Summary
Мы разработали анализ слияния клеток, который количественно SNARE-опосредованных событий слияние мембран активированным выражение β-галактозидазы.
Abstract
Взаимодействий SNARE (ы oluble N-этилмалеимид-чувствительных факторов повторного ttachment белком рецептор) белков на пузырьках (V-SNAREs) и на цели мембран (т-SNAREs) катализирует внутриклеточные везикулы слияния 1-4. Восстановление анализы имеют важное значение для рассечения механизмов и регуляции обмена SNARE-опосредованного слияния мембран 5. В анализе слияния клеток 6,7, Малый белки экспрессируются эктопически на поверхности клетки. Эти "перевернул" SNARE белков диск клетка-клетка слияния, демонстрируя, что SNAREs достаточно, чтобы слиться клеточных мембран. Поскольку анализ слияния клеток основана на микроскопическом анализе, он менее эффективен, когда используется для анализа нескольких В-и Т-SNARE взаимодействия количественно.
Здесь мы описываем новую анализа 8, что количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы. ДваКомпоненты Tet-Off экспрессии генов системы 9 используются в качестве считывания системы: тетрациклин-контролируемой трансактиватор (TTA) и репортера плазмиды, который кодирует ген LacZ под контролем тетрациклин-ответ элемент (TRE-LacZ). Мы трансфекции TTA в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернутый V-SNARE белков на поверхности клетки (В-клетки) и трансфекции TRE-LacZ в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернулся T-SNARE белков на поверхности клетки (Т-клетки) . SNARE-зависимых слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ и экспрессии β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы количественно использованием колориметрическим методом по поглощению при 420 нм.
Пузырька связанных мембранных белков (вампиры) являются V-SNAREs, которые находятся в различных пост-Гольджи везикулярного отсеков 10-15. Выражая 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8 на том же уровне, мы сравниваем их слияние мембрандеятельности с использованием ферментативного анализа слияния клеток. На основании спектрометрических измерений этого анализа предлагается количественный подход к анализу SNARE-опосредованного слияния мембран и высокой пропускной исследований.
Protocol
1. Культура клеток и трансфекция
- COS-7 клетки культивировали в среде Игла изменения Орла (DMEM) с добавлением 4,5 г / л глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Трансфекции плазмиды делается с Lipofectamine в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Invitrogen).
2. Флуоресценция Микроскопический анализ сотовых Выражение SNARE поверхности
- За день до трансфекции, 3 × 10 4 COS-7 клеток высевали на стерильные 12-мм стекла покровные (Fisher Scientific), содержащийся в 24-луночных планшетах.
- Для V-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TTA (pTet-Off, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг плазмиды, которые выражают перевернулся вампиров.
- Для Т-клеток в каждой лунке, 0,25 мкг плазмиды, кодирующей TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) является котрансфицировали с 0,25 мкг каждой из плазмид, которые выражают перевернулся SNAP-25 и syntaxins 1 или 4.
- Через 24 часа после тransfection, клетки фиксировали 4% параформальдегидом в PBS + + (PBS дополнена 0,1 г / л CaCl 2 и 0,1 г / л MgCl 2) в течение 10 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 30 мин.
- Клетки инкубируют в течение 1,5 часа с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 (чистый культуре супернатанта гибридомы).
- После четырех промывок PBS + +, клетки инкубировали в течение 1 часа с FITC-конъюгированные вторичные антитела (Jackson Immunoresearch Laboratories) в разведении 1:500.
- После четырех промывок PBS + +, меченых клеток установлены в Продли Золотой antifade реагента (Invitrogen).
- Конфокальная изображений, собранных на лазерном Olympus сканирующей конфокальной микроскопии. Изображения обрабатываются с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop.
3. FACS анализ сотовых Выражение SNARE поверхности
- За день до трансфекции, 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
- Через 24 часа после траnsfection с перевернулся SNARE, pTet-Off и PBI-G плазмиды, клетки фиксировали 1% параформальдегидом в PBS + + в течение 15 мин, а затем блокируется в 10% FBS в PBS + + в течение 15 мин.
- Клетки инкубировали с анти-Myc моноклональных антител 9Е10 в течение 60 мин.
- После трех промывок PBS + +, клетки помечены FITC-конъюгированных вторичных антител (1:200 разведение) в течение 45 мин.
- После трех промывок PBS + +, клетки соскабливают плит с сотовым скребком.
- 15000 клеток анализировали с помощью цитометра FACSCalibur потока (BD Biosciences). Средняя интенсивность флуоресценции каждого образца, полученные с использованием CellQuest Pro программное обеспечение.
4. Ферментативный анализ слияния клеток
- За день до трансфекции, 1,2 × 10 6 COS-7 клетки высевают в каждой 100-мм блюдо культуры ткани, и 2 × 10 5 COS-7 клетки высевают в каждую лунку 6-луночных планшетах.
- Для V-клеток, 0,5 - 5 мкг каждого из flippред VAMP плазмиды котрансфицировали с 5 мкг pTet-офф в клетках в каждой 100-мм культуры блюдо. Управление клетки котрансфицировали с пустой вектор pcDNA3.1 (+) и pTet-офф. Для предотвращения N-гликозилирования из 1 вампиров, 4, 5, 7 и 8, tunicamycin (10 мкг / мл), входит в культуру клеток среды при трансфекции.
- Для Т-клеток в каждую лунку 6-луночные планшеты, 1 мкг перевернулся SNAP-25 плазмиды и PBI-G являются котрансфицировали с 0,5 мкг перевернулся syntaxin1 плазмиды или 0,05 мкг перевернулся syntaxin4 плазмиды.
- Через 24 часа после трансфекции, V-клетки отделяются от культуры блюд с ферментом без клеточная диссоциация буфер (Invitrogen). Отдельный клетки считаются с гемацитометре и ресуспендировали в HEPES-буфера DMEM с добавлением 10% FBS, 6,7 мкг / мл tunicamycin и 0,67 мМ DTT.
- 4,8 × 10 5 ресуспендировали V-клеток в каждую лунку добавляют, уже содержащий Т-клеток.
- После 6, 12 или 24 часа в сутки крыса 37 ° С в 5% СО 2
- Через 90 мин, колориметрические реакцию останавливают добавлением 1 М карбоната натрия.
- Поглощение при 420 нм измеряют с помощью HITACHI 100-40 спектрофотометр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для разработки количественного анализа слияния клеток, мы воспользуемся сильной активации транскрипции путем связывания TTA, чтобы TRE. В отсутствие TTA, транскрипцию гена LacZ в TRE-LacZ молчит. Когда TTA присутствует, он связывается с TRE и активирует транскрипцию LacZ. Рисунке 1 показана схема ферментативного анализа слияния клеток. TTA трансфицируют в V-клетки, которые экспрессируют V-SNARE белков на поверхности клетки, и TRE-LacZ трансфицируют в Т-клетки, которые экспрессируют T-SNARE белков на поверхности клетки. Fusion В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ, и выражение β-галактозидазы.
Рисунок 2А показана доменная структура перевернулся конструкции ловушки. Preprolactin сигнальной последовательности слит с N-концах ловушки. Эти инженерные SNAREs называют «перевернул»SNAREs, потому что ориентация их мотивы SNARE против клеточных мембран переворачивается. Когда COS-7 клетки трансфицировали перевернулся SNARE плазмиды, перевернулся SNARE белки экспрессируются на клеточной поверхности (рис. 2В). Проточной цитометрии используется для измерения уровня экспрессии SNARE белков на поверхности клетки (рис. 2В и D). Для того, чтобы сравнить их возможности слияния мембран, вампиры должны быть выражены на том же уровне. Таким образом, мы титровать и оптимизировать концентрацию каждого перевернулся SNARE плазмиды, используемые в трансфекции. Перелистывание SNARE плазмиды трансфицировали в следующих концентрациях (на 10 см 2 Рост площади, т. е. на лунку в 6-луночные планшеты): VAMP1, 0,2 мкг; VAMP3, 0,5 мкг; VAMP4, 0,5 мкг; VAMP5, 0,05 мкг; VAMP7, 1,0 мкг; VAMP8, 0,1 мкг; syntaxin1, 0,5 мкг; syntaxin4, 0,05 мкг. TTA, TRE-LacZ и перевернул SNAP-25 были котрансфицировали на 1 мкг на 10 см 2 рост области. При успешнойч условиям, 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8, высказанные на том же уровне, в то время как syntaxins 1 и 4, высказанные на том же уровне, на поверхности клетки (рис. 2D). Как показано с помощью конфокальной и фазового анализа контрастности изображения (рис. 2E), 80% COS-7 клетки трансфицировали перевернулся плазмид SNARE. Двойной анализа изображений маркировки (рис. 2F) показывает, что 70% трансфицированных V-клетки экспрессируют оба TTA и перевернул VAMP белков. Поскольку ген LacZ в TRE-LacZ не выражается, прежде чем слияние клеток, мы не в состоянии определить процент трансфицированных Т-клетки, которые выражают как TRE-LacZ и перевернул T-SNARE белков.
Нейронов SNAREs (V-SNARE VAMP2 и трет-SNAREs syntaxin1 и SNAP-25), которые опосредуют синаптического экзоцитоза используется для проверки возможности анализа. Действительно, при V-клеток, экспрессирующих VAMP2 и Т-клетки, экспрессирующие syntaxin1/SNAP-25 объединяются, надежные β-галактическоеtosidase выражения обнаружено (рис. 3). Однако, когда либо VAMP2 или SNAP-25 не выражен, только базовые β-галактозидазы обнаружено, что указывает на слияние клеток и экспрессии β-галактозидазы опираться на взаимодействие В-и Т-ловушки. Эти результаты показывают, что ферментативный анализ слияния клеток определяет fusogenic спаривания между V-и Т-SNAREs эффективно.
Выражая VAMP белков на том же уровне на поверхности клетки (рис. 2D), мы сравниваем свою деятельность слияние мембран. С Т-SNAREs syntaxin1/SNAP-25, 1 вампиров, 3 и 8 имеют сопоставимые и высокий деятельности фьюжн, в то время как вампиры 4 и 7 имеют 50% и 30% ниже слияния деятельности, соответственно (рис. 4). Напротив, когда VAMP5 в сочетании с Т-ловушки, только базовые β-галактозидазы обнаружено (рис. 4), предполагая, что VAMP5 не гонит слияние мембран с синтaxin1/SNAP-25.
Рисунок 1. Ферментативный анализ слияния клеток. TTA в котрансфицировали с перевернулся V-SNARE плазмиды, и TRE-LacZ в котрансфицировали с перевернулся T-SNARE плазмид. Слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE и выражение β-галактозидазы, которая измеряется с помощью колориметрического метода.
Рисунок 2. Выражение перевернулся SNAREs на поверхности клетки. (A) Доменная структура перевернулся SNAREs. Последовательность preprolactin сигнал (SS) слит с N-концах ловушки, и Myc тег вставляется между сигнальной последовательности и SNARE мотивы (биспиральных). (B) COS-7 клетки котрансфицировали с TTA и пустой вектор pcDNA3.1 (+) или перевернутый VAMP5 плазмиды. 24ч после трансфекции, unpermeabilized клетки окрашивали анти-Myc моноклональных антител. Представитель одного среза конфокальной изображения отображаются. (C и D) 24 часа после котрансфекции с TTA и pcDNA3.1 (+) или перевернутый вампиров (В-клетки), или 24 ч после котрансфекции с TRE-LacZ, перевернутый SNAP-25 и syntaxins 1 или 4 (Т-клетки ), unpermeabilized клетки окрашивали анти-Myc антитела и анализировали с помощью проточной цитометрии. (C) представитель FACS профилей клеток, трансфицированных pcDNA3.1 (+) или перевернутый VAMP1 плазмиды. Средняя интенсивность флуоресценции каждого образца определяется с использованием CellQuest Pro программное обеспечение. (D), чтобы выразить вампиров на том же уровне и выражают syntaxins 1 и 4 на том же уровне на поверхности клетки, перевернутый SNARE плазмиды трансфицировали в титруют концентрации. Показаны средней интенсивности флуоресценции на поверхности клеток окрашивание белков SNARE. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение 4 независимых экспериментов. (E и F) 24 часа после cotransfe ие с TTA и перевернул VAMP5 плазмиды, клетки permeablized с 0,2% Тритон Х-100 в PBS + + и (E) окрашивали анти-Myc антитела, или (F) двойная окрашенных анти-Myc моноклональных антител и поликлональных антител к ТЕТ репрессор (для выявления TTA). (E) указаны представитель конфокальной и изображений фазового контраста. Число трансфицированных клеток, которые помечены анти-Myc антитела (VAMP5), а общее количество клеток в канале фазового контраста учитываются (п = 60 клеток), а также эффективность трансфекции рассчитывается (80%). (F) число трансфицированных клеток, которые выражают как VAMP5 и TTA, а общее число трансфицированных клеток, которые выражают VAMP5, TTA или оба считаются (п = 75 трансфицированные клетки). Процент трансфицированные клетки, которые выражают как VAMP5 и TTA затем рассчитывается (70%). Шкала баров, 20 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Слияния клеток зависит от взаимодействия В-и Т-ловушки. V-клетки, которые экспрессируют TTA и VAMP2 инкубируют с Т-клетками, которые выражают TRE-LacZ, syntaxin1 и SNAP-25. Через 24 ч клетки лизируют и активности β-галактозидазы в клеточных лизатов определяется по колориметрическим методом по поглощению при 420 нм. Только базовые б-галактозидазы обнаруживается, когда либо перевернулся VAMP2 или SNAP-25 плазмиды исключены из трансфекции.
Рисунок 4. Сравнение слияние деятельности вампиров. При оптимальных условиях трансфекции, 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8, высказанные на том же уровне, на клеточной поверхности В-клеток. 24 часов после объединения V-клеток с Т-клетками, что эксПресс syntaxin1/SNAP-25, слияние клеток количественно помощью ферментативного анализа слияния клеток. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение 4 независимых экспериментов. ** P <0,01; *** p <0,001 по сравнению с VAMP1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оригинальный анализ слияния клеток 6 определяет SNARE-опосредованных событий слияние клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы опишем инновационного анализа, который количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы и спектрометрических измерений. С помощью этого анализа, мы регулярно анализируем 15 - 20 В-и Т-SNARE сочетания в одном эксперименте. Использование проточной цитометрии для оценки SNARE выражении на поверхности клетки, мы титровать уровни экспрессии вампиров и сравнить их слияние мембран мощности (рис. 2 и 4). Кроме того, с помощью ферментативного анализа слияния клеток, мы определили зависимость активности клеток синтеза на поверхности клеток плотности VAMP1 белка, и не наблюдается кооперативности VAMP1 белка в реакции слияния клеток 8, предполагая, что согласованные действия нескольких комплексов SNARE не требуется слиться клеточных мембран.
Есть предполагаемых N-гликозилирования МотиFS (Asn-X-Ser/Thr) в SNARE белков. Потому что N-гликозилирования ингибирует слияние деятельности перевернулся SNARE белков 6, два подхода были использованы для предотвращения гликозилирования белков SNARE перевернулся. Во-первых, гликозилирования-сайте мутации вводят в перевернул SNARE строит 6. Во-вторых, как описано в текущем протоколе, N-гликозилирования ингибитор tunicamycin (6,7 мкг / мл) входит в реакции слияния клеток. Кроме того, 0,67 мМ DTT добавляют в реакции слияния клеток, чтобы предотвратить образование дисульфидных связей между перевернулся белков SNARE, который будет препятствовать деятельности SNARE синтеза. Наши эксперименты показывают, что добавление 6,7 мкг / мл tunicamycin и 0,67 мМ DTT в клеточной среде культуры не вмешивается в пролиферации и выживания COS-7 клеток. Мы регулярно окончания реакции слияния клеток на 24 часа после объединения V-и Т-клеток. Тем не менее, значительная SNARE-опосредованного слияния клеток обнаружено 6 часов после объединения V-м Т-клетки 8. Потому что ферментативные реакции слияния клеток зависит от экспрессии β-галактозидазы после слияния клеток, время курс этой системе отсчета отстает от времени ход слияния мембран опосредовано перевернулся белков SNARE.
Ферментативного анализа слияния клеток предлагается количественный анализ восстановления для изучения слияния мембран деятельности потенциального В-и Т-SNARE взаимодействий в клетках млекопитающих. По coexpressing регуляторных белков (например, Munc18) и SNAREs на клеточной поверхности или в том числе рекомбинантных регуляторных белков в реакции слияния клеток, этот анализ может быть использован для выяснения механизмов регуляции SNARE-опосредованного слияния мембран. Кроме того, этот анализ должен иметь приложения в высокопроизводительного скрининга ингибиторов или активаторов SNARE-опосредованного слияния мембран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается запуск средств из Университета Луисвилл и CA135123 из Национальных институтов здравоохранения (CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
