Protocol
NOTA: Todas las muestras de los pacientes se obtuvieron con consentimiento informado, y los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por la Universidad de la Junta de Revisión Institucional de Stanford (Protocolo # 2188 y # 9999).
1. Aislamiento de células y Cultura:
- Obtener tejido adiposo subcutáneo humano a partir de pacientes de sexo femenino sanos sometidos a lipoaspiración electiva del abdomen, flanco, y / o la región del muslo bajo anestesia local / general. Asegúrese de que la Junta de Revisión Institucional (IRB) haya obtenido la aprobación para el protocolo de aislamiento de ASC a partir de tejidos humanos, y siga las precauciones de seguridad institucionales mientras se trabaja con este tipo de materiales.
- Para obtener el SVF del tejido adiposo lipoaspirated, primero lavar el lipoaspirado tres veces con volúmenes iguales de 1x solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Aspirar con cuidado y desechar la fase acuosa inferior.
- Preparar el tampón de digestión colagenasa: 0,075% colagenasa tipo I en HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampón FACS: 2% de SFB, el 1% y el 1% P188 Pen-Strep en PBS. Filtra ambas soluciones utilizando un tamaño de poro de flujo rápido del filtro de polietersulfona 0,22 micras disponible en el mercado.
- Para digerir el tejido adiposo lavado, añadir un volumen igual de tampón de digestión con colagenasa y colocar recipiente de digestión de forma segura en un baño de agua en agitación durante 60 min a 37 ° C (aproximadamente 180 batidos / min).
NOTA: Lo mejor es usar un recipiente de digestión volumen más grande de lo necesario, ya que esto permite la digestión máxima durante la agitación (es decir, 250 ml de tampón de digestión con colagenasa, 250 ml de tejido adiposo lavado en un matraz estéril 1L). - Neutralizar la actividad enzimática mediante la adición de un volumen igual de tampón de FACS y permitir sentarse a TA durante 5 min. A continuación, se centrifuga a 233 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el pellet SVF de alta densidad.
- Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de RT rojoTampón de Lisis Celular, basado en el tamaño del pellet. Deje la solución para sentarse a TA durante 5 min y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado mediante la adición de 5-10 ml de medio de crecimiento tradicional, basado en el tamaño de pellet (medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina solución de [pen-strep]).
- Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 100 micras de nylon para eliminar los desechos celulares.
- Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
- Resuspender el precipitado en 5 a 10 ml de medio de cultivo tradicionales, basados en el tamaño de pellets.
- Coloque 2 x 10 6 células en una placa de cultivo de 15 cm estándar y establecer cultivos primarios O / N a 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO 2. Mantener a niveles sub-confluente para prevenir diferenciación espontánea a 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO2 en medio de crecimiento.
La densidad celular en un totalmente: NOTAconfluente placa de 15 cm es de aproximadamente 6.4 x 10 6 células.
2. La tinción
- ASC Cultura en medio de cultivo tradicional a 37 ° C / 21% de O 2, 5% de CO2, durante 36 horas antes de la tinción / clasificación.
- ASC Ascensor de placas de cultivo utilizando Accutase (según el protocolo del fabricante).
- Lave las células una vez con tampón FACS (PBS con FBS al 2% y 1% pen-strep).
- Centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Resuspender las células en 0,5-1 ml de tampón FACS (dependiendo del número de células y la cantidad de anticuerpo deseado).
NOTA: El volumen de la suspensión de células, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante anticuerpo FACS, determina la concentración de anticuerpo. Sin embargo, la valoración de la concentración de anticuerpo, utilizando una concentración de partida de 1: 100, se aconseja por lo general si es la primera vez que utiliza un anticuerpo. - Cuente el número total decélulas utilizando un hemocitómetro.
- Reserva alícuotas de 100 ul de 1,5 ml tubos de centrifugación que se utilizarán para una muestra sin mancha y los controles de un solo color (según el número de anticuerpos fluorescentes usados).
- Añadir los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia-apropiados (en concentraciones predeterminadas, según las instrucciones del fabricante) y se incuba durante 20 a 30 minutos en hielo, protegida de la luz.
- Para etiquetar subpoblación osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) o anti-CD105 (FITC anti-humana CD105 (endoglina)) en tampón FACS a una concentración de 1:50.
- Para etiquetar otras poblaciones de células (por ejemplo, hematopoyéticas y células endoteliales): Diluir anti-CD45 (Anti-CD45 humano Pacific Blue), anti-CD34 (Anti-CD34 humano APC), y / o anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) en tampón FACS a una concentración de 1:50.
- Si no está usando anticuerpos conjugados directamente, utilizar un anticuerpo primario biotinilado con un segundo conjugada con estreptavidina apropiadoary anticuerpo, tal como estreptavidina PE-Cy7, a una dilución de 1: 100.
- Después de la incubación, se lavan las células dos veces: llenar tubos con tampón FACS y se centrifuga a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 400 a 500 muestras l FACS de amortiguación y filtrar a través de un 70 micras filtro de células de nylon para eliminar grupos de células.
- Transferencia de células marcadas en tubos FACS con la parte superior del filtro y mantener las muestras en hielo durante la duración de análisis.
3. Clasificación células activadas por fluorescencia
NOTA: Los siguientes pasos exigen conocimientos previos en células activadas por fluorescencia (FACS) o la ayuda de un técnico especializado.
- Utilizando el software FACS apropiadas, las parcelas de análisis de diseño para examinar dispersión frontal (FSC), la dispersión lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Rojo, Azul Pacífico, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Allophycocyanin (APC) y cualquier otro uso fluoróforod para etiquetar células.
- Antes de cargar en el clasificador de células, vórtice brevemente cada muestra para resuspender las células.
- Comenzar con el análisis de la muestra sin teñir para fijar puertas para la población total de células, para excluir los desechos celulares, y para determinar la autofluorescencia de línea de base.
- Añadir yoduro de propidio (PI) a la muestra sin teñir y analizar con el fin de visualizar la población de células vivas dentro de la población total de células. Construir una puerta alrededor de esta población.
- Analizar una muestra de control de un solo color para cada fluorocromo con el fin de ajustar la compensación de fluorescencia.
- Analizar la muestra teñida para establecer la posición de las puertas para la clasificación.
- Añadir PI a la muestra teñida con el fin de teñir las células muertas.
- Ordena las poblaciones de células marcadas. Ordenar en cualquiera de 1,5 ml tubos de centrífuga o tubos cónicos (15 ml) que contenía medio de cultivo.
- Cesar manualmente la clasificación una vez se ha obtenido la cantidad necesaria de células.
- Nosotrosing FACS, realizar una comprobación de la pureza mediante el análisis de una pequeña fracción (por ejemplo., 500 células) de la población de células adquirida.
NOTA: Este paso confirma la pureza de las poblaciones de células ordenados. Idealmente, la pureza debe ser mayor que el 90-95%. - Centrifugar las células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C inmediatamente después de la finalización de la clasificación y resuspender en 1 ml de medio fresco que contiene 10% de SFB.
NOTA: La cantidad de los medios utilizados se puede aumentar en función del tamaño de la sedimento celular. - Placa en placas recubiertas con gelatina para mejorar la viabilidad celular. Dependiendo del rendimiento celular final, placa 300000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos, 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos.
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Representative Results
El uso de CD90 como un marcador para las células con una mejora de los resultados de la osteogénesis en el aislamiento de una población altamente enriquecido de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC se tiñeron con Pacific Blue-CD45 conjugado anti-humano, conjugado con FITC anti-CD105 humano, y CD90 anti-humano conjugado con APC. Después de la clasificación, el nivel de pureza era mayor que 98%, cuantificada por análisis post-especie.
Definición de grupos de células en base a perfiles de transcripción permitidos para prospectivo aislamiento de dos nuevas subpoblaciones. Para caracterizar el potencial osteogénico de cada subpoblación prometedor (CD90 + CD105 y bajo), así como la de la población no seleccionada in vitro, las células se cultivaron en medio de diferenciación osteogénica durante 14 días, como se describió previamente 6,8,9. Tinción de fosfatasa alcalina (utilizado para la detección temprana de la formación de hueso 10) en el día 7 fue significativamente mayor en el CD90 + (Figura 2A). Esto se observó tanto groseramente y después de la cuantificación (Figura 2A). Del mismo modo, la tinción de rojo de alizarina (un ensayo usado para detectar mineralización de la matriz extracelular y una métrica para terminal final diferenciación osteogénica 9) en el día 14 mostró que CD90 + ASC fueron capaces de mineralizar una cantidad significativamente mayor de la matriz extracelular (Figura 2B). ASC aislados conservan la capacidad de experimentar diferenciación osteogénica después de la clasificación, pero pueden requerir unos días para recuperarse. Es esencial para llevar a cabo todos los experimentos con células más bajas de paso, como ASC se vuelven senescentes durante la propagación de la cultura.
Figura 1: Puertas (A) para el tamaño celular y la complejidad se elaboraron para excluir los desechos celulares y aislar una o poblaciónf células individuales para su posterior análisis. (b) Análisis FACS de CD90 sola ordenados (izquierda) y CD105-único clasificado (a la derecha) ASC 36 horas después de la cosecha ASC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: (A) tinción fosfatasa alcalina (arriba) y cuantificación (abajo) de ASC después de 7 días de cultivo en medio de diferenciación osteogénica (B) tinción de rojo de alizarina (arriba) y la cuantificación de la tinción (abajo) de ASC después de 14 días. de la cultura en medio de diferenciación osteogénica. + ASC CD90 y células CD105 bajas muestran un aumento de la tinción de fosfatasa alcalina y la mineralización de la matriz extracelular en comparación con las células no clasificados (* p <0,05; dos colas estudiante det-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Actualmente, el aislamiento de las subpoblaciones homogéneos de ASC de la SVF de tejido adiposo humano sigue siendo un reto aunque objetivo deseable. El aislamiento de subpoblaciones ASC pro-osteogénicas es particularmente deseable, ya que tales células se pueden utilizar para estudiar la formación y la homeostasis de los tejidos esqueléticos. Sin embargo, el SVF del tejido adiposo alberga heterogeneidad significativa con respecto al vástago capacidad de la célula y el potencial de diferenciación. 11 La base molecular de esta heterogeneidad no se puede entender a partir de poblaciones combinadas de células, y en su lugar requiere el análisis de células individuales. 12 Con este enfoque, los marcadores de superficie estrechamente asociada a la capacidad de diferenciación osteogénica de ASC se puede identificar.
El factor más crítico para el enriquecimiento exitoso de ASC, como se describe en el método anterior, está relacionado con los anticuerpos utilizados para FACS. Uno debe ser prudente seleccionar un anticuerpo con una alta afinidad por el cell-marcador de superficie en cuestión. Idealmente, debería ser un anticuerpo conjugado primaria en oposición a un método de tinción indirecta, que requiere múltiples etapas y, por tanto, mayor probabilidad de muerte celular, la pérdida de células y de acumulación de error. Además, las modificaciones menores durante FACS pueden aumentar la viabilidad celular. Estos incluyen la clasificación en un receptáculo fresco, mantener las células en hielo en todo momento, la clasificación de células en los receptáculos que contienen medios de cultivo y también, en placas de las poblaciones de células adquiridas en placas de cultivo que han sido pre-recubiertas con 10% de gelatina. Es importante realizar un análisis de pureza post-especie, a fin de garantizar la pureza de las células clasificadas.
Esta técnica está limitada por la disponibilidad de equipo y la experiencia FACS dentro de una instalación. Además, como las muestras primarias son heterogéneos, la expresión de marcadores de superficie va a cambiar sobre una base individual. Como se ha mencionado, es esencial para llevar a cabo todos los experimentos con células de paso bajo, como ASCs se vuelven senescentes durante la propagación de la cultura. Además, se sabe que las ASC exhiben un cambio en la expresión fenotípica bajo condiciones in vitro que pueden alterar la biología de células madre. Por lo tanto, para la traducción clínica, sería óptimo para obtener una población de células altamente purificada para el trasplante directo o la siembra de células a un andamio sin la necesidad para el cultivo in vitro. Además, los grandes volúmenes de lipoaspirado que deben ser procesados para aislar el SVF puede ser una carga para quienes no están familiarizados con la técnica, como se discutió y dirigida por Zuk y sus colegas en una publicación reciente 13. De acuerdo con el método descrito por Zuk et al., Este protocolo se puede escalar fácilmente arriba o hacia abajo para acomodar el volumen de lipoaspirado y se puede adaptar para aislar ASC a partir de tejido de grasa obtenida a través de abdominoplastías y otros procedimientos similares.
CD90 y CD105 han sido previamente identificado como principios madre mesenquimales cmarcadores ell, tanto en BM-MSC y poblaciones ASC. En consonancia con la investigación anterior, el CD90 + población representaron aproximadamente el 50% de la SVF recién aisladas. 14 En contraste, sólo alrededor del 5-10% de la inicial SVF expresa CD105. 6 Cabe destacar que, con pasajes sucesivos, la expresión de CD105 aumentó rápidamente de casi cero a la expresión casi omnipresente después de 4-7 días de cultivo. Se sabe que las ASC exhiben considerable deriva fenotípica durante la expansión in vitro, que puede alterar la biología de las células madre. 15-17 Idealmente, las aplicaciones clínicas de las células madre implicaría el uso inmediato de las poblaciones de células purificadas para el trasplante o siembra directa sobre un andamio , sin la necesidad para el cultivo in vitro. El porcentaje de células CD90 + puede variar entre diferentes muestras lipoaspirado en un origen depósito dependiente de grasa o de manera dependiente de la edad. Sin embargo, el uso de CD90 como un marcador de superficie celular permite o enriquecimientofa subpoblación de ASC humanos con potencial osteogénico mejorado. Este método de enriquecimiento osteogénica tiene el potencial de servir como un medio novedoso para la promoción de la formación rápida y robusta ósea en pacientes con defectos esqueléticos-críticos de tamaño. Rutinariamente Observamos que el rendimiento celular aproximada de lipoaspirado estándar es de 5 x 10 7 células nucleadas / 500 ml de lipoaspirado utilizando el método de la cosecha anterior, aunque como se ha descrito anteriormente esto puede variar en función del origen depósito de grasa o datos demográficos del paciente. 18 Yoshimura y sus colegas informaron que ASC representan el 10-35% de la población de células nucleadas en la SVF. 19 Por lo tanto, existe un gran potencial para la siembra directa de un andamio para la implementación de estrategias de ingeniería de tejido óseo después del enriquecimiento osteogénica de ASC utilizando FACS.
Stem la ingeniería de tejidos a base de células para aplicaciones experimentales y clínicas a menudo requiere poblaciones de células altamente purificadas. Otro hiExisten métodos gh rendimiento de purificación como alternativas más simples a FACS, incluyen la panorámica, el agotamiento del complemento, y magnético de células activadas por la clasificación (MACS). Sin embargo, en ciertas situaciones, FACS es necesario y ventajoso: cuando se desea el aislamiento de subpoblaciones de alta pureza, cuando el marcador de la superficie de destino se produce con poca frecuencia en la población de células, o cuando se deben separar las células basa en diferentes niveles de expresión de la misma superficie marcador.
El uso de ambos análisis de células individuales a base de microfluidos de la transcripción y de fluorescencia de clasificación de células activadas, endoglina (CD105) y Thy-1 (CD90) se encontró asociado con diferencias en la expresión de genes ASC osteogénicas. El análisis estadístico de los perfiles de transcripción unicelulares demostró que la baja expresión de CD105 y alta expresión de CD90 describir subgrupos de ASC con mayor capacidad osteogénica. Estas proteínas fueron posteriormente utilizados para enriquecer para las subpoblaciones de células osteogénicas derived del tejido adiposo subcutáneo humano. 6,20
En conjunto, estos datos ilustran la eficacia de la clasificación ASC basado en marcadores específicos de la superficie celular que se correlacionan con la actividad transcripcional osteogénico. Aunque la viabilidad de este enfoque se muestra aquí mediante el uso de CD90 y CD105 como ejemplos, un análisis más detallado que hay que hacer para incluir todas las combinaciones prometedoras de la superficie de la expresión del antígeno que se correlacionan altamente con la actividad transcripcional osteogénico.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene un interés financiero en cualquiera de los productos, dispositivos o medicamentos mencionados en este manuscrito. Ninguno de los autores tiene ningún interés financiero en competencia reportar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE021683-01 y los Institutos Nacionales de Salud de Investigación de subvención R01-DE019434 a MTL; Instituto Médico Howard Hughes de Becas de Investigación para MTCDCW fue apoyado por la AEC Franklin Martin Facultad de Becas de Investigación, El Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa, y el Premio Académico Facultad Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
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