Protocol
Studie godkännande: De experimentella protokoll godkändes av det italienska hälsoministeriet (Rom, Italien) enligt lagdekret 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609 / EEG in materia di Protezione degli animali utilizzati en fini sperimentali o ad altri fini scientifici."
1. Skaffa hudprover
- Avliva musen genom cervikal dislokation.
- Öra:
- Klipp ut den hårlösa delen av öronen på musen.
- Separat rygg och buksidan genom att dra isär dem med pincett. Avlägsna eventuella kvarvarande brosk genom att försiktigt skrapa den inre delen av öronen med pincett.
- Bålhuden:
- Raka hela huden på djuret både med en elektrisk rakapparat och med fina hårborttagnings lotion.
- Skär av den önskade hudprov (från 2 cm 2 upp till hela djurhud).
- Om skära av hela rygg och ventral mushud, göra ett vertikalt snitt i mitten av musen tillbaka och sedan skärs längs gränserna för rakade områden runt musen kroppen.
- Försiktigt separera huden från bukhinnan och ryggmusklerna, hålla hudprov fortfarande med pincetten medan separera prov huden med slutna runda kanter tips av en kirurgisk sax eller en skalpell.
- Bered en 100 mm cellkulturplatta innehållande 10 ml iskall PBS.
- Eliminera underhudsfett genom att sänka prov huden i PBS i plattan som framställts i steg 1.3.3 och skrapa provet huden med pincett.
- Svans:
- Skär av svansen på musen.
- Göra ett vertikalt snitt på svansen med en kirurgisk sax eller kirurgisk skalpell, med början från svansen bas och når till spetsen av svansen.
- Använd pincett för att ta bort huden från svansen. Ta tag i kanten av den skurna vid basen av svansen och dra lätt mot spetsen medan du hållerkropp av svansen med pincett.
- Ta bort överflödigt fett genom att försiktigt skrapa hudprov.
- trampdynan
- Klipp ut hela mus fot med kirurgisk sax. Undvika att skära någon hårig hud.
- Skära in i huden av foten i längdriktningen från ankeln till början av siffrorna.
- Håll ankel ben med pincett eller för hand medan att ta tag i huden med pincett och dra huden mot siffrorna som om att ta bort en handske.
2. Digestion
- Förbered matsmältningen cocktail från stamlösning (framställd som i Materials List) med följande recept: Enzyme mix (se Materials List för specifikationer) 300 pg / ml, DNAse1 50 U / ml. Späd i RPMI 5% FBS.
- Hacka hudprover med sax i små bitar i en 35 mm petriskål med 2 ml Uppslutning Cocktail (För bålhuden: 2 ml Uppslutning Cocktail varje 2 cm 2 av huden, totalt upp till 3 ml).
- Inkubera vid 37 ° C under 90 min. Skaka försiktigt petriskål 1-2 gånger under inkubation.
- Pour spjälkade hudprover på en 70 | im cellfilter i 66 mm petriskål med 1 ml av RPMI1640 5% FBS.
- Tvätta silen med 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
- Pressa provet genom cellfilter med en sprutkolv.
- Flush kolv, petriskål och sil med 20 ml RPMI1640 5% FBS, överför till 50 ml rör.
3. Antikroppar och märkning
- Tvätta den erhållna suspensionen två gånger med 5 ml PBS 1% FBS (eller BSA).
- Märka den erhållna cellsuspensionen med de önskade antikropparna.
- Resuspendera proverna i 100 | il / prov av en blandning innehållande 2 ^ g / ml av aCD16 / CD32 (klon 2.4G2) utspädd i PBS 1% FBS.
- Inkubera i 15 min vid 4 ° C för att blockera icke-specifik bindning av de önskade antikropparna via Fc-receptorer.
- Lägg antikropparna anges i tabell1.
- Förbereda en blandning späda de önskade antikropparna i 100 | il / prov av PBS 1% FBS vid en koncentration av 4 ug / ml.
- Tillsätt 100 | il av blandningen som framställts i steg 3.2.3.1 till varje prov, så att i röret, kommer det att finnas en volym av 200 | il av antikroppblandningen vid en slutlig koncentration av 2 | ig / ml.
- Inkubera i 30 min vid 4 ° C och täcka från ljus.
- Tvätta med 1 ml PBS 1% FBS, centrifugera under 5 minuter vid 400 xg, kassera supernatanten och återsuspendera i 300 fil PBS 1% FBS.
- Lägga DAPI vid en slutlig koncentration av 2 | ig / ml och inkubera vid 4 ° C, skyddade från ljus under 10 min.
- Analysera de prov som erhålls med FACS.
- För att isolera leukocyter använd följande grindstrategin:
- Först eliminera eventuella döda celler genom grind på DAPI- befolkningen.
- Välj sing i FSC-A mot FSC-W tomt som anges i figur 1
- Gate cellerna baserat på storlek och granularitet typiska för leukocyter av intresse.
- Väljer CD45 + celler i FSC-A CD45 plot såsom anges i figur 1.
- Särskilja de olika populationer av leukocyter genom uttryck av ytmarkörer på följande sätt:
- Identifiera DC: er som CD11c + MHC II + -celler. Dessa kan senare analyseras för uttryck av CD207 att skilja Langerhans-celler och CD207 + Dermal DCs från CD207- Dermal DCs.
- Identifiera makrofager som CD64 + F4 / 80 + celler.
- Identifiera B-celler som CD19 + MHCII + celler.
- Identifiera T-celler som CD8 + eller CD4 + celler.
- För att isolera leukocyter använd följande grindstrategin:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hud från annan region av kroppen digererades i enlighet med det protokoll som beskrivits och färgades med de angivna antikropparna. Grind strategi visas i Figur 1. Välj först levande celler (DAPI- celler), sedan grind på sing (FSC-A mot FSC-W) och på celler med lymfocyter morfologi (FSC-A mot SSC-A). När anges, CD45 + celler från hematopoietiskt ursprung vald.
DCs är märkta med anti-CD11c, -MHCII och -CD45 antikroppar, makrofager identifierats som F4 / 80 + CD64 + CD45 + celler, B-celler som CD19 + CD45 + MHCII + celler, CD4 + T-lymfocyter som CD4 + CD45 + celler och CD8 + T-lymfocyter som CD8 + CD45 + celler (Figur 2).
Denna metod guarantees hög viabilitet av den digererade populationen med mer än 50% av de totala livsdugliga celler (DAPI-) i alla regioner i huden som analyseras (figur 3A). En indikation på antalet CD45 + celler ger per cm 2 visas i figur 3B.
En uppskattning av det totala antalet DCs, Makrofager, B-celler och CD4 + eller CD8 + T-celler som kan erhållas från matsmältningen av en cm 2 av mushud indikeras i fig 3C.
Figur 1. Identifiering av celler av hematopoietiskt ursprung i hudens encelliga suspensioner. Single-cellsuspensioner har färgades med DAPI och anti-CD45-antikropp. Bland levande celler (DAPI-negativ), sing (FSC-A vs FSC-H) analyseras för att välja celler med leukocyter morfologi (FSC-A mot SSC-A). Celler av hematopoetiskt ursprung identifieras som CD45 +.
Figur 2. Analys av immunceller som föreligger i mushud härledda från olika regioner. Celler gated såsom anges i figur 1. DCs identifieras som CD11c + MHC II + CD45 + celler och senare färgades med CD207 att skilja Langerhans-celler och CD207 + dermal DC från CD207 -; Makrofager identifieras som CD64 + F4 / 80 + CD45 + celler; T-lymfocyter är uppdelade i CD8 + CD45 + celler och CD4 + CD45 + celler; B-celler identifieras som MHCII + CD19 + CD45 + celler. Procentsatser hänvisas till den totala CD45 + celler.
Figur 3. Kvantitativ analys av de immunceller som föreligger i mushud från olika regioner (A) Procent av livskraftiga. (DAPI -) celler som härrör från de angivna områdena i mushud. (B) absoluta tal CD45 + celler i de olika regionerna i mushud uttryckt i antal celler per cm 2 av huden. (C) Värdering antal utvecklingsländer, M O, B-celler och CD4 + eller CD8 + T-celler som härrör från en cm 2 av huden från de angivna områdena i mushud.
| Antikropp | färgning | Koncentration | Tid | Temperatur |
| DCsBlanda | ||||
| CD11c | PE-Cy7 | 2 | ig / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD207 | APC | " | " | " |
| Makrofager Mix | ||||
| F4 / 80 | APC-Cy7 | 2 | ig / ml | 30 min | 4 ° C |
| MHC II | PE | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
| CD64 | PE-Cy7 | " | " | " |
| T- och B-celler Blanda | PE | 2 | ig / ml | 30 min | 4 ° C |
| CD4 | APC-Cy7 | " | " | " |
| CD19 | APC | " | " | " |
| CD45 | PE-Cy5.5 | " | " | " |
Tabell 1. Indikationer för färgning av olika populationer av immunceller befolka huden. Tre blandningar indikeras för färgning av DC, makrofager och lymfocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett förfarande för framställning av single-cellsuspensioner från olika mushud regioner. Metoden för matsmältningen vi har antagit, inte bara ger hög avkastning, men bevarar också ett uttryck för ytmarkörer, som är grundläggande för den efterföljande FACS-analys.
Användning av en cocktail av kollagenas I och II och termolysin, garanterar minimal sats till sats skillnader i enzymaktivitet vilket gör denna metod mycket reproducerbar. Andra publicerade metoder förlitar sig på olika enzym drinkar men i våra händer de ger lägre utbyten och, ännu viktigare, är mindre reproducerbara. Vår metod är emellertid inte diskriminerar mellan celler befolka epidermis och celler befolka dermis. Eftersom det i många fall kan det vara lämpligt att skilja mellan dessa två olika avdelningar, hänvisar vi läsaren att dessa tidigare verk som använder sådana metoder. 15
I vår erfarenhet hudprovs från örat och svans är lättare att smälta än stammen huden där den subkutana fettskiktet måste noggrant skrapas för att göra dermis tillgängliga för enzymet cocktail. Den de-smörjning steg, fast såväl som skär bör utföras snabbt och försiktigt för att bibehålla cellernas livskraft. En långvarig eller alltför noggrann rengöring steg kan leda till skador på immunceller som är bosatta i huden och därför resultera i betydligt lägre avkastning och minskad livskraft utvunna cellerna.
Det bör också noteras att för att bevara integriteten av ytmarkörer, bör uppslutnings utföras i ett medium som saknar reduktionsmedel såsom β-merkaptoetanol. För att undvika oönskad skada på ytmarkörer, bör inkubationstiden hållas så kortare som möjligt och, i alla händelser, inte förlängas under mer än 90 min.
Särskild försiktighet bör, även tas när häller de spjälkade hudprover i cellensil. Det är viktigt att tvätta den digere huden för att tvätta bort de frigjorda cellerna innan krossa det kokade provet med sprutkolven. Med det här steget hudprovet tvättas från de befriade immunceller som sedan inte genomgår någon mer fysisk stress. Krossandet bör också göras försiktigt för att inte döda eventuella celler och både cellfilter och sprutkolven bör tvättas noggrant i det efterföljande tvättsteget.
Hud matsmältningen kan även utföras i ett 50 ml Falcon i ett vattenbad vid 37 ° C. I detta fall huden kan hackas i förväg och läggs sedan i Falcon rör. Notera att de hudprover alltid ska vara nedsänkt i digereringsbuffert under inkubationen, och att öronstycken fastnar på sidorna av Falcon-rör. Vid användning av Falcon rör därför se till att bitar av hackad hud vistelse nedsänkt i matsmältningen mediet.
Denna metod kan vara användbara i maNY olika experimentella inställningar, särskilt när man studerar icke-inflammerad hud. Under inflammation, vasodilation och vävnadssvullnad lossa strukturen hos vävnaden och immunceller från blod är massivt rekryteras till huden. Effektiviteten i cellutvinning är sålunda mycket högre. I homeostatiska förhållanden, ett effektivt sätt att smälta den snäva kollagenmatrisen av dermis är i själva verket, som behövs för att återställa immunceller som utgör den komplexa nätverk befolka huden.
Läsaren kan också vara intresserad av en omfattande översyn som täcker ursprung och fenotypen av olika dendritiska celler och makrofager befolka huden i både homeostatiska och inflammatoriska tillstånd. 16
I olika experimentella inställningar, kan olika delar av mushud behandlas. Till exempel, i huden transplantationsmodeller, varvid en del av svansen skulle kunna transplanteras på stammen av en mottagande djuret; när studying ödembildning eller immuniseringsförfaranden är stimuli ofta injiceras på trampdynan hos möss, medan örat ofta används för att bedöma T-cellsminne med analyser DTH. Med vår metod kan vi effektivt extrahera huden bosatta immunceller från olika platser gör vår metod användbar för experimentella val.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Supplemented RPMI 1640 medium | RPMI1640 supplemented w/ L-glu, pen-strep w/o beta mercapto ethanol | ||
| PBS | |||
| FBS | |||
| Liberase TM (Enzyme Mix) | Roche | 5401119001 | resuspend [2.5 mg/ml] in dH2O; store aliquots at -20 °C |
| Dnase I | Sigma | D4263-1VL | resuspend in RPMI 1640 w/o serum [1,000 U/ml] |
| Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forceps | |||
| Surgical Scalpel | |||
| 35 mm Petri dishes | |||
| 66 mm Petri dishes | |||
| 100 mm Petri dishes | |||
| 70 µm Cell Strainers | BD | 352350 | |
| Digestion cocktail | Dilute in RPMI 5% FBS | ||
| LIberase TM | 300 µg/ml | ||
| DNAse1 | 50 U/ml | ||
| Antibodies | |||
| Name | Company | Clone | Label |
| aCD45.2 | 104 | PE-Cy5.5 | |
| aCD11c | N418 | PE-Cy7 | |
| CD11b | M1/70 | FITC | |
| F4/80 | A 3-1 | APC-Cy7 | |
| aCD4 | Gk1.5 | APC-Cy7 | |
| aCD8 | 53-6.7 | PE | |
| aCD64 | X54-5/7.1 | PE-Cy7 | |
| aCD207 | 4C7 | APC | |
References
- Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
- Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
- Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
- Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
- Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
- Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
- Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
- Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
- Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
- Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
- Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
- Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
- Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
- Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
- Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
- Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).
