Abstract
帧内胸腺T细胞的发展需要一个复杂的三维网状组织的各种基质细胞， 即非T细胞组成。胸腺遍历这个支架在一个高度协调的时间和空间秩序，同时顺序通过强制性的检查点， 即 T细胞谱系的承诺，其次是T细胞受体库的生成和选择之前，其出口到周边。形成该支架的两个主要居民小区类型是皮质（cTECs）和髓胸腺上皮细胞（mTECs）。 mTECs的一个关键特征是众多组织限制性抗原所谓混杂的表达。这些组织限制性抗原呈现，以直接或间接的不成熟的胸腺细胞通过mTECs或胸腺树突状细胞，分别导致自身耐受。
合适的体外模型模拟cTECs和mTECs的发展途径和功能在当前LAC国王。这种缺乏足够的实验模型已例如阻碍混杂基因的表达，这仍然知之甚少在细胞和分子水平上的分析。我们适应了3D器官联合培养模式，培养体外分离mTECs。最初设计该模型培养的角质形成细胞在这样的方式来产生皮肤等效体外 。 3D模型保存MTEC生物学重点功能特点：（I）的增殖和CD80 LO，艾尔阴性终末分化成CD80 喜 ，艾尔阳性mTECs，（二）反映RANKL，并FoxN1（三）持续表达， AIRE和CD80 喜 mTECs组织限制性基因。
Introduction
显影胸腺细胞约占98％，胸腺，而其余的2％由多种细胞，它们共同构成了胸腺基质（ 即，上皮细胞，树突细胞，巨噬细胞，B细胞，成纤维细胞，内皮细胞）。外皮质上皮细胞（cTECs）促亲T细胞的移民从骨髓，T细胞谱系的诱导多能前T细胞和阳性选择自我的MHC限制性不成熟的胸腺细胞。所述内髓胸腺上皮细胞（mTECs）参与耐受诱导那些胸腺细胞具有高亲和性TCR为自身肽/ MHC复合物由两种诱导阴性选择或它们的偏差成T调节细胞谱系。在中央耐受诱导的上下文中，mTECs是因为它们表达了广泛的组织限制性自身抗原（的TRAs）因而镜像的周自谱是唯一的。这种现象被称为混杂基因表达（PGE）1,2。
关于这个迷人的细胞类型的最新研究依赖于体外分离的细胞，如各种短期二维培养系统总是导致PGE的损失和关键调节分子如MHC II类，FoxN1和艾尔内的第2天3-6 。它仍然不清楚然而，这尤其是元器件和胸腺的完整3D小梁的特点在2D模式不翼而飞。的再聚集胸腺器官培养（RTOC）一直迄今唯一的三维系统，使T细胞发育的研究中，一方面，与基质细胞生物学，另一方面，在一个完整的胸腺微环境7。然而，RTOCs有一定的局限性， 即，它们已经含有细胞的复杂混合物，需要胚胎基质细胞的输入和忍受的5到10天的最大培养期。
还原的体外培养体系的缺乏阻碍的研究T细胞发育和胸腺器官几个方面PGE的不仅仅是分子调控及其对mTECs的发育生物学关系。
由于紧密关联的皮肤和胸腺上皮细胞的结构化组织，我们选择了已被开发的最初仿效体外角质细胞的分化，从而创造一个真皮当量的三维器官培养（OTC）系统。场外交易系统由覆盖与被困在纤维蛋白胶，其上的角质形成细胞接种8,9真皮成纤维细胞惰性支架矩阵。在这里，我们代替角质形成细胞纯化mTECs。在保持这一模式的基本特征，我们优化的某些参数。
在通过场外交易模式mTECs增殖，进行终末分化和维护MTEC身份和铂族元素， 在体内 mTECs的发展密切相关，从而模仿
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究已批准Regierungspräsidium卡尔斯鲁厄的伦理委员会。所有动物饲养无特定病原体条件下在德国癌症研究中心（DKFZ）下。对于所有的培养实验小鼠幼仔范围从1岁到7天被使用。
从胸腺1.隔离mTECs的
注：如无菌条件下先前1中记载有一些修改如下进行以下的消化步骤。
- 斩首的乳鼠，取出胸腺。放置在冰上thymi在含有RPMI 1640培养基（含5％FCS）培养皿。
- 切thymi成细，小块并置于圆底管〜5-30毫升RPMI培养基和轻轻搅拌用磁铁在室温10分钟。
- 此后，滗主要含有胸腺细胞的上清液并与一个圆collagena的消化组织顺序的剩余本身IV型（0.2毫克/毫升和57 U / ml的最终concentartion）15分钟每个在37℃，随后通过胶原酶/分散酶（0.2毫克/毫升和1.2 U / ml的终浓度）为每25分钟，在37°下在水浴磁力搅拌下，直到thymi被完全消化。使用1ml的酶每两到三个thymi。
- 搅动组织每隔7-10分钟用巴氏吸管。池胶原酶/分散酶组分，并通过一个70微米的纱布过滤。
- 通过磁性细胞分选（MACS）充实mTECs。通过磁性细胞如先前11描述的，和在图1所示的排序执行mTECs的纯化。
注：对于mTECs的磁分选，我们使用了下列抗体：抗CD80-PE（16-10A1，使用以1：100稀释）和抗EpCAM-生物（G8.8，使用以1：100稀释）12。使用MACS未成熟和成熟mTECs被定义为：CD45 - EpCAM的+ CD80 -和CD45 - CD80 + respectiv伊利。 - MACS纯化（未成熟mTECs的纯度= 83.1±6.3％和成熟mTECs = 79.23±3.42％）后，种子mTECs到器官文化，如下所述（第2.3节）。
- 可替换地，排序mTECs通过FACS（使用100微米的喷嘴）的CD45磁珠耗尽后使用下列抗体：抗CD45-PerCP（30-F11，使用以1：100稀释），抗Ly51-FITC（6C3，使用在1 ：100稀释），抗EpCAM-Alexa647（G8.8，使用以1：500稀释），并在1抗CD80-PE（16-10A1，用途：100稀释度）。排除使用碘化丙啶（1：5000）死细胞（4天）。使用流式细胞仪未成熟和成熟mTECs被定义为：PI - CD45 - Ly51 - EpCAM的+ CD80 -和PI - CD45 - Ly51 - EpCAM的+ CD80 +，分别为。
2. 3D器官联合培养（OTCS）
注：3D-真皮构造的器官培养keratinocyt的西文被如先前9,13所述制备。在所有步骤的细胞在37℃和5％的CO 2。使用mTECs的OTCS制备稍作修改如下。
- 人成纤维细胞的制备
注意：人皮肤成纤维细胞从脱epidermised真皮外植体培养物如先前9中所述获得。- 简言之，切开人体皮肤（〜5cm长）的带和治疗与嗜热菌蛋白酶（0.5mg / ml的盐水中，用10毫摩尔的Hepes pH7.4）中O / N在4℃。
- 其后，从利用镊子真皮分离表皮。
- 细切真皮成小块，放置在10cm的培养皿，并允许下一个无菌气流中干燥1-2小时。用DMEM含20％FBS定期补充外植体。
- 分裂出生长的成纤维细胞时汇合（通常大约3周）用0.1％胰蛋白酶确保植继续坚持该板用于进一步CON组secutive轮生长的。
- 扩大从同一外植体成纤维细胞为最多3次在含10％FBS和低温保存它们14。使用相同批次的成纤维细胞的每个实验系列。
注：成纤维细胞不照射为集合式真皮等同物。
- 脚手架的制备
- 削减0.4-0.6毫米厚的粘胶，非织造纤维材料（在支持Excel表单产品的详细信息）以及成圈划定，用锋利的直径11mm的金属冲床恰好适合12良好的滤芯。然后将其放入12井滤芯（聚酯毛细管孔膜，3微米孔径）作为支架。放置的完整的过滤器安装到无菌的12孔板中。
- 准备使用纤维蛋白胶，试剂盒进行手术，包括纤维蛋白原和凝血酶的结合的血纤维蛋白凝胶。预稀释fibrinogen-以及试剂盒的凝血酶组分至8毫克/毫升和10单位/毫升。对于一个12孔板的单个孔的步骤如下。
- 稀释100μl的纤维蛋白原（8毫克/毫升）用100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）不含Ca 2+和Mg 2+，pH值7.0。稀释100μl的凝血酶（10单位/ ml）与含有270000成纤维细胞加入100μlFCS中。
- 分配200μl的含有成纤维细胞的混合到该支架的凝血酶，向其中加入200微升血纤维蛋白原（1：1的混合物），产生的2毫克/毫升的2.5单位/ ml凝血酶和纤维蛋白原的终浓度。拌匀，均匀地分布在支架轻柔吹打（第1天）的整个区域。
注：30分钟，在37℃后凝块包封的成纤维细胞会形成，尽显无遗支架的内部空间，并形成一个光滑的上表面。
- 共培养mTECs
- 用于预培养，浸没在器官培养含10％FBS，50μg/ ml的L-抗坏血酸和1纳克/毫升的培养基改变TGF-β1的隔日4-5天。
- 上MTEC播种当天，由RFAD介质更换介质（1：1的DMEM + DMEM / F12）有10％FBS，10 -10 M霍乱毒素，0.4毫克/ ml氢化可的松，50μg/ ml的L-抗坏血酸， RANK配体（0.1微克/毫升）和500单位/ ml抑肽酶，从而防止早熟纤溶由成纤维细胞分泌的丝氨酸蛋白酶。
- 7-8小时后，建立共培养播种250000 mTECs（无论是完整的mTECs，或CD80 Io和 CD80 喜子集），在每孔100μl的成纤维细胞支架的顶端的体积。算使用Neubauer室（4天）的细胞。
注：在任何时候胸腺器官3D文化是浸没在媒体不像皮肤OTCS这是空气解除。 - 经过24小时培养，提供如上述（步骤2.3.2）与介质的培养物（总培养基交换）现在containiNG减少抑肽酶，250单位/毫升（5日）的金额。
- 为了评估mTECs的增殖活性，终止培养物之前的EdU（6.7μM/ ml时， 即，10μM/孔）添加到OTCS 4小时。在每一种文化标本或流两节这些EDU成像套件结合共染色角蛋白14的描述确定mTECs的增殖指数，方法是计数K14 + +的EdU细胞进行的OTC冷冻切片染色术（EDU流式细胞术，第代替Ly51-FITC 1.7，但是使用的CDR1-PB 15在1：100稀释和2.3.6.4）。
- 下列4-7天共培养的，终止OTCS和方法RNA分离，冷冻切片或FACS分析（8-11天）。
- 使用镊子，分离的支架/真皮当量从井刀片的过滤终止培养。
- 对于冷冻切片，嵌入整个OTC华侨城化合物，冻结李冷冻切片之前，英镑氮蒸气。准备使用低温恒温器和存储5-7微米厚的非处方药部分在-20℃下直到使用。对于免疫组化的冷冻切片OTCS使用抗角蛋白14（AF64，使用以1：1000稀释）和抗波形蛋白（GP53，使用以1：100稀释）的抗体。执行使用各自的二级抗体的间接免疫组织化学染色。
- 对于RNA分离，加入1 ml变性溶液（含有苯酚和异硫氰酸胍）在2 ml无RNase管的螺旋盖。切断整个场外成用手术刀片，并添加到含有变性溶液的管中。机械地以6.0的速度切丝与FastPrep仪OTCS两次30秒，放在冰上间为2分钟（样品可以储存在-80℃这点之后）。如果在-80℃下冻结，解冻在冰上。离心管在11,500-13,000转速在4℃下10分钟。将上清液转移到新的管中，孵育5分钟，在RT和f使用酸性硫氰酸胍 - 酚 - 氯仿提取如制造商所述ollow RNA分离协议。
- 用于FACS分析，除去该脚手架和分离的膜与纤维蛋白/纤维细胞/ MTEC凝胶。切细的凝胶用手术刀和消化它在在FACS管中〜20分钟，或直至完全在水浴磁力搅拌下用2ml胶原酶/分散酶的消化在37℃。搅拌用巴斯德吸管每5分钟的酶溶液。完全消化后，通过过滤70微米的过滤器细胞悬浮液;染色使用如1.7所描述并通过流式细胞术分析抗体的单细胞悬浮液。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们采用了3D器官联合培养模型（3D OTC）已被最初开发的角质9 体外长期培养。 MACS富集mTECs（见MACS富集方案图1）接种到含有纤维蛋白胶包裹和成纤维细胞的支架。成纤维细胞提供必要的细胞外基质（ECM） 体外支承mTECs。 MTECs培养在OTCS为4-14天在RANKL的存在下，在浸没培养不像角化细胞，这是空气暴露模仿它们在体内环境（参见场外的建立方案图2）。
这里既分析MTEC子集（ 即 CD80 LO和CD80 喜 mTECs）期间长达14天的整个培养期间存活。 MTECs是由角蛋白14的表达和鉴定很容易区分的波形蛋白阳性的成纤维细胞（ 图
该子集MTEC不仅活了下来，而且在3D条件场外交易激增的评估埃杜结合（ 图3C，3D）。有趣的是，CD80 罗 mTECs增殖以较高的速率在RANKL的存在下，而正好相反对于CD80 喜 mTECs 10。
此外，CD80 LO mTECs分化成CD80 喜 mTECs在RANKL的存在在4天的培养，通过强大的上调CD80的指示。分化mTECs也保持艾尔，FoxN1（基因和p的表达rotein）以及杂乱表达艾尔独立和依赖的TRAs 10。
图1. MACS富集的TECs。过滤后，mTECs是从胸腺单细胞悬液用磁性细胞分选（MACS）富集。首先，将造血细胞谱系用抗CD45微珠耗尽。的CD45 -的细胞与抗CD80 PE抗体孵育，接着用抗PE微珠。含有CD80 + -mature mTECs洗脱液是直接培养上OTCS，而流过包含CD80 -未成熟mTECs和其它基质细胞。 MTECs使用抗EpCAM-生物抗体和链亲和素微球进行了进一步的丰富。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2方案的三维OTCS的逐步设置 。的支架基质放入12孔过滤器插入件。从外植的皮肤的真皮成纤维细胞（270,000细胞/ OTC孔）接种到一个纤维蛋白胶（包括1：1的比例的纤维蛋白原和凝血酶的）。这些真皮等同物进行持续4-5天用DMEM +养分直至mTECs（250,000个细胞/ OTC孔）接种在上面，并与介质富含不同养分（RFAD +营养素）中培养。
图3.生长模式和OTCS内mTECs的增殖 。富集CD80 LO mTECs倾向于成长为一个双层与成纤维细胞（A），密切接触WH ereas的分化CD80 喜 mTECs成长为细胞聚集或紧簇（B）。 OTCS分别标上培养的第4天用抗角蛋白14（红色）和抗波形蛋白抗体（绿色）连同核染色（Hoechst公司，蓝）。为了评估mTECs的扩散，OTCS进行脉冲用EdU（6.7μM/ ml时， 即，10μM/孔）4小时之前终止培养物。场外冷冻切片，然后用抗角蛋白14（绿色）染色，EDU-点击-IT的反应混合物（品红色）以及核染色（Hoechst公司，蓝色）。代表图像描绘增殖的EdU + CD80 LO mTECs（C）和+的EdU 喜 CD80 mTECs（D）显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
表两个3D胸腺文化系统之间的比较1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
沿着RTOCs，三维OTCS已经于TEC分化和PGE维护/感应（ 表1）相对于其它（ⅰ）“简化3D培养'使用的术语是由远优于-的成纤维细胞单独无脚手架; （ⅱ）二维系统使用-成纤维细胞/饲养细胞共培养的TECs 10，（ⅲ）3T3-J2细胞，其中的TEC克隆发展，但PGE丢失，（ⅳ）基质胶或（v）ECM组分（未发表数据）。 PGE下保持7天，在3D OTCS 4天为最佳时间点之后，PGE开始下降。其他形态的TEC特征被维持到14天。有趣的是，OTCS支持MTEC分化看到偶尔形成哈索尔状结构10的终末期。
用于OTCS的thymi从年轻产后小鼠衍生的，因为它们有较高的倾向在培养中存活相比成人thymi。衍生的TEC来回thymi尚未在OTCS测试米胚胎。越是这样，长的消化期（不使用胰蛋白酶由于某些抗原决定簇的裂解）后，出现细胞更可行的使用MACS而不是FACS分选的细胞。使用上的CD80 + mTECs额外改进的TEC纯度的MACS柱（抗PE微珠）的两步阳性富集协议。
为场外设置有必要确保粘胶，非织造纤维材料如上所指出恰好放入12孔培养插入物切成尖，以及划定界没有松动的碎片或锯齿状末端。可替代地，支架如BEMCOT-粘胶刮水器M-3（http://www.bemliese.com）也可使用。阱大小为场外也是关键的，应测试，如果超过6孔和12孔格式其它板形式应该被使用。
纤维蛋白凝胶应该准备，使得纤维蛋白原和凝血酶成分不进入联系吨，对方被设置到上柜之前，确保交流枪头。在板彻底混合这两种组分在所述支架，以形成一个光滑的上表面。总是在井旁边制备测试凝胶无支架来检查正确凝块形成并具有所需的凝血时间的良好估计。确保在场外的纤维蛋白胶与媒体提供文化之前已经完全凝结。
一旦终止引晶mTECs可由纤维蛋白胶，其可用于培养mTECs 例如表征的酶消化（胶原酶/分散酶）容易地检索到的培养物，通过流式细胞术或PCR的。
本文所描述的3D OTCS具有学习或操纵几个TEC参数即电位：1）通过的siRNA，吗啉代寡核苷酸）mTECs的发育途径和功能研究和/或操纵（; 2）研究mTECs在T细胞中的作用开发换货; 3）文化cTECs; 4）来测试胸腺来源的干细胞的祖潜力; 5）培养人肾小管上皮细胞和干细胞; 6）执行单一TEC克隆实验。三维OTCS代表一个精心制作的文化技术，模拟体内微环境胸腺的一部分。应当强调的是，施加的TECs在当前场外设置任何附加的分析将需要进行彻底的测试，并分别进行了优化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称没有任何财务或商业利益冲突。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
