Summary
Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.
Abstract
Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi "girato" SNARE unità proteine fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente.
Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall'espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l'attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L'attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm.
Le vescicole associate proteine di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l'analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.
Protocol
1. Cultura e transfezione cellulare
- COS-7 cellule vengono coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 4,5 g / l di glucosio e 10% di siero bovino fetale (FBS).
- Trasfezione plasmide è fatto con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen).
2. Analisi al microscopio di fluorescenza Expression SNARE della superficie cellulare
- Il giorno prima della transfezione, 3 × 10 4 cellule COS-7 sono seminate su sterili 12-millimetri vetrini (Fisher Scientific) contenuti in piastre da 24 pozzetti.
- Per v-celle in ciascun pozzetto, 0,25 microgrammi di plasmide che codifica tTA (pTet-Off, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg di plasmidi che esprimono capovolto vampiri.
- Per le cellule T in ogni pozzetto, 0,25 mg del plasmide codificante TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg ciascuno dei plasmidi che esprimono capovolte SNAP-25 e sintaxine 1 o 4.
- 24 ore dopo transfection, le cellule vengono fissate con 4% paraformaldeide in PBS + + (PBS supplementato con 0,1 g / l CaCl 2 e 0,1 g / l MgCl 2) per 10 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 30 min.
- Le cellule sono incubate per 1,5 ore con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali (neat supernatante di coltura di ibridoma).
- Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule vengono incubate per 1 ora con anticorpi secondari coniugati con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) alla diluizione di 1:500.
- Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule marcate sono montati in oro antifade Prolungare reagente (Invitrogen).
- Immagini confocali sono raccolti su un microscopio laser confocale Olympus scansione. Le immagini vengono elaborate con il software Adobe Photoshop.
3. Analisi FACS di espressione SNARE della superficie cellulare
- Il giorno prima della transfezione, 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
- 24 ore dopo la tradinsfection con la capovolto SNARE, pTet-Off e pBI-G plasmidi, le cellule vengono fissate con 1% paraformaldeide in PBS + + per 15 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 15 min.
- Le cellule sono incubate con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali per 60 min.
- Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono marcate con anticorpi secondari coniugati con FITC (diluizione 1:200) per 45 min.
- Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono raschiate le piastre con un raschietto cellulare.
- 15.000 cellule vengono analizzate usando un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). L'intensità di fluorescenza media di ciascun campione è ottenuta utilizzando il software CellQuest Pro.
4. Enzimatica cellulare Assay Fusion
- Il giorno prima della transfezione, 1,2 x 10 6 cellule COS-7 sono seminate in ogni 100 mm piatto di coltura di tessuti, e 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
- Per v-cellule, 0,5 - 5 mg ogni Flipped plasmide VAMP è cotransfected con 5 pg di pTet-Off nelle celle di ogni 100 mm piatto di coltura. Cellule di controllo sono co-trasfettate con il vettore vuoto pcDNA3.1 (+) e pTet-Off. Per impedire la N-glicosilazione di VAMPS 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 pg / ml) è incluso nel mezzo di coltura cellulare durante la trasfezione.
- Per cellule T in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti, 1 ug di capovolte SNAP-25 e plasmide pBI-G vengono cotrasfettate con 0,5 pg di plasmide o capovolto syntaxin1 0,05 pg di plasmide syntaxin4 capovolte.
- 24 ore dopo la trasfezione, le v-cellule sono staccate da piastre di coltura con l'enzima senza dissociazione cellulare Buffer (Invitrogen). Cellule staccati sono contate con un emocitometro e risospese in tampone HEPES DMEM supplementato con 10% FBS, 6,7 ug / ml e 0,67 tunicamicina mM DTT.
- 4,8 × 10 risospeso 5 V-cellule vengono aggiunti a ciascun pozzetto contenente già le cellule T.
- Ratto dopo 6, 12 o 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2
- Dopo 90 minuti, la reazione colorimetrica viene bloccata per aggiunta di carbonato di sodio 1 M.
- Assorbanza a 420 nm viene misurata mediante spettrofotometro HITACHI 100-40.
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Representative Results
Per sviluppare un saggio quantitativo fusione cellulare, approfittiamo del forte attivazione trascrizionale dal legame di tTA a TRE. In assenza di tTA, trascrizione del gene LacZ in TRE-LacZ è silenzioso. Quando tTA è presente, si lega al TRE e attiva la trascrizione di LacZ. Figura 1 mostra un diagramma di flusso del saggio enzimatico fusione cellulare. tTA viene transfettato in v cellule che esprimono v-SNARE proteine sulla superficie cellulare, e TRE-LacZ viene transfettato in cellule T che esprimono t-SNARE proteine sulla superficie cellulare. Fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l'attivazione trascrizionale di LacZ, e l'espressione di β-galattosidasi.
Figura 2A illustra la struttura del dominio di costrutti SNARE capovolto. La sequenza segnale preprolactin è fusa all'N-terminale di SNARE. Questi SNARE ingegnerizzati sono chiamati 'capovolto'SNARE perché l'orientamento dei loro motivi SNARE contro membrane cellulari viene girato. Quando cellule COS-7 sono trasfettate con plasmidi SNARE capovolte, capovolte proteine SNARE sono espressi sulla superficie cellulare (Figura 2B). Citometria a flusso è usato per misurare i livelli di espressione di proteine SNARE sulla superficie cellulare (Figure 2C e D). Al fine di confrontare le loro capacità di fusione di membrana, vampiri devono essere espressi allo stesso livello. Pertanto, abbiamo titolato e ottimizzato la concentrazione di ogni capovolte SNARE utilizzato plasmide in trasfezione. Capovolte plasmidi SNARE sono trasfettate per le seguenti concentrazioni (per 10 cm 2 area di crescita, vale a dire, per pozzetto in piastre da 6 pozzetti): VAMP1 da 0,2 mcg; VAMP3, 0,5 mg, 0,5 mg, VAMP4; VAMP5, 0,05 mcg; VAMP7, 1,0 mcg; VAMP8, 0,1 mg; syntaxin1, 0,5 mg; syntaxin4, 0,05 mg. tTA, TRE-LacZ e capovolto SNAP-25 sono state co-trasfettate a 1 g per 10 cm 2 area di crescita. Sotto such condizioni, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 sono espressi allo stesso livello, mentre sintaxine 1 e 4 sono espressi allo stesso livello sulla superficie cellulare (Figura 2D). Come mostrato mediante analisi confocale e contrasto di fase immagine (Figura 2E), 80% delle cellule COS-7 sono trasfettate con plasmidi SNARE capovolte. Dual analisi di imaging etichettatura (Figura 2F) indica che il 70% delle cellule trasfettate v-esprimono entrambi tTA e capovolto proteine VAMP. Poiché il gene LacZ in TRE-LacZ non è espresso prima fusione cellulare, non sono in grado di determinare la percentuale di transfettate cellule T che esprimono sia TRE-LacZ e capovolto t-SNARE proteine.
Le SNARE neuronali (v-SNARE VAMP2, e t-SNARE syntaxin1 e SNAP-25) che mediano l'esocitosi sinaptica sono usati per testare la fattibilità del test. In effetti, quando il v-cellule che esprimono VAMP2 e t-cellule che esprimono syntaxin1/SNAP-25 sono combinati, robusto β-galattosidase espressione viene rilevata (Figura 3). Tuttavia, quando uno o VAMP2 SNAP-25 non è espresso, solo baseline β-galattosidasi viene rilevato, indicando che la fusione cellulare e l'espressione di β-galattosidasi basano su interazioni di V-e t-SNARE. Questi risultati indicano che l'analisi enzimatica fusione cellulare identifica abbinamenti fusogenico tra V-e t-SNARE efficiente.
Esprimendo proteine VAMP allo stesso livello sulla superficie cellulare (Figura 2D), si confrontano le loro attività di fusione della membrana. Con il t-SNARE syntaxin1/SNAP-25, VAMPS 1, 3, e 8 hanno comparabili e le attività di fusione più alti, mentre il 4 e il 7 vampiri hanno il 50% e il 30% attività di fusione più basse, rispettivamente (Figura 4). Al contrario, quando VAMP5 è combinata con il t-SNARE, solo baseline β-galattosidasi viene rilevata (Figura 4), suggerendo che VAMP5 non guida la fusione con la membrana syntaxin1/SNAP-25.
Figura 1. Enzimatica fusione cellulare. tTA è co-trasfettate con capovolte v-SNARE plasmidi e TRE-LacZ è co-trasfettate con capovolte t-SNARE plasmidi. La fusione di V-e cellule T, porta al legame di tTA al TRE e l'espressione di β-galattosidasi, che viene misurata con un metodo colorimetrico.
Figura 2. Espressione dei capovolto SNARE alla superficie cellulare. (A) Struttura del dominio capovolto SNARE. La sequenza segnale preprolactin (SS) è fusa all'N-terminale di lacci, e un tag Myc è inserita tra la sequenza di segnale ed i motivi SNARE (coiled-coil). (B) cellule COS-7 sono cotrasfettate con tTA e il vettore vuoto pcDNA3.1 (+) o capovolto VAMP5 plasmide. 24hr dopo la trasfezione, le cellule unpermeabilized vengono colorate con un anticorpo anti-Myc anticorpo monoclonale. Rappresentativi di una singola slice immagini confocali sono mostrati. (C e D) 24 ore dopo la coinfezione con tTA e pcDNA3.1 (+) o capovolto vampiri (v-cellule), o 24 ore dopo la coinfezione con TRE-LacZ, capovolta SNAP-25 e sintaxine 1 o 4 (cellule T ), unpermeabilized cellule sono colorate con l'anticorpo anti-Myc ed analizzate al citofluorimetro. (C) rappresentativi profili FACS delle cellule trasfettate con pcDNA3.1 (+) o capovolto VAMP1 plasmide. L'intensità di fluorescenza media di ciascun campione è determinato utilizzando il software CellQuest Pro. (D) Per esprimere vamps allo stesso livello ed esprimono sintaxine 1 e 4 allo stesso livello sulla superficie cellulare, capovolte plasmidi SNARE sono trasfettati a concentrazioni titolati. Mostrato sono le intensità media di fluorescenza di colorazione superficie cellulare delle proteine SNARE. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 4 esperimenti indipendenti. (E e F) 24 ore dopo cotransfe ction con tTA e capovolto VAMP5 plasmide, le cellule sono permeablized con 0,2% Triton X-100 in PBS + + e (E) trattata con anti-Myc anticorpo, o (F) tinto dual con l'anti-Myc anticorpo monoclonale e anticorpo policlonale il repressore TET (per rilevare tTA). (E) indicati sono confocale rappresentante e immagini a contrasto di fase. Il numero di cellule trasfettate che sono etichettati da anticorpi anti-Myc (VAMP5) e il numero totale di celle nel canale contrasto di fase vengono contati (n = 60 cellule), e l'efficienza di trasfezione è calcolato (80%). (F) Il numero di cellule trasfettate che esprimono sia VAMP5 e tTA, e il numero totale di cellule trasfettate che esprimono VAMP5, o entrambi tTA vengono contati (n = 75 cellule transfettate). La percentuale di cellule trasfettate che esprimono sia VAMP5 e tTA viene quindi calcolato (70%). Barre di scala, 20 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Fusione cellulare dipende dalle interazioni di e v-t-SNARE. v-cellule che esprimono tTA e VAMP2 sono incubati con cellule T che esprimono TRE-LacZ, syntaxin1 e SNAP-25. Dopo 24 ore, le cellule vengono lisate e l'attività di β-galattosidasi in lisati cellulari è determinata con un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm. Solo baseline b-galattosidasi viene rilevata quando sia capovolto VAMP2 o SNAP-25 plasmide è omesso dalla trasfezione.
Figura 4. Confronto tra le attività di fusione di vampiri. In condizioni di trasfezione ottimizzate, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 sono espressi allo stesso livello sulla superficie cellulare di cellule-v. 24 ore dopo aver combinato i v-cellule con le cellule T che l'exsyntaxin1/SNAP-25 stampa, la fusione cellulare è quantificato utilizzando il enzimatica fusione cellulare. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 4 esperimenti indipendenti. ** P <0.01; *** p <0.001 vs VAMP1.
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Discussion
Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espressione di tomaie e confrontare le loro capacità di fusione di membrana (figure 2 e 4). Inoltre, utilizzando l'analisi enzimatica fusione cellulare, abbiamo determinato la dipendenza dell'attività di fusione cellulare sulla superficie cellulare di densità VAMP1 proteine, e osservato alcun cooperatività di VAMP1 proteine nella reazione di fusione cellulare 8, suggerendo che l'azione concertata di complessi SNARE multipli non è necessaria per fondere le membrane cellulari.
Ci sono putative N-glicosilazione motifs (Asn-X-Ser/Thr) di proteine SNARE. Poiché N-glicosilazione inibisce le attività di fusione capovolto proteine SNARE 6, due approcci sono stati usati per prevenire la glicosilazione delle proteine SNARE capovolte. Primo, glicosilazione-site mutazioni sono introdotti in capovolte SNARE costruisce 6. Secondo, come descritto nel protocollo attuale, la N-glicosilazione tunicamicina inibitore (6,7 mcg / ml) è incluso nella reazione di fusione cellulare. Inoltre, 0,67 mM DTT viene aggiunto nella reazione di fusione cellulare per prevenire la formazione di legami disolfuro tra capovolte proteine SNARE, che inibiscono attività di fusione SNARE. I nostri esperimenti mostrano che l'aggiunta di 6,7 mg / ml e 0,67 tunicamicina mM DTT in mezzo di coltura cellulare non interferisce con la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule COS-7. Abbiamo regolarmente terminare la reazione di fusione cellulare a 24 ore dopo la combinazione e v-t-cellule. Tuttavia, significativi SNARE-mediata fusione cellulare viene rilevata 6 ore dopo la combinazione v-and t-cellule 8. Poiché la reazione enzimatica fusione cellulare dipende l'espressione di β-galattosidasi dopo fusione cellulare, la durata di questo sistema di lettura ritardo l'andamento temporale di fusione della membrana mediata da proteine SNARE capovolte.
L'analisi enzimatica fusione cellulare offre un dosaggio quantitativo ricostituzione per l'esame delle attività di fusione di membrana di potenziali v-e t-SNARE interazioni in cellule di mammifero. Da proteine coexpressing normativi (ad esempio, Munc18) e lacci sulla superficie cellulare o includendo ricombinanti proteine regolatrici della reazione di fusione cellulare, questo saggio può essere utilizzato per chiarire i meccanismi di regolazione della SNARE-mediata fusione della membrana. Inoltre, questo dosaggio devono avere applicazioni in screening ad alto rendimento per attivatori o inibitori di SNARE-mediata fusione della membrana.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l'Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
