Summary
जीन वयस्क पशुओं में व्यवहार या neuropathology के बाद पढ़ाई के लिए neuronal संपर्क में तेजी से और लक्षित संशोधनों को सक्षम करने के लिए, E16 पर utero electroporation (IUE) में के माध्यम से प्रांतस्था या चूहे के हिप्पोकैम्पस के विकास के दौरान चालाकी से किया जा सकता है. IUE सफलता के नियंत्रण के लिए vivo इमेजिंग में प्रसव के बाद सह ट्रांसफ़ेक्ट luciferase सक्रिय करने के bioluminescence द्वारा किया जाता है.
Abstract
Utero electroporation में (IUE) neuronal विकास की जांच के लिए मस्तिष्क में कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की अनुमति देता है जो एक तकनीक है. अब तक, वयस्क मस्तिष्क में व्यवहार या neuropathology की जांच के लिए IUE का प्रयोग प्रसव के बाद पशुओं में गैर इनवेसिव तकनीक द्वारा IUE अभिकर्मक सफलता की निगरानी के लिए अपर्याप्त तरीके से सीमित कर दिया गया है.
वर्तमान अध्ययन के लिए, E16 चूहों IUE के लिए इस्तेमाल किया गया. भ्रूण में न्यूक्लिक एसिड की intraventricular इंजेक्शन के बाद, चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड की स्थिति के विकास प्रांतस्था या हिप्पोकैम्पस या तो लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण था.
निलय सह इंजेक्शन और 3 डी मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर के साथ एक IVIS स्पेक्ट्रम डिवाइस का उपयोग postnatally में vivo bioluminescence द्वारा anesthetized लाइव P7 पिल्ला में intraperitoneal luciferin इंजेक्शन के बाद ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की एक luciferase जीन की अनुमति दी निगरानी, की electroporation.
हम प्रसव के बाद bioluminescence इमेजिंग चूहों में IUE साथ क्षणिक transfections की सफलता का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है कि समाप्त. Neurodevelopmen दौरान सामयिक जीन जोड़तोड़ के प्रभाव पर जांचवयस्क मस्तिष्क और इसकी कनेक्टिविटी पर टी बहुत मदद कर रहे हैं. कई वैज्ञानिक प्रश्नों के लिए, इस तकनीक पूरक या भी ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग की जगह और व्यवहार तंत्रिका विज्ञान के लिए एक उपन्यास प्रौद्योगिकी प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
यह रिश्तेदार आसानी से सक्षम के चिकित्सकों का अध्ययन सक्षम के बाद से विकासशील मस्तिष्क में जीन की अभिव्यक्ति का एक मॉडुलन की अनुमति देता है, जिसमें utero electroporation (IUE) विधि का विकास, एक को तोड़ने के माध्यम से किया गया है. में एक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में 1-7 परिवर्तन कृन्तकों में भ्रूण और / या प्रसवकालीन विकास के दौरान एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र प्रभाव neuronal प्रसार, प्रवास, द्रुमायण, और कनेक्टिविटी के लिए गंभीर का प्रदर्शन किया गया. 8-10
एक प्रकार का पागलपन neurodevelopmental असामान्यताएं 11, 12 और इसलिए एक प्रकार का पागलपन के लिए पहचान की उम्मीदवार जीन के कई के लिए उदाहरण के लिए की तरह, सक्षम के चिकित्सकों पर संभावित modulating प्रभाव के लिए जांच कर रहे हैं करने के लिए संबंधित दिया गया है कि तीव्र और जीर्ण लक्षण के साथ एक जटिल मानसिक बीमारी है बाधित में एक प्रकार का पागलपन -1 (DISC1) जीन 13-15.
मस्तिष्क के विकास regulat हैपूर्व, पेरी और प्रसव के बाद विकास की अवधि में भूमिका निभाते हैं जो आनुवंशिक कारणों और पर्यावरण के साथ उनकी बातचीत से एड. विभिन्न व्यवहार विकारों के लिए एक प्रमुख आनुवंशिक जोखिम कारक चूहों 13, 17 में प्रवास दोषों को DISC1 16 जीन. DISC1 पछाड़ना होता है, और IUE द्वारा विकासशील प्रांतस्था में DISC1 अभिव्यक्ति की जोड़ - तोड़ वयस्क चूहों 18 के व्यवहार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है.
IUE द्वारा मस्तिष्क जीन की अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ के कई फायदे ट्रांसजेनिक पशु लाइनों की पीढ़ी से अधिक 19 है. सबसे पहले, हित के क्षेत्रों के भीतर जीन अभिव्यक्ति महीने के बजाय ट्रांसजेनिक कृंतक लाइनों प्रजनन की कई पीढ़ियों के लिए सप्ताह के भीतर हासिल की है. दूसरा, germline इंजीनियर जानवरों 20 में phenotypes ढाल सकता है कि प्रारंभिक विकास के दौरान प्रतिपूरक तंत्र परहेज कर रहे हैं. केवल एक विशेष सेल आबादी या मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्र, migrati को निशाना बनाने के माध्यम से, तीसरापर या प्रसार मतभेद सीधे गैर उत्परिवर्ती के साथ तुलना में या एकतरफा electroporations चुना जाता है अगर contralateral पक्ष को नियंत्रित किया जा सकता है. दूसरी ओर, IUE प्रमोटर संचालित रचनात्मक / Lox प्रेरित अभिव्यक्ति के समय और एक निश्चित क्षेत्र में केवल कोशिकाओं के एक subpopulation जीन अभिव्यक्ति पैटर्न की पच्चीकारी प्रकार के लिए अग्रणी लक्षित है की शुद्धता नहीं है.
स्थिर, germline ट्रांसजेनिक कृन्तकों के प्रमुख लाभ नगण्य है कि इतने वयस्क कृन्तकों में कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए, एक मस्तिष्क क्षेत्र में कोशिकाओं की सीमित संख्या के एक क्षणिक अभिकर्मक, पर्याप्त, या भी वांछित हो सकता है. वास्तव में, IUE कुछ असामान्य रूप से विकसित कोशिकाओं कोशिकाओं या circuitry के एक पूरे नेटवर्क को प्रभावित कर सकता है कि क्या जांच करने के लिए उपयोगी है. एक और लाभ की वजह से हिट की पच्चीकारी प्रकृति के लिए एक जीन की गैर सेल स्वायत्त प्रभाव का प्रदर्शन करने की क्षमता हो सकती है. इसके अलावा, ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों की पीढ़ी अपने बचपन और अभी भी प्रयोग में हैन्यायपालिका मस्तिष्क के विकास के परिणामों के अध्ययन के लिए इस प्रजाति में IUE की उच्च ब्याज की है.
अब तक, वयस्क के रूप में उन जानवरों में हस्तक्षेप परिणामों की जांच के लिए IUE का उपयोग करने का एक प्रमुख बाधा निगरानी electroporation सफलता की कमी है. अब तक, लाइव नवजात चूहे पिल्ले एक उपयुक्त दूरबीन प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे या IVIS स्पेक्ट्रम की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ पकड़ा नहीं जा सका में फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स GFP-सह ट्रांसफ़ेक्ट.
इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एक luciferase संवाददाता जीन सह ट्रांसफ़ेक्ट और IUE मस्तिष्क क्षेत्र के 3 आयामी (3 डी) quantitation द्वारा पिल्ले के bioluminescence रहते इमेजिंग प्रदर्शन किया.
Neurodevelopmental आनुवंशिक हेरफेर, चूहा भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल में मानव DISC1, luciferase, और GFP युक्त plasmids के एक सह इंजेक्शन का परीक्षण एक बाद में कार्यात्मक परख में इस पद्धति के प्रयोग के प्रदर्शन के लिए एक उदाहरण के रूप में
Protocol
राष्ट्रीय और यूरोपीय कानून के अनुसार, सभी पशु प्रयोगों जिम्मेदार Landesministerium फर Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (87-51.05.2010.A301 LANUV NRW) द्वारा अधिकृत किया गया.
1. में utero में electroporation
इस विधि Walantus एट अल. 3 से चूहा है, साथ ही चावल एट अल. 4 जौव में विस्तार से वर्णित किया गया है और यहां केवल संक्षेप में संक्षेप. 6-8 पिल्ले की एक कूड़े आकार एक अच्छा परिणाम अर्जित करता है. (देखें नीचे) समग्र जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए कम से कम दो गैर electroporated भ्रूण होना चाहिए.
- 1.5 माइक्रोग्राम / μl है जिसमें डीएनए मिश्रण तैयार लक्ष्य प्लाज्मिड (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, यूजीन, या / DISC1 overexpression: pCAX 21), 0.5 माइक्रोग्राम / प्लाज्मिड (pCAX), 0.5 माइक्रोग्राम / GFP μl युक्त luciferase μl 1x पीबीएस समाधान दाग प्रकाश Blu में प्लाज्मिड (pCAGGS 22) युक्तफास्ट हरे रंग के साथ ई.
- एक सुई पिपेट खींचने के साथ कांच capillaries के बाहर इंजेक्शन सुइयों तैयार करें. और एक शराब आधारित कीटाणुनाशक (KODAN Tinktur प्रधान गुण) के साथ वाष्पदावी या ऊष्मायन द्वारा या तो सर्जिकल उपकरणों बाँझ.
- 15 मिनट सर्जरी से पहले 16 दिनों के निषेचन (E16) के बाद एक गर्भवती चूहे को buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के एक पूर्व ऑपरेटिव खुराक प्रशासन. फिर एक isoflurane कक्ष में पशु anesthetize.
- संज्ञाहरण पर, 1.8% पर 0.4 एल / मिनट और isoflurane में ऑक्सीजन की स्थापना का उपयोग, संज्ञाहरण डिवाइस से जुड़े साँस लेने मुखौटा के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म आपरेशन टेबल पर एक लापरवाह स्थिति में चूहे रखें.
- पेट हजामत बनाने के बाद, मुंडा क्षेत्र KODAN Tinktur प्रधान गुण (एक शराब आधारित कीटाणुनाशक) के साथ तीन बार कीटाणुरहित.
- केवल मुंडा आपरेशन क्षेत्र उजागर बाँझ कपड़ा के साथ चूहे को कवर किया.
- Utero electroporation में प्रदर्शन करते हैं.
- एक scisso साथ पेट कटLinea अल्बा के साथ आर (~ 2 सेमी).
- एक अंगूठी संदंश के साथ सावधानी से गर्भाशय सींग का पर्दाफाश.
- पूरे सर्जरी के दौरान गरम बाँझ पीबीएस के साथ गीला गर्भाशय की दीवार को रखने के लिए ध्यान रखना.
- भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल में से एक में एक पतली गिलास सुई के साथ डीएनए समाधान इंजेक्षन.
- भ्रूण के सिर के चारों ओर 7 मिमी इलेक्ट्रोड रखें. ऊपरी cortical परतों की एक सेल की आबादी हिट करने के लिए, E16 23 पर IUE प्रदर्शन और एक मामूली पृष्ठीय / पार्श्व प्रवृत्ति के साथ इंजेक्शन वेंट्रिकल ऊपर गोलार्द्ध पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड स्थिति. हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं पार्श्व इंजेक्शन के साथ निलय से विपरीत पक्ष को सकारात्मक इलेक्ट्रोड नियुक्ति को बदलने को लक्षित करने के लिए थोड़ा पृष्ठीय दिशा (चित्रा 1).
- एक वर्ग तरंग पल्स electroporator के साथ 950 मिसे टूट के साथ 55 वी में पाँच 50 मिसे दालों द्वारा electroporation प्रदर्शन करना.
- टी बढ़ाने के लिए प्रत्येक गर्भाशय सींग की योनि अंत में पहली भ्रूण छोड़ दोवह सभी भ्रूण के जीवित रहने की संभावना.
- पीठ मां चूहे में गर्भाशय सींग रखो.
- एक absorbable Vicryl शल्य सिवनी सामग्री के साथ पेट की दीवार के ऊपर सिलाई.
- Vicryl सिवनी सामग्री के साथ या सीवन क्लिप के साथ त्वचा को बंद करें.
- घर वापस पिंजरे में मां चूहे रखें और 2-3 घंटे के लिए गर्म रखें.
- जानवरों की सुविधा के कमरे में उनके घर पिंजरे में अकेले चूहों पकड़ो और यथेच्छ खिलाओ. वे E22-24 के बीच जन्म देते हैं.
- तीन सप्ताह के लिए अपनी मां के साथ चूहे पिल्ले रखें और लिंग के आधार पर बाद में उन्हें अलग.
2. एंजाइमी luciferase प्रतिक्रिया की bioluminescence लाइव इमेजिंग
इस विधि utero में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की स्थिति का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सह electroporated जुगनू luciferase सीडीएनए oxyluciferin को डी luciferin metabolizing पर, एक फोटान (चित्रा 2 का उत्सर्जन करता है जो सक्रिय luciferase, में अनुवाद किया है (चित्रा 4) के लगभग 35 दिनों की उम्र तक एक IVIS स्पेक्ट्रम में सकारात्मक electroporated युवा चूहों के दिमाग में पता लगाया जा सकता है.
अध्ययन में मौजूद है, luciferase परख और bioluminescence इमेजिंग P7 पर शुरू किया गया था. इस समय बिंदु मां और पिल्ले जन्म तनाव से उबरने के लिए अनुमति देने के लिए चुना गया था. शुरू में P0 पर पिल्ले के साथ काम करते हैं, पिल्ला अस्तित्व गंभीर रूप से पिल्ले मृत पाया या माँ द्वारा खाया गया है कि प्रभावित था.
प्रारंभ में, सफल electroporation के साथ चूहे पिल्ले तीन मिनट की एक जोखिम समय के साथ एक 2 डी bioluminescence तस्वीर से पहचाने जाते हैं. बाद में, सकारात्मक पिल्ले electroporated क्षेत्र के स्थान को निर्दिष्ट करने के क्रम में 3 डी चित्र बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं.
- मिलीलीटर 15 मिलीग्राम / के एक एकाग्रता के लिए पीबीएस में डी luciferin सोडियम नमक पतला और एक बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा यह बाँझ.
- पिल्ले वजन.
- शीर्ष पर पेट के साथ एक हाथ में पिल्ला ले लो और थोड़ा पेट में खिंचाव. Luciferin समाधान intraperitoneal के शरीर के वजन के 10 μl / छ इंजेक्षन. पुराने और अधिक चुस्त लोगों के लिए, luciferin इंजेक्शन लगाने से पहले प्रेरण कक्ष में isoflurane के साथ पिल्ले पूर्व सुन्न कर देना.
- 3% isoflurane के साथ IVIS स्पेक्ट्रम भीतर XGI -8 गैस संज्ञाहरण प्रणाली की isoflurane तांता चालू करें.
- संज्ञाहरण प्रणाली के कांच नाक शंकु में पशु के थूथन रखो.
- यह गहरी संज्ञाहरण (2-3 मिनट) में है जब तक एक प्रवण स्थिति में पशु पकड़ो. फिर 1.5% की isoflurane आमद कम हो.
- पूरे कूड़े से सकारात्मक पिल्ले का चयन करने के लिए एक 2 डी bioluminescence माप चुनें. निम्न सेटिंग्स का उपयोग
बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .- एक chec सेटkmark 8 में मध्यम binning और एफ / स्टॉप के साथ तस्वीर पर, कैमरा माप शुरू करने के बाद ऊपर से एक तस्वीर लेता है.
- सेट उत्तेजना फिल्टर: ब्लॉक.
- उत्सर्जन फिल्टर सेट करें: खुला.
- मध्यम करने Binning सेट करें.
- 1 में एफ / रोकें सेट करें.
- सेट स्टेज स्तर ए
- 180 सेकंड के लिए luminescence जोखिम समय निर्धारित करें.
- बेहतर, सकारात्मक पिल्ले से electroporated क्षेत्र यों जुगनू luciferase के लिए निम्नलिखित DLIT सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए आदेश में 3 डी चित्रों की रचना के लिए.
बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .- तस्वीर पर सही का निशान सेट, कैमरा माप शुरू करने के बाद ऊपर से एक तस्वीर लेता है.
- संरचना पर एक checkmark सेट, पशु की सतह पूर्व bioluminescence माप IVIS से जांच होती है.
- यूएसई दो सप्ताह की आयु तक उत्सर्जन फिल्टर और जोखिम समय सेटिंग्स निम्न है:
उत्सर्जन फिल्टर 1: 590 एनएम, जोखिम समय 300 सेकंड
उत्सर्जन फिल्टर 2: 600 एनएम, जोखिम समय 240 सेकंड
उत्सर्जन फिल्टर 3: 620 एनएम, जोखिम समय 180 सेकंड
उत्सर्जन फिल्टर 4: 640 एनएम, जोखिम समय 120 सेकंड
P20 से अधिक उम्र के चूहों के लिए
उत्सर्जन फिल्टर 1: 600 एनएम, जोखिम समय 300 सेकंड
उत्सर्जन फिल्टर 2: 620 एनएम, जोखिम समय 300 सेकंड
उत्सर्जन फिल्टर 3: 640 एनएम, जोखिम समय 300 सेकंड
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कारण बड़े पशुओं में सिग्नल की शक्ति में कमी करने के लिए, जोखिम समय तीन सर्वश्रेष्ठ उत्सर्जन फिल्टर के लिए बढ़े हुए है. - सेट स्टेज स्तर बी
- मध्यम करने Binning सेट करें.
- 1 में एफ / रोकें सेट
- बाद माप मार्च उन्हें एक दूसरे से अलग करने के लिए एक earhole कोड द्वारा चूहों कश्मीर और IVIS लाइव इमेजिंग चित्रों के लिए उन्हें मैच के लिए
- माप प्रक्रिया के अंत में, isoflurane आमद बंद कर देते हैं और अपने पिंजरे को लौटने से पहले कुछ मिनट के लिए गरम प्लेट पर चूहे रहते हैं.
3. Bioluminescence छवियों के विश्लेषण
3 डी छवियों, 3 डी फिल्मों और संकेत स्रोत की मात्रा की मात्रा का ठहराव की पीढ़ी के रहने छवि सॉफ्टवेयर IVIS स्पेक्ट्रम पर पहले से स्थापित द्वारा किया जाता है.
- 3 डी छवियों का सृजन
- सबसे पहले, एक सतह स्थलाकृति का पुनर्निर्माण, इसलिए 20-30% के बीच सीमा निर्धारित किया है.
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een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> - प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए 10% की एक छवि सीमा के साथ DLIT 3D पुनर्निर्माण शुरू करो.
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बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . - 3 डी उपकरण पट्टी के भीतर चेतन बटन का उपयोग करके 3 डी फिल्में बनाने.
- 3 डी छवि के अलग झुकाव है, साथ ही मुख्य फ्रेम के रूप में zooming दृश्य चुनें और 'रिकार्ड & # दबाएँ39; बटन, एक स्थिति / उन्मुखीकरण से दूसरे बदलाव रिकॉर्डिंग.
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- सबसे पहले, एक सतह स्थलाकृति का पुनर्निर्माण, इसलिए 20-30% के बीच सीमा निर्धारित किया है.
4. व्यवहार परीक्षण
व्यवहार परीक्षण चूहे में IUE मध्यस्थता जीन जोड़तोड़ वयस्कता में जारी रहती है कि लंबी अवधि के प्रभाव आरंभ हो सकता है ताकि यह निर्धारित करने में प्रदर्शन किया गया था. वर्तमान विशेष मामले में, क्षणिक के प्रभाव, IUE के बाद एकतरफा पूर्ण लंबाई मानव DISC1 cortical overexpression डोपामाइन से संबंधित के लिए एक विशेष परीक्षा के रूप में, एम्फ़ैटेमिन के एक कम खुराक के साथ और बिना, (के) एक खुले मैदान में हरकत परीक्षण द्वारा जांच की गई व्यवहार 24. द्वारा प्रदर्शन एक समान प्रक्रिया में Niwa एट अल. DISC1 पछाड़ना, IUE चूहों लेकिन नहीं का उपयोग IUE चूहों में नियंत्रण अतिसंवेदनशीलता से पता चला18 एम्फ़ैटेमिन के लिए.
Utero में एक DISC1 overexpressing वेक्टर साथ electroporated थे कि चूहे 7:00-07:00 12 घंटा प्रकाश के साथ प्रयोगशाला परिस्थितियों में आयोजित की गई और यथेच्छ खिलाया गया. उम्र के 3 महीने में, चूहों व्यवहार परीक्षण कराना पड़ा.
एम्फ़ैटेमिन प्रभाव का एक readout, एक ध्वनि और प्रकाश पृथक कक्ष में स्थित एक ट्रू स्कैन गतिविधि प्रणाली की एक खुले मैदान के रूप में हरकत बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रणाली की अवधि का समय उपायों और खुले क्षेत्र के मार्जिन या केंद्र में बिताए पशु चलता है, समय और दूरी दूरी, साथ ही साथ व्यवहार 25 के पालन.
- पहले दिन, खारा इंजेक्शन के बाद परीक्षण
- जानवरों के वजन.
- Intraperitoneally एक नमकीन घोल (1x पीबीएस) की 1 μl / छ शरीर के वजन इंजेक्षन.
- सही इंजेक्शन के बाद, खुले क्षेत्र में पशु डाला और TruScan प्रणाली की माप शुरू करते हैं. 15 मिनट एक रिकॉर्डडी 3 एक्स 5 मिनट भागों में डेटा प्रतिभाग.
- वापस अपने घर पिंजरे में पशु रखो.
- एम्फ़ैटेमिन इंजेक्शन पर दूसरे दिन परीक्षण
- जानवरों के वजन.
- Intraperitoneally एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल एम्फ़ैटेमिन समाधान के 1 μl / छ शरीर के वजन इंजेक्षन.
- इंजेक्शन खुले क्षेत्र में पशु डाला और TruScan प्रणाली की माप शुरू सही होने के बाद. 15 मिनट के लिए रिकॉर्ड और 3 एक्स 5 मिनट भागों में डेटा प्रतिभाग.
- अपने घर पिंजरे में पशु लौटें.
- हरकत और विशिष्ट ट्रू स्कैन सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न पालन व्यवहार का विश्लेषण. GraphPad (चश्मे) के साथ रेखांकन बनाने और SPSS सांख्यिकी सॉफ्टवेयर द्वारा आंकड़ों की गणना.
Representative Results
चित्रा 3 से पता चलता है 150 मिलीग्राम luciferin / किग्रा शरीर के वजन के इंजेक्शन के बाद P7 पर तीन चूहे पिल्ले की इमेजिंग माप रहते हैं. IUE की दक्षता में परिवर्तनशीलता का संकेत संकेत ताकत के मतभेद दिखाई दे रहे हैं. मजबूत bioluminescence संकेतों P36 (चित्रा 4) तक दर्ज किए गए. चित्रा 5 में, bioluminescence इमेजिंग द्वारा कोर्टिकल (आंकड़े 5 ए और 5C) और हिप्पोकैम्पस (आंकड़े 5 ब और 5D) electroporation परिभाषित करने की क्षमता चित्रित कर रहे हैं. खोपड़ी को हटाने (चित्रा 7B) और P14 पर cryosectioned मस्तिष्क (8 चित्रा) में इसी GFP-electroporated कोशिकाओं के बाद अपने प्रतिदीप्ति संकेत के साथ bioluminescence संकेत (चित्रा 7A) के सहसंबंध आंकड़े 6-8 में चित्रित कर रहे हैं. ध्यान से, वहाँ कोई नहीं था किसी भी समय बिंदु पर लाइव चूहों में एक प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने.
तम्बू "> में vivo bioluminescence इमेजिंग दिखाया उदाहरणों में. 2 डी से अलग electroporated मस्तिष्क क्षेत्रों के लगभग भेदभाव बहुत 3 डी छवियों (आंकड़े 5C और 5D) पैदा IVIS स्पेक्ट्रम सॉफ्टवेयर की DLIT कार्यक्रम के साथ सुधार हुआ है, जो (आंकड़े 5 ए और 5 ब) में सक्षम बनाता है , प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस की electroporation प्रतिष्ठित किया जा सकता है. यह हिप्पोकैम्पस electroporate करने का लक्ष्य है, जबकि हिप्पोकैम्पस के प्रांतस्था झूठ बोल पृष्ठीय के लिए कुछ पूर्वज कोशिकाओं को भी (चित्रा 7) मारा जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.एकतरफा utero में प्रांतस्था में pCAX वेक्टर साथ electroporated और बाद में पूरी लंबाई मानव DISC1 overexpressing चूहे वयस्क के रूप में सहज और एम्फ़ैटेमिन प्रेरित सक्रियता दोनों के लिए जांच की गई. PCAX-DISC1 साथ electroporated चूहे एम्फ़ैटेमिन के एक कम खुराक के लिए अतिसंवेदनशील थे. इन चूहों को काफी मो चले गएपुनः के बाद खारा इंजेक्शन की तुलना में एम्फ़ैटेमिन इलाज के बाद जबकि नियंत्रण जानवरों (चित्रा 10) नहीं था.
चित्रा 1. ए) प्रांतस्था electroporation और बी) हिप्पोकैम्पस electroporation के लिए इलेक्ट्रोड स्थिति की योजना, हरी = वेंट्रिकल के भीतर डीएनए मिक्स इंजेक्शन.
चित्रा 2. Luciferase प्रतिक्रिया.
चित्रा 3. / किलोग्राम शरीर के वजन luciferine 150 मिलीग्राम के इंजेक्शन के बाद P7 चूहों की luminescence माप, जोखिम समय 180 सेकंड, कोई luminescence संकेत के साथ एक) चूहा, बी) चूहा एक कमजोर bioluminescence संकेत के साथ, एक मजबूत luminescence संकेत के साथ सी) चूहा.
चित्रा 4. IUE सफलता से पता लगाया जा सकता है, जहां एक बड़ी समय खिड़की प्रदर्शन 150 मिलीग्राम / किग्रा luciferine के इंजेक्शन के बाद एक ही चूहे की लगातार bioluminescence माप के समय रेखा.
हिप्पोकैम्पस से बी) एवं विकास);. सी) एवं विकास) 3 डी तस्वीर; प्रांतस्था से एक) और सी). P7 ए) और बी में cortical और हिप्पोकैम्पस electroporation के बीच मतभेद) 2 डी चित्रों का आंकड़ा 5 चित्रण.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6. P14 एक पर एक चूहा पिल्ला के E16 हिप्पोकैम्पस electroporation) bioluminescence बी की 2 डी चित्र) bioluminescence संकेत सी के 3 डी चित्रण) का चित्रण bioluminescence संकेत डी) मस्तिष्क GFP महामारी प्रतिदीप्ति संकेत के साथ साथ दिमाग विच्छेदित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 7. GFP युक्त प्लाज्मिड और luciferase साथ electroporated एक ही P14 चूहे के मस्तिष्क के एक 20 माइक्रोन क्रायो अनुभाग से एक प्रतिदीप्ति तस्वीर का विस्तारवेक्टर, DAPI साथ नाभिक धुंधला हो जाना, सीए 1-3 = कोर्नु एम्मोनिस 1-3, डीजी = दांतेदार गाइरस, एफसी = Fasciolarum cinereum.
वीडियो 1. एक हिप्पोकैम्पस के 3 डी एनीमेशन P14 पर चूहा electroporated.
चित्रा 8. एम्फ़ैटेमिन परीक्षा योजना: पहले दिन खारा इंजेक्शन 15 मिनट परीक्षण से पहले, 24 घंटा बाद एम्फ़ैटेमिन खुले मैदान चैम्बर में परीक्षण से पहले इंजेक्शन.
चित्रा 9. एम्फ़ैटेमिन परीक्षण. . ग्रे सलाखों = DISC1 overexpressing समूह; नियंत्रण समूह N = 10; 15 मिनट सफेद सलाखों = नियंत्रण समूह पर एक TrueScan प्रणाली द्वारा दर्ज पशु की (सेमी में) ले जाया दूरी दिखा बार ग्राफ DISC1 overexpression समूह N = 11; एनोवा: GENO * उपचार पी = 0.043; एम्फ़ैटेमिन एनएस बनाम कुल समय खारा = नहीं महत्वपूर्ण pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0.001 के लिए टी परीक्षण.
Discussion
हमारे अध्ययन IUE न्यूरॉन्स मस्तिष्क के एक चुनिंदा क्षेत्र में एक transgene व्यक्त लगे और इस हस्तक्षेप का एक परिणाम के रूप में, इन जानवरों प्रदर्शन किया गड़बड़ी की कार्यक्षमता का संकेत व्यवहार में परिवर्तन प्रदर्शन के साथ वयस्क चूहों उत्पन्न करने के लिए अनुकूल है, यह दर्शाता है कि. इस अध्ययन में, एक उदाहरण के रूप में, प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के एक छोटे से हिस्से में एकतरफा DISC1 overexpressing चूहों एम्फ़ैटेमिन के प्रति अतिसंवेदनशीलता (9 चित्रा) से पता चला है.
में vivo bioluminescence इमेजिंग द्वारा electroporation सफलता के लिए चूहों का चयन IUE सेल अभिकर्मक के निहित परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रित करने में प्रभावी था और बाद में जांच के लिए कम अंतर - विषय परिवर्तनशीलता का एक समरूप IUE क्षेत्र के साथ समूहों उत्पन्न करने के लिए आवेदन किया था.
इस अध्ययन में, हम भी यद्यपि, नवजात पशु में सह electroporated GFP प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाने के द्वारा कूड़े से electroporated पिल्ले का चयन करने में असमर्थ थेऊ एक ही समय में और एक ही पशुओं में समान रूप से सह electroporated luciferase की एक bioluminescence संकेत luciferin इंजेक्शन (चित्रा 6) के बाद पता लगाया जा सकता है, और न्यूरॉन्स व्यक्त GFP छह महीने की उम्र में अभी भी मस्तिष्क में मौजूद थे. हम चूहे में, luciferase / luciferin प्रतिक्रिया सफल electroporated दिमाग के साथ जानवरों (चित्रा 3) के अंतर करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, निष्कर्ष है कि.
IUE सफलता की मात्रात्मक निगरानी एक ही समय जोखिम (चित्रा 3) के भीतर फोटॉनों की गिनती से मापा और सह व्यक्त luciferase के enzymatic गतिविधि से मेल खाती है जो bioluminescence सिग्नल की शक्ति से संबंधित है. लघु bioluminescence संकेतों 6 महीने पुरानी चूहे के मस्तिष्क में ऊतक विज्ञान में ~ 1x10 4 फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / steradian शो 1,000-2,000 GFP-दाग कोशिकाओं की एक चमक में, फोटोन के 100-200 मायने रखता द्वारा detectable हैं, और. उच्चतम संकेत dispकी एक चमक रखी ~ 5x10 6 फोटॉनों / सेक / 2 सेमी / steradian और ~ 64,000 गिनती के लिए ऊपर.
इस्तेमाल किया Sprague Dawley चूहा तनाव में, हम बढ़ती उम्र के साथ longitudinally bioluminescence संकेत के एक कमजोर मनाया और संकेत P35 की उम्र (चित्रा 4) से परे गायब हो गया. इस बिंदु पर, हम luciferase की क्षणिक, प्लाज्मिड वेक्टर आधारित अभिव्यक्ति या तो कम हो जाती है, या bioluminescence संकेत वृद्धि के कारण मस्तिष्क जन, या दोनों गायब संकेत के लिए कारण हैं करने के लिए कमजोर है अगर नहीं जानते कि क्या. वयस्क चूहों में मौजूद कार्यात्मक परख के लिए, व्यवहार के अध्ययन के लिए चयन केवल संकेत के स्थान पर आधारित बनाया है, लेकिन नहीं bioluminescence सिग्नल की शक्ति के द्वारा किया गया था.
3 डी मात्रात्मक bioluminescence निगरानी अलग electroporated क्षेत्रों (चित्रा 5) के बीच भेदभाव की अनुमति दी है, भले ही इसके accurateness गहराई पैसा में स्थित कोशिकाओं के लिए सीमित थामस्तिष्क की nsion. 6 चित्रा 2 डी और 3 डी तस्वीर में bioluminescence माप electroporation की एक अच्छी स्थिति जहा पर एक हिप्पोकैम्पस electroporation की एक उदाहरण दिखाता है. विच्छेदित पोस्टमार्टम मस्तिष्क में, एक GFP प्रतिदीप्ति संकेत हिप्पोकैम्पस की सही लक्ष्यीकरण का संकेत है, bioluminescence संकेत के रूप में एक ही स्थिति के बारे में पता चला था. लेकिन ऊतक विज्ञान शो भी हिप्पोकैम्पस के प्रांतस्था पृष्ठीय में कोशिकाओं (चित्रा 7) लक्षित किया गया था. इस bioluminescence परख सकारात्मक, IUE पिल्ले का पता लगाने के लिए और भी electroporated क्षेत्र की एक विचार है, लेकिन, अंत में, इमेजिंग बिल्कुल सकारात्मक लक्षित कोशिकाओं के स्थानीयकरण का पोस्टमार्टम ऊतक विज्ञान की जगह नहीं कर सकते हैं एक उपयोगी उपकरण है कि इंगित करता है.
हमारा प्रदर्शन ग में aberrances अनुकरण करने के लिए cortical या हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क क्षेत्रों की सूक्ष्म लक्षित जोड़तोड़ उत्पन्न करने के लिए IUE प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के लिए वादा इंगित करता हैortical प्रवास या वयस्क जानवर को प्रभावित कर सकते हैं कि अन्य neurodevelopmental दोष. द्विपक्षीय electroporation 26 व्यवहार पर एक संभावना बड़ा प्रभाव का लाभ दिया है, वहीं भ्रूण की अधिक मृत्यु दर भी वहाँ है. एकतरफा electroporation के एक एकतरफा, छोटे क्षेत्र में भी IUE छेड़खानी व्यवहार बदलने के लिए पर्याप्त है कि दिखाने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में एक है, साथ ही साथ दो गोलार्द्धों तुलना करने के क्रम में चुना गया था. न्यूरॉन्स के बीच कनेक्टिविटी या वास्तुकला में IUE प्रेरित परिवर्तन इस प्रकार उचित व्यवहार परीक्षण के साथ एक घाव और होने से IUE छेड़छाड़ क्षेत्र की आवश्यकता मैच evoking बिना प्रेरित किया जा सकता है वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर है.
दोष निवारण
कम कूड़े आकार IUE पिल्ले के अस्तित्व में वृद्धि के बारे में कई सुझाव हैं. सबसे पहले, electroporation के दौरान बहुत पतली कांच capillaries का उपयोग ऊतक lesio कम करने के लिएn सिफारिश की है. दूसरा, प्रत्येक गर्भाशय सींग की योनि अंत में पहली भ्रूण electroporate नहीं है: पहले जन्मे भ्रूण की मौत अन्य सभी भ्रूण की एक गर्भपात की संभावना बढ़ जाती है. तीसरा, जन्म के बाद, माँ चूहों कारण अक्सर प्रसवकालीन तनाव को उनकी संतान का हिस्सा मार डालते हैं. अतिरिक्त तनाव को कम करने के लिए, सही जन्म के बाद रहते इमेजिंग के साथ शुरू नहीं है, लेकिन सात दिनों के लिए प्रतीक्षा करें.
पिल्ले की GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने
एक सप्ताह में जन्म के बाद, IVIS स्पेक्ट्रम के साथ लाइव दूरबीन प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग या प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कर या तो द्वारा प्रतिदीप्ति का कोई संकेत (epifluorescence और transfluorescence मोड, GFP / उत्तेजना उत्सर्जन के लिए: 465/520 एनएम और 500/540 एनएम). यह त्वचा की खोपड़ी और उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि की तरह ऊतकों के माध्यम से छोटी तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के सीमित प्रसारण जानकारी के तहत प्रतिदीप्ति का उपयोग रोकने के दोनों संभव है किचूहे में स्थितियां ribed. चित्रा 6 में दिखाया गया है, रहने वाले जानवर में luciferase संकेत भी (खोपड़ी के बिना) विच्छेदित मस्तिष्क में पाया जा सकता है और वहाँ भी एक प्रतिदीप्ति संकेत (चित्रा 6D) detectable है.
निकट दूरी मस्तिष्क क्षेत्रों में bioluminescence का भेदभाव
यहां तक कि 3 डी चित्र में bioluminescence क्षेत्र का स्थान 100% की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है. या भविष्यवाणी क्षेत्र के नीचे के शीर्ष पर विशेष रूप से कोशिकाओं को भी गलती से निशाना बनाया और ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. सही स्थिति (7 चित्र देखें) पोस्टमार्टम (प्रतिदीप्ति) ऊतक विज्ञान के द्वारा नियंत्रित किया जाना है.
Disclosures
इस अध्ययन के लेखकों के इस अध्ययन में वित्तीय हित नहीं है और इस अध्ययन के लिए उद्योग द्वारा प्रायोजित नहीं किया गया है. ओपन एक्सेस फीस PerkinElmer इंक पद प्रकाशन द्वारा योगदान किया गया.
Acknowledgments
लेखकों plasmids उपलब्ध कराने के लिए ट्रेसी युवा Pearse और Atsushi Kamiya धन्यवाद.
सी.के. करने के लिए, और बड़े पैमाने पर करने के लिए (डे 792/2-4) है, यह काम या और सी.के. (BMBF 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) को न्यूरॉन Eranet डिस्कवर द्वारा वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||
| Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
| kodan Tinktur forte | Schülke Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical Scissors - sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
| Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
| IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
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