Summary
El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.
Abstract
Interrogatorio escala del genoma de la función génica mediante RNA de interferencia (RNAi) es muy prometedora para la rápida identificación de las vulnerabilidades de células de cáncer químicamente manejables. Limitar el potencial de esta tecnología es la incapacidad para delinear rápidamente la base mecánica de los resultados fenotípicos y por lo tanto informar sobre el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidos molecularmente. Resumimos aquí los métodos de deconstruir fenotipos celulares inducidos por genes RNAi mediada por la orientación utilizando sistemas indicadores multiplexados que permiten el seguimiento del cáncer de los procesos clave asociados a células. Esta metodología de cribado de alto contenido es versátil y se puede adaptar fácilmente para la detección de otros tipos de bibliotecas moleculares grandes.
Introduction
Una variedad de los reporteros de luciferasa basados para el seguimiento de una gran variedad de procesos biológicos celulares están disponibles comercialmente. La mayoría de estas construcciones de ADN que codifican proteínas de luciferasa que son inducidas a expresar por estímulos o perturbaciones celulares específicos. Los reporteros transcripcionalmente basados en la mayoría de los sólidos colocan la expresión de una enzima luciferasa bajo el control de elementos potenciadores sintéticos o regiones promotoras de genes bien establecidos para su fiabilidad en informar de un evento de 1,2 transcripcional fisiológicamente relevante. También hay sistemas de trans-reportero de luciferasa que utilizan GAL4-UAS para conducir expresión de la proteína luciferasa. Gal4 es un activador transcripcional de levadura y la UAS es un potenciador de Gal4 que se une específicamente a activar la transcripción de secuencias de genes situados corriente abajo de la misma 3. Estos tipos de sistemas de luciferasa están típicamente soportadas por dos plásmidos de ADN - uno codifica la proteína GAL4 fusionado a la REGULATORY porción de una proteína de interés, y el segundo codifica una proteína luciferasa colocado bajo el control de una o más secuencias UAS. Por lo tanto, la señal de luciferasa celular refleja el nivel de actividad de la proteína de interés. Otro uso común de los reporteros de luciferasa basados es para el seguimiento de la estabilidad de proteínas mediante el cual una proteína de interés se fusiona con una enzima luciferasa 4. Sin importar el tipo de reportero, un caveat emptor se observa aquí no se puede asumir la especificidad de cualquier periodista que ha sido así interrogado. Por lo tanto, se requiere la debida diligencia en la incorporación de nuevas construcciones reportero en cualquier estrategia de investigación.
La selección de la enzima luciferasa de lectura puede ser tan importante como la fiabilidad de los elementos de ADN que controlan su expresión. Considerando que la luciferasa de luciérnaga (FL) es la enzima más comúnmente utilizado en construcciones disponibles comercialmente, la llegada de nuevos sistemas de informadores de luciferasa que no requieren ATP (como en el casode reacciones FL-based) o que incorporan enzimas más estables que emiten señales más fuertes promesa de mejorar la eficiencia y la fiabilidad de esta plataforma de investigación. Una nota importante sobre la selección de los reporteros de luciferasa en los estudios químicos es la susceptibilidad de FL a la inhibición química que podría dar lugar a informes falsos. En nuestra experiencia, otras enzimas tales como la luciferasa de Renilla o Gaussia (RL y GL, respectivamente) que utilizan coelenterazina como sustrato son menos fácilmente inhibida por moléculas pequeñas 5.
El formato más común para la multiplexación de luciferasa lecturas del implica el uso de FL y RL en gran medida dada la disponibilidad de fácil de utilizar con los kits de la capacidad de medir secuencialmente las actividades enzimáticas a partir de una sola muestra. En la mayoría de los kits, las muestras se expusieron primero a luciferina para revelar los niveles de actividad FL seguido de un reactivo de extinción que se depositan simultáneamente con coelenterazina para producir una segundaseñal RL dary. Con la adición de otras luciferasas que pueden ser secretadas tales como GL o que el uso de otro sustrato tal como Cypridina luciferasa (CL), un mayor número de posibilidades para la generación de datos de alta contenido utilizando luciferasas han surgido. Un ejemplo de un genoma de gran pantalla de RNAi mediante esta técnica se puede encontrar aquí 6. Estos avances tecnológicos tienen a su vez estimulado el desarrollo de mecanismos específicos para saciar cada tipo de enzima luciferasa para limitar la diafonía 7. En nuestras manos, observamos una mayor frecuencia de "efectos de borde" inexplicables (tendencias en la actividad celular asociada con el borde de las placas de cultivo de alto título), con luciferasas secretadas tales como GL o CL. Por otra parte, tales luciferasas secretadas son útiles para ensayos cinéticos, ya que permiten muestreo de la señal sin adulterar la viabilidad celular.
Para nuestro estudio presentado aquí, vamos a monitorear simultáneamente la actividad de tres cáncer relevanteprocesos celulares: el p53, Kras y Wnt vías de transducción de señales. Los periodistas incorporados en nuestro estudio son el FL reportero pp53-TA-Luc de Clontech (en adelante, el periodista p53-FL) 8, un sistema reportero Elk1-GAL4/UAS-CL (en adelante, Elk-1 reportero; Agilent), y el reportero de 8X TCF RL que incorpora múltiples elementos potenciadores sintéticos reconocidos por la vía Wnt reguladores transcripcionales conocidos como factores de células T (o TCF) 9-11.
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Protocol
Protocolo completo tarda aproximadamente 4 días.
1. Preparación de las células para la transfección siRNA y Reportero
Vamos a introducir aquí un protocolo para interrogar bibliotecas siRNA utilizando un pequeño conjunto de siRNAs (384 diferentes siRNA piscinas matriz en formato de 96 pocillos con cada grupo que consiste en 4x siRNAs dirigidos a un solo gen) de un genoma de gran biblioteca de siRNA con fines ilustrativos. Para este estudio en particular, vamos a explotar las células HCT116 que exhiben señalización Wnt y Kras desviadas, y la actividad de p53. La línea celular apropiada en estudios destinados a interrogar a otros procesos celulares de interés tendrá que ser identificado y evaluado de una manera similar.
- Lavar 5 x 10 cm 2 placas de 80-90% confluentes células HCT116 con PBS y luego recoger las células por tripsinización utilizando 1 ml de solución de tripsina / placa seguido de neutralización con 10 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 2% de FeTal suero bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / placa.
- Transferir las células en suspensión a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a ~ 130 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM / FBS al 2% / 1% de penicilina / estreptomicina.
- Contar el número de células con un contador de células y, a continuación, hacer una solución de células con 10 5 células / ml, mantener a 150 ml de suspensión celular para el siguiente paso. Placa 10 4 células (100 l) en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos usando un dispensador de líquido automatizado Multidrop (en adelante Multidrop). La suspensión de células debe ser suficiente en este caso para el chapado 12 x placas de 96 pocillos.
- Se incuban las placas con las células a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2, mientras que la preparación de la mezcla de transfección.
2. Preparación del Construct Stock Solution Periodista
- Aislar reportero de alta calidad constructo de ADN utilizando midiprep kits estándar (NucleoBond Xtra Midi-producido porClontech) y diluir el ADN hasta una concentración final de 1 mg / ml para cada reportero.
- Preparar 100 l de solución madre reportero construir mediante la combinación de 30 l de p53-FL, 30 l de 8x TCF-RL, 30 l de Elk1-Gal4, 6 l UAS-CL y 4 l de H 2 O para lograr una mezcla de ADN con una final 1:1:1:0.2 relación de los periodistas. Concentración de ADN final de este ADN mezcla solución madre es de 0,3 mg / ml.
3. Preparación de la ARNsi / ADN de la mezcla de transfección
En esta parte del protocolo, prepararemos siRNA / mezclas de transfección de ADN que serán suficientes para la transfección de 12 x 96 y placas. Por esta biblioteca de prueba de 4 x 96 y placa de siRNAs, vamos a transfectar cada grupo siRNA por triplicado. El reactivo de transfección que utilizaremos se llama Effectene (Qiagen). En nuestras manos este es el único reactivo que funciona para la entrega simultánea de siRNA y ADN en las células cultivadas.
- Diluir 80 l de reportero construir Stock sollución en 8 ml de tampón CE (Effectene kit) para lograr una solución de ADN con una concentración final de 3 g / ml. En general, preparar suficiente mezcla de solución de ADN para su uso inmediato.
- Placa de 20 l de esta solución de ADN a cada pocillo de un 96 así / placa. El número de placas de 96 pocillos dependerá de cuántos serán probados piscinas siRNA. Por ejemplo, en este caso tendremos que 4 x placas de 96 pocillos para evaluar 384 piscinas siRNA diferentes.
- Los siRNAs a ensayar deben estar a una concentración madre de 5 mM. Si no, pueden ser réplica chapada y se diluyó a esta concentración utilizando el tampón de dilución recomendada asociada con cada biblioteca.
- Transferir 2 l de cada 5 mM de stock ARNsi en el correspondiente pocillo de la placa de PCR que contiene la población de ADN diluido con un Liquid Handler automatizado Biomek. Dependiendo de la escala del estudio, una pipeta de múltiples canales puede ser suficiente.
- Ahora, vamos a añadir 1 l de solución Enhancer (kit Effectene) a cada pocillo de la DNA / siRNA plate. De nuevo, esto se puede lograr ya sea con un manipulador de líquidos automatizado o pipeta multicanal.
- Permitir que la reacción reforzador que se produzca a temperatura ambiente durante 5 min y después añadir 3 l de reactivo de transfección Effectene a cada pocillo e incubar a TA durante 10 min adicionales.
- Para detener la formación de complejos de transfección, añadir 10 l de DMEM / FBS al 2% / 1% de penicilina / estreptomicina a cada pocillo de la placa de PCR.
- Transferir 10 l de la mezcla de transfección a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene las células (recuperados de la incubadora de células). Como se realizará cada transfección por triplicado, la misma mezcla se aplica a dos adicionales placas de 96 pocillos que contienen células.
- Se incuban las células con mezclas de transfección añadido a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO 2 durante 36 horas.
4. Determinar las actividades de luciferasa a partir de muestras de células
Después de 36 horas, las actividades luciferasa están listos para la mediciónen las células transfectadas. El punto final se determinará en función de cada experimento. En nuestro estudio, un tiempo de incubación de 36 horas se había producido previamente una señal suficientemente fuerte para decir, la determinación de los resultados. Como este estudio incorpora múltiples reporteros (uno secretada en el medio de cultivo, y los otros dos se expresa en el citoplasma de la célula), obtendremos mediciones tanto de medio de cultivo, así como un lisado celular.
- Detección de la actividad de CL en el medio de cultivo:
- 20 l de medio de cultivo es réplica chapada en un blanco opaco de 96 pocillos (ya sea usando el Liquid Handler Biomek o pipeta multicanal).
- Añadir 20 l de tampón de ensayo CL (Targeting Systems) a cada pocillo.
- Añadir 10 l de sustrato luciferina Cypridina (Targeting Systems) a cada pocillo y detectar la actividad de CL utilizando un luminómetro (el lector de placas Pherastar producido por BMG por ejemplo).
- La detección de FL y RL actividad:
- Lyse la cells quitando primero el medio de cultivo. Esto se puede lograr rápidamente girando plato boca abajo y lanzando medio en un fregadero. Medio restante puede eliminarse golpeando suavemente la placa boca abajo sobre toallas de papel. Añadir 30 l de 1X tampón de lisis pasiva (Promega) a cada pocillo de células utilizando el multipunto y colocar en una plataforma oscilante (Bellco es una empresa que fabrica estos) establecen una velocidad media durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 20 l de reactivo de ensayo de luciferasa II (parte del Kit de luciferasa Dual Promega) utilizando la actividad FL multipunto y medir inmediatamente usando el luminómetro. A continuación, agregue Stop & Glo reactivo (Promega) que calmar la actividad FL y permitir la medición de la actividad de RL. Nota: a menos que utilice mezclas de sustratos que permiten duración de la señal extendida (como Kits de luciferasa Dual-Glo de Promega), el uso de kits de flash requiere la medición rápida después de la adición de sustrato (a menos de 5 minutos).
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Representative Results
A pesar de los avances en la cartografía del paisaje mutacional de varios tipos de cáncer que utilizan enormes esfuerzos de secuenciación del genoma 12-14, seguimos sin contar con un enfoque sistemático para la traducción de las observaciones en las estrategias de intervención. En el cáncer colorrectal (CRC), las mutaciones que se prevé que afectará a los componentes de los tres procesos celulares - Wnt / β-catenina, p53, Kras y señalización - se encuentran en el 99% de todos los tumores que sugieren que son factores clave de la transformación celular en el intestino 13. Por lo tanto, los conjuntos de datos del genoma del cáncer son propensos enriquecidas en genes que apoyan el cáncer denominador común la promoción de los procesos, y que podrían ser explotadas para la rápida identificación de las vulnerabilidades de células cancerosas. Para investigar esta hipótesis, hemos ideado estrategias susceptibles a la interrogación de alto rendimiento de la función de genes con respecto a Wnt / β-catenina, p53, Kras y señalización. En primer lugar, demostrar la especificidad de cada sistema de reportero en un solo Reportadopruebas de r (Figura 1) y, a continuación proporcionan evidencia de que estos reporteros podrían utilizarse juntos para mediciones simultáneas de la actividad de los genes de estos tres procesos celulares importantes (Figura 2).
Figura 1. Ensayos de luciferasa basados en alto rendimiento para el seguimiento de Wnt / β-catenina, p53 y Kras / Erk estado de vía en células de mamífero. La robustez de tres plataformas de cribado diferentes fueron evaluados de forma individual antes de siRNAs de control utilizando multiplexación dirigidas a componentes de la vía bien establecidos. Líneas celulares de cáncer colorrectal indicados fueron transfectadas con el 8x TCF, pp53-TA-Luc, o Elk-1 luciérnaga reportero que codifica la luciferasa construye junto con piscinas de siRNAs dirigidos a β-catenina, p53, o Kras, respectivamente. PathwaSe indican los genotipos y-pertinentes para cada línea celular. La fuerza de cada plataforma de cribado se evaluó por la reproducibilidad de estos efectos inducidos por siRNAs en la vía de transducción de señal relevante. Los siRNAs β-catenina no tienen ningún efecto sobre la actividad de reportero de 8X TCF en células RKO en contraste con DLD-1 y células HCT-116, respectivamente, que son deficientes en la proteína supresora de vía de APC y expresan una forma activada de β-catenina. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Multiplexación periodistas basados en luciferasa para el análisis celular de alto contenido de la función del gen. A. Representación esquemática de una estrategia para monitorear simultáneamente Wnt / β-cat enin, p53, y las actividades de la vía Kras. FL = luciferasa de luciérnaga, RL = luciferasa de Renilla, CL = Cypridina luciferasa (enzima secretada). FL y RL actividades en lisado se determinan usando luciferina y sustratos coelenterazina. CL actividad en el medio de cultivo se mide usando oxiluciferina. * Otros sistemas indicadores se pueden incorporar en este protocolo para aumentar el contenido de cada experimento. Por ejemplo, el ensayo de Harina CytoTox puede ser usado para monitorear la toxicidad celular mediante el muestreo de los niveles de una proteasa intracelular liberado en el medio de cultivo. La adición del reactivo de ensayo de CytoTox no influye en la actividad del reportero CL. B. Identificación de las vulnerabilidades de vía-específicos utilizando RNAi. La capacidad del sistema de multiplexado de luciferasa descrito en "A" para cuantificar dedicación gen para la función celular se ensayó usando las piscinas siRNA indicados.nk "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
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Discussion
Hay varios proveedores de sistemas de reportero luciferasa basados (tales como Promega, sistemas de focalización, New England Biolabs, y Thermo Fisher) que proporcionan útiles recursos en línea para aquellos que entretener una pantalla de alto rendimiento para la primera vez. Además, un número de excelentes críticas con respecto a la optimización de la utilización de pantallas de alto rendimiento para el descubrimiento de genes y cómo RNAi basada en los resultados de detección pueden estar integrados con otros conjuntos de datos-ómicas basados debería ser útil 15,16. Los métodos para la selección de los "hits" de pantallas de alto rendimiento son el tema de otra discusión que está más allá del alcance de este informe. Varias opiniones sobre este tema están disponibles 17,18. Sin embargo, un criterio importante para la validación de accesos seleccionados de pantallas basadas en el uso de la prensa transcripcionalmente activados es la capacidad para el mismo perturbagen (ARNi-o basado químicamente) para inducir el mismo efecto en los genes diana validados como se mide mediante RT-PCR, qPCRO el análisis de microarrays. Por otra parte, tenga en cuenta que la magnitud de la respuesta medida por el reportero es típicamente más alta que la inducción de un reportero endógena dado que una característica de un reportero con éxito es sintética para proporcionar una señal robusta. Por último, una ventaja de esta estrategia de co-transfección es la facilidad con la que se puede montar rápidamente diferentes cócteles reportero para el seguimiento de un conjunto deseado de las actividades celulares. A pesar de más mano de obra intensiva, el uso de líneas celulares de forma estable que albergan los reporteros probablemente aumentar la relación señal a ruido dada la variabilidad de la respuesta es ahora principalmente limitada a la eficiencia de transfección ARNsi solo.
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Disclosures
Aceptar y LL son autores de una patente pendiente en relación con la tecnología de multiplexado luciferasa.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo financiero de CPRIT (RP100119) y la Fundación Welch (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
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