Abstract
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest använda i hjärnan genom att utnyttja svinpatogenen pseudorabiesvirus (PRV) 1. PRV smittar inte människoapor, inklusive människor, så det är vanligast i studier på små däggdjur, särskilt gnagare. Den pseudorabiesstam PRV152 uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen och endast korsar funktionella synapser retrograd genom den hierarkiska sekvensen av synapsförbindelser bort från infektionsstället 2,3. Andra PRV stammar har tydliga mikrobiologiska egenskaper och kan transporteras i båda riktningarna (PRV-Becker och PRV-Kaplan) 4,5. Detta protokoll kommer att enbart behandla PRV152. Genom att leverera viruset vid en perifer plats, såsom muskel, är det möjligt att begränsa inträde av viruset i Than hjärnan genom en specifik uppsättning nervceller. Det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan löser därefter de neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler. Som den distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med pseudorabiesvirus gör att tolka vissa anslutningar inom en identifierad nätverk svårt, presenterar vi en känslig och tillförlitlig metod som använder biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB) för att bekräfta sambandet mellan celler som identifieras med hjälp av PRV152. Immunokemisk detektion av BDA och CTB med peroxidas och DAB (3, 3'-diaminobensidin) valdes därför att de är effektiva på att avslöja cellulära processer inklusive distala dendriter 6-11.
Introduction
Transsynaptisk spårning har blivit ett kraftfullt verktyg som används för att analysera centrala efferents som reglerar perifera mål genom flera synaptiska kretsar. Detta tillvägagångssätt har mest flitigt i gnagare hjärnan genom att utnyttja svin patogen pseudorabiesvirus (PRV), särskilt den försvagade stammen PRV-Bartha först beskrevs 1961 12. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera motor kortikala representation av specifika muskler eller muskelgrupper med användning av en rekombinant pseudorabiesvirusstam (PRV152) som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) reportergen 2. Den beskrivna metoden utnyttjar beteende neurotropa virus, som producerar infektiös avkomma som tvär synapser att infektera andra nervceller i en funktionell krets 3,4,13. PRV152, vilket är isogen med PRV-Bartha, korsar bara synapser retrograd genom den hierarkiska sekvens av synapsförbindelser bort från infektionsstället 3,5 </ sup>. Genom att exakt kontrollera den perifera infektionsstället är det möjligt att begränsa inträde av viruset in i hjärnan genom en särskild undergrupp av motomeuroner. Eftersom viruset sekventiellt infekterar kedjor av anslutna nervceller, kommer det resulterande mönstret av EGFP-signalen i hela hjärnan sedan lösa det nätverk av neuroner som är anslutna till de initialt infekterade celler.
En ytterligare fördel med att använda viruset för neural spårning är amplifieringen av reporterproteinet (EGFP i detta fall) i infekterade celler. Denna signal förstärkning ger en nivå av känslighet som tillåter detektion av även glesa utsprång. Till exempel var en gles utsprång från vibrissa motoriska cortex till ansikts motoriska nervceller som styr hårkristaller hittades på råttor med användning viralt uttryckt grönfluorescerande protein 14; tidigare studier misslyckats med att hitta denna projektion med hjälp av klassiska spårämnen utan reportergen förstärkning 11,15. Tyvärr, Många virala spårning vektorer, som den som används i den citerade studien, korsa inte synapser, vilket begränsar deras användning för att spåra fler synaptiska kretsar.
Medan presentera tydliga fördelar för att identifiera nätverket av celler som deltar i en motorkrets, distribuerade karaktär transsynaptisk spårning med PRV-152 gör att tolka vissa anslutningar inom kretsen svårt. Därför presenterar vi en enkel metod för att validera specifika anslutningar inom kretsar identifieras med hjälp av PRV-152 genom att dubbelmärkning med hjälp av biotinylerade dextran aminer (BDA) och koleratoxin subenhet B (CTB). Den kombinerade användningen av BDA och CTB är en väletablerad metod för att spåra kopplingar mellan specifika typer av nervceller 6-8,11. När de används tillsammans, kan dessa två spår visualiseras i samma avsnitt med hjälp av en tvåfärgad DAB (3, 3 'diaminobensidin) förfarandet 16. Högmolekylärt BDA (BDA10kDa) valdes för detta protokoll eftersom det yields detaljerad märkning av neuronala processer 6,7,9. Ytterligare fördelar med BDA10kDa innefattar följande: det är företrädesvis transporteras i antero riktningen 6-8; det kan levereras av jontoforetiskt eller tryck injektion 6-8; det kan visualiseras genom en enkel avidin-biotinylerat HRP (ABC) förfarande 17; och den kan förses med bild genom ljus- eller elektronmikroskopi 6,7,18. Immunokemisk detektion av CTB med peroxidas och DAB valdes för retrograd märkning av motoneuroner eftersom det är effektivt vid avslöjande cellulära processer inklusive distala dendriter 10,19. Vi använde nyligen denna metod för att identifiera röstmotorvägen hos möss och att avslöja en gles anslutning från primära motoriska cortex till laryngeala motoriska nervceller, som tidigare antogs vara frånvarande 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök har granskats och godkänts av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Lagring av pseudorabiesvirus
- Vi får levande virus (PRV152) från laboratoriet av Dr Lynn Enquist vid Princeton University i en titer av 1 x 10 9 pfu / m. Protokollet för att generera viruset har publicerats 2.
- Alikvotera viruset vid 20 ^ per rör inuti en BSL-2 biosäkerhet skåpet och förvara vid -80 ° C under lämpliga biosäkerhet betingelser.
- Tina en alikvot av PRV omedelbart före injicering.
2. Kirurgisk förberedelse för injektionsvätskor i en muskel
- Inducera narkos genom intramuskulär injektion av ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) och upprätthålla ett lämpligt anestesi plan med hjälp av isofluorane.
- Skydda hornhinnor med en oftalmisk salva.
- Förbered tHan operationsstället enligt aseptisk teknik genom att klippa håret och desinfektion av operationsområdet med alternerande skurar av Betadine och 70% alkohol (minst 3 cykler). Var noga med att använda sterila draperier för att täcka kirurgiska områden. Se till att ansluta sig till sterila tekniker under förfarandena.
- Gör en hud incision och avslöja muskeln av intresse. Till exempel, för att komma åt cricothyroid laryngeal muskler är det nödvändigt att först ta bort den överliggande delen av sternohyoideus.
- Täta alla avskurna muskler med VetBond vävnadslim.
3. Injektion av PRV i Muskel
- Ladda 10 pl NanoFil mikrosystem med färskt tinade PRV lösning, bifoga en 34 G-rostfritt stål nål och försiktigt montera den på stereotaxic enheten.
- Sakta rensa döda utrymmet och kontrollera att lösningen lämnar spruta spetsen. Kassera fluidum som bioharzard avfall.
- Med hjälp av en stereotaktisk microPositioning enhet försiktigt placera mikrospetsen i muskeln av intresse och långsamt fylla muskeln tills lätt svullnad är synlig. Insprutningshastigheten kommer att variera beroende på storleken av muskeln och volym som skall injiceras. Exempelvis bör göras fem injektioner av 200 nl (1 | j, l totalt) vid en hastighet av 4 nl / sek 1 min mellanrum på samma plats för att fylla cricothyroid muskeln. Flytta sprutan till nästa muskeln av intresse (sido cricoarytenoid i detta fall) och upprepa injektionsproceduren. Bara punktera varje muskel en gång.
- Dra tillbaka mikro efter fem minuter.
- Täta avbrott i fascian med hjälp VetBond vävnadslim.
- Efter alla injektioner har slutförts stänger såret med hjälp av VetBond vävnadslim. Beroende på din lokala institional riktlinjer djur användning, suturer eller sårklämmor kan användas.
- Övervaka djuret fram sternala VILA och ge smärtlindring, mat, vatten, och den omvårdnad som krävs av yvåra institutionella riktlinjer djur.
- Efter den experimentellt bestämda överlevnadstiden (i det här fallet, 90 timmar för att märka 2: a beställa kortikala neuroner), offra animaliska biprodukter pentobarbital överdos och BEGJUTA transkardiellt med 0,9% saltlösning följt av 4% formaldehyd i 0,1 M PBS.
- Ta ut och efter fixera hjärnan i 4% formaldehyd under 24 timmar.
- Cryoprotect hjärnan i fosfatbuffert innehållande 30% sackaros under minst 48 timmar.
4. Immunokemisk detektion av EGFP
- Skär sektioner vid 40 pm på en glidande mikrotom och spara flytande sektioner i 0,1 M PBS. Tunnare sektioner, t ex 30 pm, kan användas vid färgning monterade sektioner.
- Släck avsnitt för 30 minuter i 0,3% H 2 O 2 i PBS skyddas från ljus.
- Blockera icke-specifika antigener i sektionerna under 30 min i PBS innehållande 0,3% Tween 20 med normalt getserum från Vectastain Elite Kit (VE satsen).
- Tvätta sektioner tre gånger i PBS under 5 min, därefter inkubera dem under en h i get anti-kanin sekundär antikropp från VE satsen vid RT.
- Bered ABC lösningen från VE kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Tvätta sektioner tre gånger i PBS under 5 min, därefter reagera med dem för en timme i ABC lösningen från VE satsen vid RT.
- Tvätta sektioner tre gånger i fosfatbuffert under 10 minuter, och utvecklas under 8 min i fosfatbuffert, pH 7,4, innehållande 0,05% DAB (3, 3'-diaminobensidin) och 0,015% H2O 2.
- Mount avsnitten på Superfrost Plus-objektglas och torkar dem genom en graderad alkoholserie (70%, 95%, 100% och 100% för 5 min vardera).
- Rensa sektionerna genom två xylen tvättar (5 min vardera) och täckglas objektglasen med Permount monteringsmedium.
- Bild de monterade delarna på ett mikroskop. DAB Reaktionsprodukten inside cellerna ska visas brun. Digitaliserade bilder kan vara färg inverteras för att lyfta fram fina processer.
5. Kirurgisk förberedelse för injektion av spårämnen i hjärnregioner upptäcktes av PRV Tracing
- Inducera narkos genom intramuskulär injektion av ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) och upprätthålla ett lämpligt anestesi plan med hjälp av isofluorane.
- Skydda hornhinnor med en oftalmisk salva.
- Fäst huvudet i en lämplig stereotaktisk ram.
- Förbered operationsområdet enligt aseptisk teknik genom att klippa håret och desinficering platsen med omväxlande skurar av Betadine och 70% alkohol (minst 3 cykler).
- Gör en hårbotten snitt och dra tillbaka huden över hjärnan regionen av intresse.
- Gör en liten kraniotomi på lämpliga stereotaxic koordinater. Exempelvis koordinaterna för laryngeally ansluten motor cortex identifierats av PRV spårning i enn vuxen mus är 1,2 mm i sidled och 0,2 mm rostralt Bregma.
6. Injektion av Biotinylerade Dextran aminer i hjärnan
- Förbered 7,5% biotinylerade dextran aminer (BDA) genom att lösa 25 mg BDA (10000 MW) i 333 il steril saltlösning.
- Ladda Nanoject II mikropipett systemet med tillräcklig BDA lösning för de planerade injektioner.
- Sakta rensa döda utrymmet och kontrollera att lösningen är spännande mikropipett spetsen.
- Med hjälp av en stereotaktisk mikropositioneringsanordning försiktigt sänka mikropipett spets in i hjärnan regionen av intresse och injicera långsamt BDA. Justera insprutningshastigheten beroende på storleken av det område som skall märkas. Till exempel bör 12 injektioner av 4,6 nl made vara på fyra olika platser 0,2 mm från varandra (Rostro-caudal riktning) för att täcka laryngeally anslutna motoriska cortex hos vuxna möss. Den slutliga injektionsvolym bör justeras i enlighet med storleken av hjärnan regionen av intresse, Med tanke på att etiketten kan spridas från sprutkärnan genom diffusion genom hjärnvävnad och längs de processer av märkta neuroner.
- Täta kraniotomi med hjälp av tandcement och stäng hårbotten såret med hjälp av VetBond vävnadslim.
- Övervaka djuret fram sternala VILA och ge smärtlindring, mat, vatten, och den omvårdnad som krävs av din institutionens riktlinjer djur.
7. Injektion av koleratoxin subenhet B i Muscle
- Bered en% koleratoxin subenhet B (CTB) genom upplösning av en mg CTB i 100 pl steril saltlösning.
- Sex dagar efter BDA injektion i hjärnan genom att utföra den kirurgiska preparat såsom beskrivits ovan för PRV injektioner i muskeln.
- Ladda 10 pl NanoFil mikrosystem med CTB lösning, bifoga en 34 G-rostfritt stål nål och försiktigt montera den på stereotaxic enheten.
- Utför microinjections i en muskel (s) av intresse som tidigare frånritsas för PRV.
- Övervaka djuret fram sternala VILA och ge smärtlindring, mat, vatten, och den omvårdnad som krävs av din institutionens riktlinjer djur.
- Tre dagar efter CTB injektion, offra animaliska biprodukter pentobarbital överdos och BEGJUTA transkardiellt med 0,9% saltlösning följt av 4% formaldehyd i 0,1 M PBS.
- Ta ut och efter fixera hjärnan i 4% formaldehyd under 24 timmar.
- Cryoprotect hjärnan i fosfatbuffert innehållande 30% sackaros under minst 48 timmar.
8. Upptäckt av BDA och CTB i samma avsnitt
- Skär sektioner vid 40 pm på en mikrotom och spara flytande sektioner i 0,1 M PBS.
- Släck avsnitt för 30 minuter i 0,3% H 2 O 2 i PBS skyddas från ljus.
- Bered ABC lösningen från VE kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Tvätta sektioner tre gånger i PBS under 5 min, därefter reagera med dem för en timme i ABC-lösning vid RT. Tvätta sektioner tre gånger i fosfatbuffert under 10 minuter, och utvecklas under 8 min i fosfatbuffert, pH 7,4, innehållande 0,05% DAB (3, 3'-diaminobensidin), 0,015% H2O 2, och 0,05% nickelklorid. DAB reaktionsprodukten inuti cellerna ska visas svart.
- Blockdelar för 30 min i PBS innehållande 0,3% Tween 20 med normalt kaninserum från Vectastain Elite Kit.
- Inkubera blocke sektioner för 2 h i get anti-CTB (1: 10 tusen) vid RT.
- Tvätta sektioner tre gånger i PBS under 5 min, därefter inkubera dem under en h i kanin-anti-get sekundär antikropp från VE satsen vid RT.
- Bered ABC lösningen från VE kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Tvätta sektioner tre gånger i PBS under 5 min, därefter reagera med dem under 30 min i ABC-lösning vid RT.
- Tvätta sektioner tre gånger i fosfatbuffert under 10 minuter, och utvecklas i upp till 8 min i fosfatbuffert, pH 7,4, innehållande 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) och 0,015% H2O 2. DAB reaktionsprodukten inuti cellerna ska visas brun.
- Mount avsnitten på Superfrost Plus-objektglas och torkar dem genom en graderad alkoholserie (70%, 95%, 100% och 100% för 5 min vardera).
- Rensa sektionerna genom två xylen tvättar (5 min vardera) och täckglas objektglasen med Permount monteringsmedium.
- Bild de monterade delarna på ett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färgning för EGFP bör börja visa svag signal i primära motoriska nervceller cirka 72 timmar efter injektion PRV152 i en muskel. Replikationen och transsynaptisk transport av viruset är titer- och tidsberoende 4. Cirka 90 timmar efter injektionen kommer EGFP färgning avslöjar robust signal i 2: a ordning infekterade celler. Längre överlevnadstider kommer att avslöja tre: e och högre ordningens celler men överlevnadstider begränsas av letalitet av PRV vid approximativt 5 dagar efter inokulering.
Figur 1a visar neuroner infekterade med PRV152 uttrycker EGFP i nucleus ambiguus, som inrymmer de laryngeala motomeuroner, 94 h efter injektion av PRV152 i två av de sju laryngeala musklerna. Eftersom viruset kom in i hjärnan genom neuroner som innerverar de infekterade muskler, andra phonatory motoriska neuron pooler, såsom hypoglossala nucleus, inte uttrycker EGFP (figur 1b).
Figur 3 visar infekterade premotoriska nervceller i motoriska cortex som uttrycker EGFP kontra till det perifera injektionsstället. Eftersom PRV152 sprider sig via flera synaptiska kretsar som träffar laryngeala motoriska nervceller i kärnan ambiguus, kan det be antas att endast populationen av celler som utgör motor kortikala representation av larynx muskulaturen infekterades. Avsaknaden av EGFP-signalen i resten av sektionen visad (och de flesta av framhjärnan icke visade) demonstrerar specificiteten av märkningen.
Figur 4 visar BDA-märkta axoner i hjärnstammen i nivå med kärnan ambiguus. Axoner kontakt med CTB-positiva motoriska nervceller retrograd märkta av injektioner i struphuvud muskler. Axoner visas bildar varicosities och förmodade terminal boutons närheten dendriter och soma av laryngeala motoriska nervceller. Ytterligare experiment med elektronmikroskop eller elektro krävs för att avgöra om dessa varicosities representerar synaptiska boutons.
Figur 5a visar en bilateral injektion av BDA placeras i laryngeally anslutna motoriska cortex som identifierats av bakåtsträvande transynaptic spårning med PRV152. Bec ause BDA är inte riktnings specifikt, både afferenta och efferenta anslutningar kan märkas. Till exempel, både en projektionsfält (antero) och cellkroppar (bakåtsträvande) etikett ses i thalamus (figur 5b).
Figur 1: Nervceller infekterade med PRV152 Uttrycka EGFP (grön) och kolinacetyltransferas immunopositiva motoneuroner (röd) i (a) Ambiguus (Amb) och (b) Hypoglossal (XII) Kärnor av Mouse hjärnstammen 94 timmar efter injektion av PRV152 i cricothyroid och lateral Cricoarytenoid Laryngeala muskler. RF = retikulära formation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
g2.jpg "/>
Figur 2:. Psuedorabies virus (PRV152) Infektion i hjärnstammen för en mus 86 h efter Injektion PRV152 i cricothyroid och lateral Cricoarytenoid Laryngeala Muskler (a) Neuroner som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (white; färger inverterade från originalbright bilder av färgade snitt ) i nucleus ambiguus (Amb) ipsilateralt den injicerade muskeln, den omgivande retikulära bildningen (RF) och ödem kärnan (Sol), men inte den hypoglossala nucleus (XII). (B) Amb och retikulära interneuronen vid högre förstoring (röda pilar, cellkroppar i RF). Skala barer: 1 mm för en; 100 pm för b. (Ändrad från Arriaga et al. 2012). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Figur 3:. Kortikala pyramidala nervceller uttrycker EGFP (vit, färger inverterade från original bright bilder av färgade snitt) i Kortikalt Layer V M1 efter Injektion av Psuedorabies Virus (PRV152) in i cricothyroid och Lateral Cricoarytenoid Laryngeala Muscles Skala barer: 1 mm för huvudpanelen; 200 pm för infälld. (Modifierad från Arriaga et al., 2012).
Figur 4:. M1 Axoner i hjärnstammen (a) Låg effekt av en coronal hjärnsektion med CTB-märkta motoriska nervceller i Amb (brun) från en injektion i laryngeal muskler och M1 axoner (svart) från en injektion av BDA i M1. BDA märkta axoner kan ses i kortiko-pyramid (Pyr) spår. Förkortningar: Amb, nucleus ambiguus; Pyr, pyramider; MRF, reticular formation direkt mediala till Amb; DRF, retikulär bildning rygg till Amb. (B) Hög förstoring av BDA märkt axonet (svart, pilhuvuden) från M1 som kommer i kontakt (pil) på en Amb motoriska nervceller (CTB brun). (C) M1 axoner (svart) som löper längs (pilar) och nära (pilspetsar) en stor Amb motorneuron dendrite som strålar ut från Amb. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: vid injektionsstället och ytterligare dubbelriktade anslutningar avslöjas av BDA injektioner som inte setts med PRV transynaptic spårning. (a) Bilaterala biotinylerade dextran amin (BDA) injektioner (svart) i primär motor cortex (M1) visade en tät terminal projektionsfält (svart) i den underliggande striatum. (b) Cortical axoner från M1 slutar i den ventrala laterala kärnan i thalamus (VL); Ett kluster av talamus celler (mörkbrun och markeras med vit pil huvudet) projektet tillbaka till M1 sång regionen är också observerats i VL. Den inre kapseln (IC) har märkt axoner kommer från cortex. Skala barer: 1 mm för en; 200 pm för b. (Ändrad från Arriaga et al. 2012). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett antal frågor som måste beaktas när man planerar ett experiment med PRV152 4,21. Viktigast är pseudorabiesvirus dödlig. Som tidigare nämnts, stora apor, inklusive människor är inte mottagliga för smitta, men lämplig vård måste iakttas för att skydda andra djur. Vuxna möss överlever vanligtvis fem till sju dagar efter ympning med den försvagade PRV152 stammen. Därför är PRV152 inte lämpligt för experiment som kräver överlevnadstider längre än en vecka. Dessutom infekterade djur visar typiskt tecken på sjukdom under överlevnadsperioden, vilket begränsar användbarheten av PRV152 för experiment som kräver observation av normalt beteende.
Dessutom PRV152 utlöser ett cytotoxiskt immunsvar 22. Eftersom replikationen och överföring av virus titer- och tidsberoende 4, mönstret av neuroner avslöjas genom immunokemisk detektion av virusL-proteiner eller EGFP-reportergenen kommer att förändras under loppet av överlevnadsperioden som celler framsteg genom infektionsstadier. Fem dagar efter ympning i muskeln, kan 3: e eller 4: e ordningens neuron kunna upptäckas, men de tidigaste infekterade nervceller kan bli apoptotiska. Den optimala överlevnadstiden bör därför bestämmas experimentellt för varje studie. Det rekommenderas att utföra en tidsserieanalys för bestämning av framskridandet av infektion genom en krets och den bästa tidpunkten för märkning av specifika nervceller av intresse utan att riskera cell eller djur död.
En av de viktigaste faktorerna som påverkar framgången för märkning med PRV är virustiter. Markerade minskningar av antalet infekterade celler har rapporterats när minskar titer av PRV-Bartha från 1,4 x 5 till 7 oktober x 10 4 pfu / ml 23. Därför rekommenderar vi användning av titrar över 1 x 10 7 pfu / ml och hålla alikvoteras virus vid -80 ° C tills det används för att bibehålla sin infektivitet. Även när du använder en hög titer, bör man hålla i minnet att inte alla celltyper kan vara tolerant för infektion. Därför kan de celler som identifieras av PRV spårning inte vara helt representativa för de insignaler till en infekterad mål.
Den beskrivna metoden fokuserar på nyttan av PRV för att analysera centrala efferents reglerar perifera mål, speciellt muskler, genom flera synaptiska kretsar. Andra neurala kretsar, såsom visuella och autonoma 24, är väl lämpade för denna teknik, eftersom de också kan infekteras av perifer ympning. Däremot kan PRV användas effektivt för direkt injektion i det centrala nervsystemet när vissa frågor noga övervägas, såsom diskuterats utförligt i en tidigare granskning 3. Dessa författare nämner att PRV-Bartha och besläktade stammar fylla i stor utsträckning de dendritiska hållare av infekterade nervceller, vilket gör PRV152 väl lämpad för identifying afferenter till distala dendriter. Den här fastigheten av viruset gör det beskrivna tekniken speciellt användbar för att härleda en preliminär förteckning över ingångarna till distala dendriter belägna utanför cellkroppen regionen som typiskt studeras med konventionella spårämnen.
När spårning från perifera mål bör sympatisk innervation anses vara en möjlig FÖRBRYLLA. Därför rekommenderar vi inledningsvis jämföra märkningsmönster i normala och sympathectomized djur för att avgöra om PRV märkning av sympatiska insatsvaror kommer att påverka tolkningen av resultaten.
Signal i infekterade celler från EGFP uttrycks av PRV152 kan avbildas direkt med användning av fluorescensmikroskopi utan behov av immunhistokemi; emellertid är denna signal föremål för fotoblekning och försämras med tiden. Den största fördelen med immunhistokemi i kombination med DAB färgning för tarmkanalen spårning är den permanenta karaktären av reaktionsprodukterna. Även om det is också möjligt att använda antikroppar mot virala proteiner för att detektera infekterade celler, olika virala element kommer inte nödvändigtvis samtidigt lokalisera med varandra 25 eller med EGFP-signalen. Därför rekommenderar vi att du använder antikroppar mot EGFP att bevara märkningsmönstret observeras av fluorescens.
Eftersom alla afferenter till en infekterad cell kommer sannolikt att bli ledningar för transsynaptisk passage av virus, inklusive de som kontaktar distala dendriter, ansåg vi att det är viktigt att välja en konventionell spår som tillförlitligt fläckar sådana dendriter för efterföljande bekräftelse av reläer i den identifierade kretsen. Vi valde CTB för detta ändamål, och fann att det ger god färgning av dendriter och stark kontrast med både den omgivande neuropil och de nedstigande axoner från motoriska cortex. Även om det är möjligt att vända färgning av de färgade axoner och cellkroppar (BDA = brun, CTB = svart), ser vi att svart ger den bästa contrast för visualisering fina kaliber axoner.
En viktig punkt att tänka på när man tolkar BDA märkningsmönster är att BDA10kDa används främst som en anterospårämne, men kan också märka celler retrograd (Figur 6) 6. Dessutom kan BDA transporteras retrograd i en cell sedan fördelade längs en axon säkerhet till en annan terminal webbplats. Om dessa axon säkerheter är närvarande i samma region som utsprånget målet av den injicerade regionen, då är det svårt att skilja dem från antero märkning.
En slutlig teknisk anmärkning är att metallsprutan 34 G NanoFil presterar bättre än en fin kaliber, drog glaspipett för att injicera spårämnen i musklerna, men orsakar alltför mycket mekanisk skada när den används för intracerebrala injektioner i små djur. Vi rekommenderar därför att använda spruta metallen för perifera injektioner och glaspipett för centrala injektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Toshio Terashima i Kobe University, Japan, för att lära av laryngeal kirurgi teknik, och Dr. Lynn Enquist av Princeton University för att leverera PRV-Bartha. Forskningen stöddes av NIH pionjär utmärkelse DP1 OD000448 till Erich D. Jarvis och en NSF Graduate Research Fellowship utmärkelse till Gustavo Arriaga. Siffror från lämpligt kredit tidigare arbete används under PLoS ONE open access Creative Commons-licens (CC-BY) i enlighet med tidskriftens redaktionella politik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
