRE lacZ, syntaxin1 और SNAP-25. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं lysed और सेल lysates में β-galactosidase की गतिविधि absorbance 420 एनएम पर वर्णमिति पद्धति का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है. जब या तो केवल आधारभूत गतिविधि ख galactosidase VAMP2 रूप से फ़्लिप या अभिकर्मक प्लाज्मिड SNAP-25 से छोड़ दिया जाता है पता चला है.

चित्रा 4
चित्रा 4 पिशाचों के संलयन गतिविधियों की तुलना. अनुकूलित अभिकर्मक शर्तों, पिशाचों 1, 3, 4, 5, 7 और 8 के तहत v-कोशिकाओं की कोशिका की सतह पर एक ही स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं. वी टी कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं के संयोजन के बाद 24 घंटा है कि पूर्वsyntaxin1/SNAP-25 प्रेस, सेल संलयन enzymatic सेल संलयन परख का उपयोग मात्रा निर्धारित है. त्रुटि सलाखों 4 स्वतंत्र प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. ** पी <0.01, पी *** <.001 बनाम VAMP1.

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Discussion

मूल सेल संलयन 6 परख प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं को निर्धारित करता है. यहाँ हम एक अभिनव परख कि β galactosidase और spectrometric माप सक्रिय अभिव्यक्ति द्वारा जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं quantifies का वर्णन करता है. इस परख का प्रयोग, हम नियमित रूप से 15 का विश्लेषण - 20 वी और टी जाल एक ही प्रयोग में संयोजन. प्रवाह cytometry कोशिका की सतह पर जाल अभिव्यक्ति उपाय का प्रयोग, हम पिशाचों की अभिव्यक्ति के स्तर टाइट्रेट और उनके झिल्ली संलयन क्षमता (2 आंकड़े और 4) की तुलना करें. इसके अलावा, enzymatic सेल संलयन परख का उपयोग करते हुए, हम सेल VAMP1 प्रोटीन की सतह घनत्व पर सेल संलयन गतिविधि की निर्भरता निर्धारित किया है, और 8 सेल संलयन प्रतिक्रिया में VAMP1 प्रोटीन की कोई cooperativity मनाया, सुझाव है कि कई परिसरों की जाल ठोस कार्रवाई की आवश्यकता नहीं है सेलुलर झिल्लियाँ फ्यूज.

ख्यात एन ग्लाइकोसिलेशन मोतीएफएस (Asn-X-Ser/Thr) जाल प्रोटीन में. क्योंकि एन ग्लाइकोसिलेशन रोकता जाल के संलयन गतिविधियों 6 प्रोटीन रूप से फ़्लिप, दो दृष्टिकोण रूप से फ़्लिप जाल प्रोटीन की ग्लाइकोसिलेशन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सबसे पहले, ग्लाइकोसिलेशन साइट म्यूटेशनों रूप से फ़्लिप जाल 6 constructs में पेश कर रहे हैं. दूसरा, के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित अवरोध करनेवाला एन ग्लाइकोसिलेशन tunicamycin (6.7 ग्राम / मिलीलीटर) सेल संलयन प्रतिक्रिया में शामिल है. इसके अलावा, 0.67 मिमी डीटीटी सेल संलयन प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है डीसल्फाइड बॉन्ड रूप से फ़्लिप जाल प्रोटीन के बीच के गठन को रोकने के लिए, है जो जाल संलयन गतिविधियों को रोकना होगा. हमारे प्रयोगों चलता है कि 6.7 ग्राम / मिलीलीटर tunicamycin और सेल संस्कृति माध्यम में 0.67 मिमी डीटीटी के अलावा COS-7 कोशिकाओं के प्रसार और अस्तित्व के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. हम नियमित रूप से 24 घंटे में v-और टी कोशिकाओं के संयोजन के बाद सेल संलयन प्रतिक्रिया को समाप्त. बहरहाल, महत्वपूर्ण सेल जाल की मध्यस्थता संलयन v-एक संयोजन के बाद 6 घंटा पता चला हैएन डी टी कोशिकाओं 8. क्योंकि enzymatic सेल संलयन प्रतिक्रिया सेल विलय के बाद β-galactosidase की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, इस प्रणाली के readout समय पाठ्यक्रम झिल्ली संलयन रूप से फ़्लिप जाल प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता के समय पाठ्यक्रम lags.

enzymatic सेल संलयन परख स्तनधारी कोशिकाओं में संभावित बातचीत के वी और टी जाल झिल्ली संलयन गतिविधियों की जांच के लिए एक मात्रात्मक पुनर्गठन परख प्रदान करता है. द्वारा coexpressing नियामक (जैसे, Munc18) प्रोटीन और कोशिका की सतह पर या सेल संलयन प्रतिक्रिया में पुनः संयोजक विनियामक प्रोटीन सहित snares, इस परख जाल मध्यस्थता झिल्ली संलयन के विनियामक तंत्र स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस परख inhibitors या जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन के activators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग में आवेदन करना चाहिए.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम स्टार्टअप धन के द्वारा स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से Louisville और CA135123 के विश्वविद्यालय (CH) से समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

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References

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Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

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