Protocol
अध्ययन अनुमोदन: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय (रोम, इटली) Decreto के अनुसार द्वारा अनुमोदित किया गया 27 Gennaio 1992 legislativo, एन। 116 "Attuazione डेला Direttiva एन। 86/609 / CEE में मटेरिया di protezione Degli Animali utilizzati एक Fini sperimentali ओ विज्ञापन altri Fini scientifici।"
1. त्वचा नमूने प्राप्त करने के
- ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanize।
- कान:
- माउस के कान का गंजा हिस्सा काट।
- अलग पृष्ठीय और उन्हें संदंश के साथ अलग खींच द्वारा उदर की ओर। धीरे संदंश के साथ कान के भीतरी भाग scraping द्वारा किसी भी शेष उपास्थि निकालें।
- ट्रंक त्वचा:
- दोनों एक बिजली के रेजर के साथ और नाजुक लोमनाशक लोशन के साथ पशु की पूरी त्वचा दाढ़ी।
- वांछित त्वचा नमूना (पूरे पशुओं की त्वचा के लिए ऊपर 2 सेमी 2) से काट दिया।
- पूरे पृष्ठीय काटने से तो और उपक्रमत्राल माउस त्वचा, माउस पीठ और फिर माउस शरीर के चारों ओर मुंडा क्षेत्रों की सीमाओं के साथ काटा के बीच में एक खड़ी काट कर।
- धीरे पेरिटोनियम और पीठ की मांसपेशियों से त्वचा को अलग, संदंश के साथ अभी भी त्वचा नमूना रखते हुए एक शल्य कैंची या एक छुरी की धार को बंद कर दिया दौर सुझावों के साथ त्वचा नमूना अलग।
- एक 100 मिमी सेल संस्कृति बर्फ के ठंडे पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त थाली तैयार करें।
- कदम 1.3.3 में तैयार की थाली में पीबीएस में त्वचा नमूना डूब गए और संदंश के साथ त्वचा नमूना scraping द्वारा वसा को हटा दें।
- पूंछ:
- माउस की पूंछ काट दिया।
- एक शल्य कैंची या छुरी शल्य चिकित्सा, पूंछ आधार से शुरू और पूंछ की नोक पर पहुंचने के साथ पूंछ पर एक खड़ी कटौती करें।
- पूंछ से त्वचा को अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। पूंछ के आधार पर कटौती की बढ़त ले लो और धीरे टिप की ओर खींच जबकि पकड़ेसंदंश के साथ पूंछ के शरीर।
- धीरे त्वचा नमूना scraping द्वारा किसी भी अतिरिक्त चर्बी हटाने।
- लुटेरा
- शल्य कैंची के साथ पूरे माउस पैर बाहर कट। किसी भी बालों त्वचा को काटने से बचना।
- अंकों की शुरुआत करने के लिए टखने से longitudinally पैर की त्वचा कट।
- संदंश के साथ या हाथ से जबकि संदंश के साथ त्वचा हथियाने टखने की हड्डियों पकड़ो और के रूप में अगर एक दस्ताना दूर ले जा रही अंक की ओर त्वचा खींच।
2. पाचन
- एंजाइम मिश्रण (देखें सामग्री विनिर्देशों के लिए सूची) 300 माइक्रोग्राम / एमएल, DNAse1 50 यू / एमएल: निम्नलिखित नुस्खा के साथ शेयर समाधान (सामग्री सूची में के रूप में तैयार) से पाचन कॉकटेल तैयार करें। RPMI 5% FBS में पतला।
- पाचन कॉकटेल के 2 मिलीलीटर के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश में छोटे टुकड़ों में कैंची के साथ त्वचा के नमूने जल्द (ट्रंक त्वचा के लिए: त्वचा के 2 पाचन कॉकटेल मिलीलीटर हर 2 सेमी 2, अप करने के लिए 3 मिलीग्राम कुल)।
- 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। धीरे ऊष्मायन के दौरान पेट्री डिश 1-2 बार हिला।
- 66 मिमी पेट्री RPMI1640 5% FBS के 1 मिलीलीटर युक्त पकवान में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी पर पचा त्वचा के नमूनों डालो।
- RPMI 1640 5% FBS के 5 मिलीलीटर के साथ झरनी धो लें।
- एक सिरिंज सवार के साथ सेल झरनी के माध्यम से नमूना निचोड़।
- फ्लश सवार, पेट्री डिश और RPMI1640 5% FBS की 20 मिलीलीटर के साथ झरनी, 50 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण।
3. एंटीबॉडी और लेबलिंग
- प्राप्त निलंबन पीबीएस 1% FBS (या बीएसए) के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।
- वांछित एंटीबॉडी के साथ प्राप्त सेल निलंबन लेबल।
- 100 μl में नमूने Resuspend / पीबीएस 1% FBS में पतला एक मिश्रण aCD16 / CD32 (क्लोन 2.4G2) के 2 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त का नमूना।
- गैर विशिष्ट एफसी रिसेप्टर्स के माध्यम से वांछित एंटीबॉडी के बंधन को ब्लॉक करने के क्रम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
- तालिका में संकेत दिया एंटीबॉडी जोड़ें1।
- एक मिश्रण 4 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में पीबीएस 1% FBS के 100 μl / नमूना में वांछित एंटीबॉडी गिराए तैयार करें।
- प्रत्येक नमूने के लिए कदम 3.2.3.1 में तैयार इतना है कि ट्यूब में, वहाँ 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में एंटीबॉडी मिश्रण के 200 μl की एक मात्रा होगी मिश्रण के 100 μl जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और प्रकाश से कवर किया।
- 400 XG पर 5 मिनट के लिए पीबीएस 1% FBS के 1 मिलीलीटर, सेंट्रीफ्यूज के साथ धोने, तैरनेवाला और पीबीएस 1% FBS के 300 μl में resuspend त्यागें।
- DAPI 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 10 मिनट के लिए प्रकाश से रक्षा की।
- नमूने FACS द्वारा प्राप्त विश्लेषण।
- आदेश ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए, निम्नलिखित gating रणनीति का उपयोग करें:
- सबसे पहले DAPI- आबादी पर gating द्वारा किसी भी मृत कोशिकाओं को खत्म।
- एफएससी-ए बनाम एफएससी डब्ल्यू साजिश में singlets चयन चित्रा 1 में संकेत के रूप में
- गेट कोशिकाओं के आकार और विघटन ब्याज की ल्यूकोसाइट्स की खासियत पर आधारित है।
- चित्र 1 में संकेत दिया एफएससी-ए CD45 साजिश में CD45 + कोशिकाओं का चयन करें।
- इस प्रकार के रूप में सतह मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा ल्यूकोसाइट्स के विभिन्न आबादी भेद:
- डीसी CD11c + एमएचसी द्वितीय + कोशिकाओं के रूप में पहचानें। बाद में इन CD207 की अभिव्यक्ति CD207- चमड़े का डीसी से Langerhans कोशिकाओं और CD207 + चमड़े का डीसी भेद करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।
- मैक्रोफेज CD64 + F4 / 80 + कोशिकाओं के रूप में पहचानें।
- CD19 + MHCII + कोशिकाओं के रूप में बी कोशिकाओं को पहचानें।
- के रूप में सीडी 8 + या सीडी 4+ टी कोशिकाओं कोशिकाओं को पहचानें।
- आदेश ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए, निम्नलिखित gating रणनीति का उपयोग करें:
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Representative Results
शरीर के विभिन्न क्षेत्र से त्वचा प्रोटोकॉल का वर्णन किया और संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ दाग के अनुसार पचा गया था। Gating रणनीति चित्र 1 में दिखाया गया है पहले singlets (एफएससी-ए बनाम FSC डब्ल्यू) पर और लिम्फोसाइट आकृति विज्ञान (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) के साथ कोशिकाओं पर जीवित कोशिकाओं (DAPI- कोशिकाओं), तो गेट का चयन करें। जब संकेत दिया है, hematopoietic मूल से CD45 + कोशिकाओं चुने गए हैं।
डीसी विरोधी CD11c, -MHCII, और -CD45 एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं, मैक्रोफेज के रूप में पहचाने जाते हैं F4 / 80 + CD64 + CD45 + कोशिकाओं, के रूप में CD19 + CD45 + MHCII + कोशिकाओं बी कोशिकाओं, के रूप में सीडी 4 + CD45 सीडी 4+ टी lymphocytes + कोशिकाओं, और सीडी 8 + CD45 + कोशिकाओं के रूप में सीडी 8 + टी lymphocytes (चित्रा 2)।
इस विधि गुजरातarantees त्वचा है कि विश्लेषण कर रहे हैं (चित्रा 3 ए) के सभी क्षेत्रों में कुल व्यवहार्य कोशिकाओं (DAPI-) की 50% से अधिक के साथ पचा आबादी के उच्च व्यवहार्यता। CD45 + कोशिकाओं की संख्या का एक संकेत 2 सेमी चित्रा 3 बी में दिखाया गया है प्रति उपज।
माउस त्वचा की 1 सेमी 2 के पाचन से प्राप्य डीसी, मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं और सीडी 4+ या सीडी 8 + टी कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान चित्रा -3 सी में संकेत दिया है।
चित्रा 1. त्वचा एकल कोशिका निलंबन हीमैटोपोयटिक मूल की कोशिकाओं की पहचान। एकल कोशिका निलंबन DAPI और विरोधी CD45 एंटीबॉडी के साथ दाग दिया है। जीवित कोशिकाओं के बीच (DAPI नकारात्मक), singlets (एफएससी-ए बनाम FSC-एच) ल्युकोसैट साथ कक्षों का चयन करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं आकृति विज्ञान (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए)। Hematopoietic मूल के कोशिकाओं के रूप में CD45 + पहचाने जाते हैं।
चित्र 1 में संकेत दिया माउस त्वचा में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं विभिन्न क्षेत्रों से प्राप्त की चित्रा 2. विश्लेषण। प्रकोष्ठों gated हैं। DCs CD11c + एमएचसी द्वितीय + CD45 + कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं और बाद में Langerhans कोशिकाओं और CD207 भेद करने के लिए CD207 के साथ दाग + CD207 से त्वचीय DCS -; मैक्रोफेज CD64 + F4 / 80 + CD45 + कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं; टी lymphocytes सीडी 8 + CD45 + कोशिकाओं और सीडी 4 + CD45 + कोशिकाओं में विभाजित कर रहे हैं; बी कोशिकाओं MHCII + CD19 + CD45 + कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं। प्रतिशत कुल CD45 + कोशिकाओं के लिए भेजा जाता है।
चित्रा 3. विभिन्न क्षेत्रों से माउस त्वचा में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण (ए) व्यवहार्य का प्रतिशत। (DAPI -) कोशिकाओं माउस त्वचा का संकेत दिया क्षेत्रों से निकाली गई। (बी) निरपेक्ष संख्या CD45 + माउस त्वचा के विभिन्न क्षेत्रों में कोशिकाओं त्वचा के 2 सेमी प्रति कोशिकाओं की संख्या में व्यक्त किया। (सी) डीसी, MΦ, बी कोशिकाओं और सीडी 4+ या सीडी 8 + टी कोशिकाओं माउस त्वचा का संकेत दिया क्षेत्रों से त्वचा की 1 सेमी 2 से प्राप्त अनुमान संख्या।
| एंटीबॉडी | धुंधला हो जाना | एकाग्रता | पहर | तापमान |
| डीसीमिश्रण | ||||
| CD11c | पीई Cy7 | 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 30 मिनट | 4 डिग्री सेल्सियस |
| एमएचसी द्वितीय | पीई | " | " | " |
| CD45 | पीई Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | एपीसी | " | " | " |
| मैक्रोफेज मिक्स | ||||
| F4 / 80 | एपीसी-Cy7 | 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 30 मिनट | 4 डिग्री सेल्सियस |
| एमएचसी द्वितीय | पीई | " | " | " |
| CD45 | पीई Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | पीई Cy7 | " | " | " |
| टी और बी कोशिकाओं मिश्रण | पीई | 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | 30 मिनट | 4 डिग्री सेल्सियस |
| सीडी 4 | एपीसी-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | एपीसी | " | " | " |
| CD45 | पीई Cy5.5 | " | " | " |
तालिका 1. त्वचा populating प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के धुंधला के लिए संकेत। तीन घोला जा सकता है DCs, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों के धुंधला के लिए संकेत कर रहे हैं।
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Discussion
हम अलग अलग माउस त्वचा क्षेत्रों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन किया है। पाचन हम अपनाया है की विधि, न केवल उच्च पैदावार देता है, लेकिन यह भी सतह मार्कर की अभिव्यक्ति है, जो बाद में FACS विश्लेषण के लिए मौलिक है बरकरार रखता है।
कोलैजिनेज़ मैं और द्वितीय और thermolysin के एक कॉकटेल का उपयोग करते हैं, इस विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने एंजाइम गतिविधि में बैच मतभेद के न्यूनतम बैच की गारंटी देता है। अन्य प्रकाशित तरीकों अलग एंजाइम कॉकटेल पर भरोसा करते हैं, लेकिन हमारे हाथ में वे कम पैदावार और अधिक महत्वपूर्ण बात, कम प्रतिलिपि प्रस्तुत कर रहे हैं। हमारे विधि, तथापि, और एपिडर्मिस populating कोशिकाओं डर्मिस populating कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं करता है। चूंकि कई मामलों में यह इन दो अलग अलग डिब्बों के बीच भेद करने के लिए उपयोगी हो सकता है, हम इन पिछले काम करता है कि इस तरह के तरीकों का उपयोग करने के लिए पाठक को निर्देशित। 15
हमारे अनुभव त्वचा नमूने मेंकान और पूंछ से ट्रंक त्वचा जहां चमड़े के नीचे तेल की परत अच्छी तरह से आदेश डर्मिस एंजाइम कॉकटेल के लिए सुलभ बनाने के लिए स्क्रैप हो गया है की तुलना में पचाने के लिए आसान कर रहे हैं। de-चिकनाई कदम है, हालांकि के रूप में अच्छी तरह से काटने के क्रम में सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए जल्दी से और धीरे से किया जाना चाहिए। एक लंबे समय तक या भी पूरी तरह से degreasing कदम त्वचा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं निवासी को नुकसान में परिणाम कर सकते हैं और इसलिए बहुत कम उपज में परिणाम और बरामद कोशिकाओं की व्यवहार्यता की कमी हुई।
यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सतह मार्कर की अखंडता की रक्षा करने के लिए, पाचन ऐसे β-mercaptoethanol के रूप में एजेंटों को कम करने का एक माध्यम विहीन में किया जाना चाहिए। मार्कर की सतह के लिए अवांछित नुकसान से बचने के लिए, ऊष्मायन समय किसी भी घटना में संभव के रूप में छोटे और, के रूप में रखा जाना चाहिए, अधिक से अधिक 90 मिनट के लिए लंबे समय तक नहीं।
विशेष देखभाल की जानी है, यह भी लिया जाना चाहिए जब सेल में पच त्वचा के नमूनों डालने का कार्यझरनी। यह अच्छी तरह से आदेश सिरिंज सवार के साथ पचा नमूना मुंहतोड़ से पहले मुक्त कोशिकाओं दूर धोने के लिए में पच त्वचा को धोने के लिए महत्वपूर्ण है। इस कदम के साथ त्वचा नमूना मुक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि तब किसी भी अधिक शारीरिक तनाव से गुजरना नहीं है से धोया जाता है। मुंहतोड़ भी आदेश में किसी भी कोशिकाओं को मारने के लिए और दोनों सेल झरनी और सिरिंज सवार को अच्छी तरह से बाद में धोने कदम में धोया जाना चाहिए नहीं में धीरे किया जाना चाहिए।
त्वचा पाचन भी 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में एक 50 मिलीलीटर बाज़ में प्रदर्शन किया जा सकता है। इस मामले में त्वचा पहले से कटा हुआ जा सकता है और उसके बाद फाल्कन ट्यूब में डाल दिया। ध्यान दें कि त्वचा के नमूनों हमेशा ऊष्मायन के दौरान पाचन बफर में डूबे हुए किया जाना चाहिए और उस कान-टुकड़े फाल्कन ट्यूबों के पक्ष से चिपके रहते हैं। फाल्कन ट्यूबों का उपयोग करते हैं, इसलिए, सुनिश्चित करें कटा त्वचा रहने के टुकड़े पाचन माध्यम में डूबे हुए हैं।
इस विधि एमए में उपयोगी हो सकता हैएनवाई विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग है, खासकर जब गैर सूजन त्वचा का अध्ययन। सूजन के दौरान, वैसोडायलेटेशन और ऊतकों में सूजन ढीला ऊतक और रक्त से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना को बड़े पैमाने पर त्वचा के लिए भर्ती कर रहे हैं। सेल वसूली की दक्षता, इस प्रकार, बहुत अधिक है। होमियोस्टैटिक परिस्थितियों में, डर्मिस की तंग कोलेजन मैट्रिक्स को पचाने के लिए एक कारगर तरीका है, वास्तव में, आदेश प्रतिरक्षा सेल जटिल त्वचा populating नेटवर्क के गठन को ठीक करने की जरूरत है।
पाठक भी एक व्यापक समीक्षा की है कि मूल और विभिन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं और दोनों होमियोस्टैटिक और भड़काऊ शर्तों में त्वचा populating मैक्रोफेज के phenotype कवर में रुचि हो सकती है। 16
विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में, माउस त्वचा के विभिन्न भागों में इलाज किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, त्वचा प्रत्यारोपण के मॉडल में, पूंछ के एक हिस्से को एक प्राप्त जानवर के ट्रंक पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है; जब पढ़ाईजी शोफ गठन या टीकाकरण प्रक्रियाओं, उत्तेजनाओं अक्सर, चूहों का लुटेरा पर इंजेक्ट किया जाता है, जबकि कान अक्सर डीटीएच assays के साथ टी सेल स्मृति का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हमारे विधि के साथ हम कुशलता से अलग पसंद के प्रयोगात्मक स्थापित करने के लिए हमारे विधि उपयोगी बनाने स्थानों से त्वचा निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं निकाल सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
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