Summary
我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。
Abstract
スネアの相互作用（S oluble N-エチルマレイミド感受性因子ttachmentタンパク質再受容体）小胞（V-スネア）とターゲット膜上のタンパク質（T-スネア）は細胞内の小胞融合1-4を触媒する。再構成アッセイは、SNARE媒介膜融合5のメカニズムと規制を解剖するために不可欠です。細胞融合アッセイ6,7においては、SNAREタンパク質は細胞表面で異所的に発現されています。これらは、スネアが細胞膜を融合させるのに十分であることを実証し、SNAREタンパク質ドライブ細胞 - 細胞融合を "フリップ"。細胞融合アッセイを顕微鏡分析に基づいているため、複数のV-及びt-SNARE相互作用を定量的に分析するために使用された場合、それはあまり効率的である。
ここでは、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する新しいアッセイ8を説明します 。 2テトラサイクリン制御トランス（TTA）とテトラサイクリン応答エレメントの制御（TRE-lacZ）を下にLacZ遺伝子をコードするプラスミドレポーター：テトオフ遺伝子発現システム9の構成要素は、読み出しシステムとして使用されています。エクスプレスは、細胞表面にT-SNAREタンパク質をひっくり返しているCOS-7細胞（T細胞）に、細胞表面でのv-SNAREタンパク質（V-細胞）およびトランスフェTRE-LacZを反転しているCOS-7細胞に我フェTTA 。 TRE、LacZおよびβ-ガラクトシダーゼの発現の転写活性化にTTAの結合におけるv-及びt-細胞の結果、SNARE依存の融合。 β-ガラクトシダーゼの活性は、420 nmの吸光度比色法を用いて定量する。
小胞関連膜タンパク質（VAMPS）は、様々なポストゴルジ小胞のコンパートメント10-15に存在するV-スネアです。同じレベルでVAMPS 1、3、4、5、7と8を発現することによって、我々は彼らの膜融合を比較酵素による細胞融合アッセイを使用して活動。分光測定に基づいて、このアッセイは、SNARE媒介膜融合を分析するための、高スループットの研究のための定量的なアプローチを提供しています。
Protocol
1。細胞培養およびトランスフェクション
- COS-7細胞は、4.5 g / Lグルコース、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養される。
- プラスミドのトランスフェクションは、製造業者の指示（Invitrogen社）によるとリポフェクタミンを使用して行われます。
2。細胞表面のSNARE式の蛍光顕微鏡分析
- トランスフェクションの前日、3×10 4、COS-7細胞を24ウェルプレートに含まれている無菌12mmのカバーグラス（フィッシャー·サイエンティフィック）上に播種する。
- 各ウェル中のV-細胞については、TTA（PTETオフ、Clontech）をコードするプラスミド0.25μgのは急行がVAMPSをひっくり返しているプラスミド0.25μgのコトランスフェクトされています。
- 各ウェル中のT細胞は、コードするプラスミド、TRE-LacZを（PBI-G、クロンテック社）の0.25μgを0.25μgの急行は、SNAP-25およびsyntaxins 1または4をひっくり返している各プラスミドと共トランスフェクトされています。
- トン24時間後ransfection、細胞を+ +で30分間、10分間PBS + +（PBSは0.1g / LのCaCl 2を補充し、0.1グラム/リットルのMgCl 2）中の4％パラホルムアルデヒドで固定した後、PBS中10％FBS中でブロックされます。
- 細胞を抗Mycモノクローナル抗体9E10（ニートハイブリドーマ培養上清）で1.5時間インキュベートする。
- 後PBSで4回洗浄+ +は、細胞を1:500の希釈でFITC結合二次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ）で1時間インキュベートする。
- 後PBSで4回洗浄+ +は、標識された細胞は、延長でGold退色防止試薬（Invitrogen）を装着されている。
- 共焦点画像は、オリンパスのレーザー走査共焦点顕微鏡で収集されます。画像はAdobe Photoshopソフトウェアで処理されます。
3。細胞表面のSNARE発現のFACS分析
- トランスフェクションの前日、2×10 5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。
- TRA 24時間後とnsfection、スネア、PTETオフとPBI-Gプラスミドを反転し、細胞をPBSで1％パラホルムアルデヒド+ +で15分間固定した後、PBS中10％FBS + +で15分間ブロックされます。
- 細胞は、60分間抗Mycモノクローナル抗体9E10と共にインキュベートする。
- した後、PBSで3回洗浄+ +は、細胞を45分間、FITC標識二次抗体（1:200希釈）で標識されています。
- PBSで3回洗浄+ +は、細胞をセルスクレーパーでプレートを掻きされた後。
- 15000セルがFACSCaliburフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて分析される。各サンプルの平均蛍光強度は、CellQuest Proソフトウェアを使用して取得されます。
4。酵素的細胞融合アッセイ
- トランスフェクションの前日に、1.2×10 6個の COS-7細胞をそれぞれ100 mm組織培養ディッシュに播種され、2×10 5個の COS-7細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。
- 5μgのflippの各 - V-セル、0.5プラスミドED VAMPは、それぞれ100mmの培養皿で細胞へPTETオフ5μgのコトランスフェクトされています。コントロール細胞は、空ベクターpcDNA3.1（+）とPTETオフで同時トランスフェクトされています。 VAMPS 1、4、5、7、8、ツニカマイシンのN-グリコシル化を防ぐために（10μg/ ml）をトランスフェクション時の細胞培養培地に含まれています。
- 6ウェルプレートの各ウェル内のT細胞は、1μgのは、SNAP-25プラスミドとPBI-Gを反転し、0.5μgとのsyntaxin1プラスミド又は0.05μgとsyntaxin4プラスミド裏返し裏返しで同時トランスフェクトされています。
- トランスフェクション後24時間は、V-細胞は、酵素を含まない細胞解離バッファ（Invitrogen）を用いて培養皿から切り離されます。剥離した細胞は、血球計を用いて計数し、DMEM、10％FBS、6.7μg/ mlのツニカマイシンおよび0.67 mMのDTTを補充HEPES緩衝に再懸濁する。
- 4.8×10 5 V、再懸濁した細胞はすでによくT細胞を含むそれぞれに追加されます。
- 6,12または24時間後にラット37℃、5％CO 2中
- 90分後、比色反応を1M炭酸ナトリウムを添加することにより停止されています。
- 420 nmの吸光度を100から40日立分光光度計を用いて測定される。
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Representative Results
定量的な細胞融合アッセイを開発するために、我々はTREにTTAの結合により強力な転写活性化を活用しています。 TTAの非存在下では、TRE-LacZ遺伝子における LacZ遺伝子の転写は、沈黙している。 TTAが存在する場合、それがTREに結合し、LacZの転写を活性化する。 図1は、酵素の細胞融合アッセイのフローチャートを示す。 TTAは、細胞表面での急行のv-SNAREタンパク質、及び、TRE-LacZのは 、T-細胞にトランスフェクトされているV-細胞にトランスフェクトされている細胞表面でのストークT-SNAREタンパク質。 TRE、LacZの転写活性化、及びβ-ガラクトシダーゼの発現にTTAの結合におけるv-及びt-細胞の結果の融合。
図2Aは、裏返さSNAREコンストラクトのドメイン構造を示す図である。 preprolactinシグナル配列は、スネアのN末端に融合される。これらの人工スネアは "反転"と呼ばれている細胞膜に対する彼らのSNAREモチーフの向きが反転しているのでスネア。 COS-7細胞を反転し、SNAREプラスミドでトランスフェクトされた場合、SNAREタンパク質が細胞表面（ 図2B）で発現される反転。フローサイトメトリーは、細胞表面（ 図2CとD）でのSNAREタンパク質の発現レベルを測定するために使用されます。それらの膜融合能力を比較するために、VAMPSは同じレベルで発現される必要があります。そこで我々は、トランスフェクションに用いたプラスミド各裏返さSNAREの濃度を滴定し、最適化されています。 、VAMP7; VAMP3、0.5μgの;; VAMP4、0.5μgの; VAMP5、0.05μgのVAMP1、0.2μgの：裏返しのSNAREプラスミドは以下の濃度（当たり10cm 2の成長分野、 すなわち 、1ウェルあたり6ウェルプレート中）でトランスフェクトされる1.0μgの; VAMP8、0.1μgを、syntaxin1、0.5μgの; syntaxin4、0.05μgの。 TTA、TRE-LacZおよびSNAP-25を反転さを10cm 2の成長分野あたり1μgでトランスフェクションした。成功下syntaxins 1と4は、細胞表面（ 図2D）で同じレベルで発現している間、時間条件、VAMPS 1、3、4、5、7と8は、同じレベルで発現される。として共焦点と位相コントラスト画像解析（ 図2E）によって示されるように、COS-7細胞の80％が反転し、SNAREプラスミドでトランスフェクトされる。二重標識イメージング解析（ 図2F）は、トランスフェクトされたV-細胞の70％はTTAの両方を表現し、VAMPタンパク質を反転することを示します。 TRE-LacZ遺伝子における LacZ遺伝子が細胞融合の前に表現されていないので、我々は、TRE-LacZの両方を発現し、t-SNAREタンパク質を反転T細胞トランスフェクトの割合を決定することができません。
シナプスのエキソサイトーシスを媒介する神経スネア（V-SNARE VAMP2、およびt-スネアsyntaxin1およびSNAP-25）アッセイの実現可能性をテストするために使用されています。確かに、syntaxin1/SNAP-25を表現VAMP2およびt-発現細胞V-セルが結合され、強固なβ-ガラクトシダーゼtosidase式は（ 図3）が検出された。しかし、VAMP2またはSNAP-25のどちらかが表現されていない場合には、ベースラインのみのβ-ガラクトシダーゼ活性は、細胞融合とβ-ガラクトシダーゼの発現は、v-及びt-スネアの相互作用に依存していることを示す、検出された。これらの結果は、酵素的細胞融合アッセイは、v-及びt-スネアの間で効率的に融合ペアを識別することを示している。
細胞表面（ 図2D）で同じレベルでVAMPタンパク質を発現することによって、我々は彼らの膜融合活性を比較。 T-スネアsyntaxin1/SNAP-25と、VAMPS 1,3、および8は、比較があり、最高の融合活動、VAMPS 4と7はそれぞれ、50％および30％低い融合活性を有しているのに対し（ 図4）。 VAMP5がt-スネアと組み合わされる対照的に、ベースラインのみのβ-ガラクトシダーゼ活性が検出された（ 図4）、VAMP5はsynt持つ膜融合を駆動しないことを示唆しているaxin1/SNAP-25。
図1酵素細胞融合アッセイ。 TTAは裏返しのv-SNAREのプラスミドをコトランスフェクトされ、TRE-lacZを裏返さトン-SNAREプラスミドをコトランスフェクトされています。 V-及びt-細胞の融合はTREにTTAの結合および比色法により測定されたβ-ガラクトシダーゼの発現を導く。
図2：発現の細胞表面で罠を反転。裏返さスネアの（A）のドメイン構造。 preprolactinシグナル配列（SS）はスネアのN末端に融合されており、Mycタグは、シグナル配列とのSNAREモチーフ（コイルドコイル）の間に挿入されます。 （B）は、COS-7細胞を、TTAと空ベクターpcDNA3.1（+）で同時トランスフェクトされるか、またはプラスミドVAMP5を反転。 24トランスフェクション後のHRは、unpermeabilized細胞を抗Mycモノクローナル抗体で染色されています。代表的な単一スライス共焦点画像が表示されます。 （CとD）TTA及びpcDNA3.1（+）の付いたトランスフェクション後24時間またはVAMPS（V-細胞）を反転させ、または、TRE-LacZでトランスフェクション24時間後、SNAP-25およびsyntaxins 1または4（T細胞に反転）、unpermeabilized細胞を抗Myc抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析される。 （C）は細胞の代表的なFACSプロファイルがたpcDNA3.1（+）でトランスフェクトまたはプラスミドVAMP1を反転。各サンプルの平均蛍光強度は、CellQuest Proソフトウェアを使用して決定されます。 （D）は、細胞表面での同じレベルに同じレベルでVAMPS、エクスプレスsyntaxins 1と4を表現するために、スネアプラスミドは滴定濃度でトランスフェクトされる反転。示すには、SNAREタンパク質の細胞表面染色の平均蛍光強度である。エラーバーは4つの独立した実験の標準偏差を表す。 （EとF）cotransfe 24時間後 TTAとctionと弾かVAMP5プラスミド、細胞を0.2％permeablizedアールPBS中のTriton X-100 + +と（E）の抗Myc抗体で染色し、または抗Mycモノクローナル抗体とポリクローナル抗体へと（F）のデュアルステンドTetリプレッサー（TTAを検出する）。 （E）の代表焦点と位相コントラスト像も示されている。抗Myc抗体（VAMP5）と位相コントラストチャネル内のセルの合計数（n = 60セル）をカウントし、トランスフェクション効率が（80％）が算出されることによって標識されるトランスフェクションされた細胞の数。 （F）はVAMP5とTTAの両方を発現するトランスフェクトされた細胞の数は、エクスプレスVAMP5、TTAまたはその両方が（N = 75、トランスフェクトされた細胞）がカウントされていることを、トランスフェクトされた細胞の総数。 VAMP5とTTAの両方を発現するトランスフェクションした細胞の割合は、その後（70％）が算出される。スケールバーは20μmで。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3：細胞融合は、v-及びt-スネアの相互作用に依存しています。急行TTAとVAMP2はT細胞とインキュベートすることをV-を発現する細胞、TRE-LacZを 、syntaxin1およびSNAP-25。 24時間後、細胞を溶解し、細胞溶解物中のβ-ガラクトシダーゼの活性は、420 nmの吸光度比色法を用いて決定される。どちらVAMP2反転、SNAP-25のプラスミドをトランスフェクションから省略されている場合にのみベースラインβ-ガラクトシダーゼ活性が検出されています。
図4 VAMPSの融合活動の比較。最適化されたトランスフェクション条件、VAMPS 1、3、4、5、7、8でV-細胞の細胞表面で同じレベルで発現される。 T細胞とV-セルを組み合わせて24時間後、その元プレスsyntaxin1/SNAP-25は、細胞融合は、酵素の細胞融合アッセイを用いて定量化される。エラーバーは4つの独立した実験の標準偏差を表す。 ** P <0.01、*** P <0.001対VAMP1。
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Discussion
元の細胞融合アッセイ6は蛍光顕微鏡法による、SNARE媒介細胞融合イベントを決定します。ここでは、β-ガラクトシダーゼおよび分光測定の活性発現によりSNARE媒介細胞融合事象を定量化する革新的なアッセイを説明します。このアッセイを使用して、我々は日常的に15を分析 - 20 V-及びt-SNARE一回の実験での組み合わせ。細胞表面でのSNARE発現を測定するためにフローサイトメトリーを用いて、我々は、VAMPSの発現量を滴定し、それらの膜融合能力（図2および図4）を比較します。さらに、酵素的細胞融合アッセイを用いて、我々はVAMP1タンパク質の細胞表面密度で細胞融合活性の依存性を決定し、細胞融合反応8のVAMP1タンパク質のない協同性を認められず、複数のSNARE複合体の協調行動が必要とされないことを示唆している細胞膜を融合させる。
推定N-グリコシル化のモチベーションがあります。SNAREタンパク質のfs（Asn-X-Ser/Thr）。 N-グリコシル化がの融合活動はSNARE蛋白質6を反転阻害するので、2つのアプローチを裏返しSNAREタンパク質のグリコシル化を防ぐために使用されている。まず、グリコシル化部位の変異は、スネア6を構築裏返しに導入される。第二に、現在のプロトコルに記載されているように、N-グリコシル化阻害剤ツニカマイシン（6.7μg/ mlの）は、細胞融合反応に含まれています。また、0.67 mMのDTTは、SNARE融合活動を阻害する裏返さSNAREタンパク質間のジスルフィド結合の形成を防ぐために細胞融合反応で追加されます。我々の実験では、細胞培養培地で6.7μg/ mlのツニカマイシンおよび0.67 mMのDTTの添加は、COS-7細胞の増殖および生存に干渉しないことを示している。我々は日常的にV-及びt-セルを組み合わせて24時間後に細胞融合反応を終了します。しかし、重要なのSNARE媒介細胞融合は、v-結合6時間後に検出されるND T細胞8。酵素的細胞融合反応が細胞融合後のβ-ガラクトシダーゼの発現に依存しているので、この読み出しシステムの経時変化が反転SNAREタンパク質によって仲介される膜融合の時間経過をとっている。
酵素による細胞融合アッセイは、哺乳動物細胞における電位V-及びt-SNARE相互作用の膜融合の活動を調べるための定量的な再構成アッセイを提供しています。共発現調節タンパク質（ 例えば 、Munc18）と細胞表面または細胞融合反応における組換えの調節タンパク質を含んでいることによってスネアでは、このアッセイは、SNARE媒介膜融合の制御機構を解明するために使用することができます。また、このアッセイは、SNARE媒介膜融合の阻害剤又は活性化のためのハイスループットスクリーニングへの応用を持つ必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所からのルイビルCA135123大学（CHへ）からスタートアップ資金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
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