Protocol
1. Fremstilling af 3% 2-hydroxyethyl Agarose
- I en ren, tør 100 ml glasflaske, tilsættes 0,9 g 2-hydroxyethyl agarose (agarose VII) efterfulgt af 30 ml destilleret vand.
- Mikroovn blandingen i 15 sek og forsigtigt hvirvel. Gentag dette trin mindst tre gange, indtil agarosepulver helt opløses.
- Autoklaver opløsningen indeholdende flaske i 15 minutter.
- Tillad agaroseopløsningen afkøle til stuetemperatur, før yderligere anvendelse. Opløsningen opbevares ved stuetemperatur.
2. Fremstilling af bundlaget: 0,6% agarosegel
- Pre-varme flere 5 ml og 10 ml pipetter i et 37 ° C inkubator for at forhindre agarose størkne i pipetten ved håndtering.
- Delvist løsne flasken låg og mikroovn pre-made 3% 2-hydroxyethyl agaroseopløsning i 15 sek. Derefter forsigtigt hvirvle løsningen og mikrobølge for en anden 15 sek. ADVARSEL: Vær forsigtig, når hvirvlende af AgaroSE løsning, fordi opløsningen stiger op, når de udsættes for luft og kan smitte.
- Hvis der er tilbageværende fast gel i flasken, mikroovn i et par sekunder mere.
- Hold flasken indeholder den agarose opløsning i en 45 ° C vandbad i løbet af de næste skridt til at forhindre agarose løsning fra størkne for tidligt.
- Varm MCF10DCIS medier i et 37 ° C vandbad. Bemærk: MCF10DCIS medier består af DMEM / F12, 5% hesteserum, 5% penicillin streptomycin.
- Overfør 3 ml 3% agaroseopløsning hjælp af forvarmet pipetter i en steril 50 ml konisk rør.
- Straks tilsættes 12 ml varm MCF10DCIS medier og vend forsigtigt konisk rør for at blande agarose med medierne. Prøv ikke at danne nogen bobler, da det vil forstyrre kolonien tælle senere.
- Forsigtigt tilsættes 2 ml af denne blanding i hver brønd i en 6-brønds dyrkningsplade uden at danne luftbobler.
- Inkubere 6-brønds dyrkningsplade Horizontally på en flad overflade ved 4 ° C i 1 time for at tillade blandingen at størkne.
- Efter at blandingen størkner, placere pladen i en 37 ° C inkubator i 30 minutter. Bundlaget er nu klar til brug.
3. Fremstilling af Cell-holdige lag 0,3% agarosegel
- Trypsinisér MCF10DCIS celler og fortyndes dem til en cellekoncentration på 4 x 10 4 / ml.
- Tag 2 ml af 3% agarose hjælp forvarmet pipetter og overføre i en steril 50 ml konisk rør.
- Straks tilsættes 8 ml MCF10DCIS medier til den konisk rør og vend forsigtigt at blande agarose med medierne. Undgå dannelse af eventuelle bobler.
- 2 ml af de MCF10DCIS celler (4 x 10 4 / ml) og behandl med BB-CLA (0 uM (DMSO) eller 1 uM).
- I en 1: 1 fortynding, blandes cellerne med 0,6% agarose.
- Tag 1 ml af blandingen celle-agarose og forsigtigt tilføje på det nederste lag af 6-brønds kultur psene (2 x 10 4 celler / ml).
- Placer 6-brønds dyrkningsplade vandret på en flad overflade ved 4 ° C i mindst 15 minutter for at tillade det øverste lag for at størkne.
- Efter at blandingen størkner, placere pladen i en 37 ° C inkubator i en uge før tilsætning fodring lag.
4. Forberedelse af Feeder lag 0,3% agarosegel
- Mikroovn pre-made 3% 2-hydroxyethyl agaroseopløsning i 15 sek. forsigtigt hvirvle løsningen og mikroovn for en anden 15 sek.
- Ækvilibrering af agaroseopløsning flaske i en 45 ° C vandbad.
- Varm MCF10DCIS medier i et 37 ° C vandbad.
- Bland 1 ml 3% agarose-opløsning med 9 ml varm MCF10DCIS medier i en 50 ml konisk rør og vend forsigtigt at blande agarose med medierne. Undgå dannelse af luftbobler.
- Blandingen behandles med BB-CLA (0 uM (DMSO) eller 1 uM).
- Forsigtigt tilsættes 1 ml af denne blanding (uden forming bobler) i hver brønd i 6-brønds dyrkningsplade, der indeholder bunden og bløde lag.
- Placer 6-brønds dyrkningsplade vandret på en flad overflade ved 4 ° C i mindst 15 minutter for at tillade blandingen at størkne.
- Efter fødelaget størkner, placere pladen i en 37 ° C inkubator.
- Gentag denne fodring procedure ugentligt med 1 ml 0,3% agarose / medium / behandlingen løsning overlejre på eksisterende feeder lag for at genopbygge cellerne med nye medier, indtil kolonidannelse overholdes. Bemærk: Agar i de bløde og fødelag er meget blød, og derfor vil de tilsatte næringsstoffer fra fødelag let diffundere ind i cellen-holdige lag at nå cellerne.
5. Dataindsamling
- Efter 2,5 ugers cellevækst i blød agar, tælle antallet af kolonier i hver brønd med et lysmikroskop. For at lette kvantificering, udskrive et gitter på en gennemsigtighed og vedhæfte gitteret til6-brønds plade for at finde, hvor cellerne er under optællingen. Da koloni størrelse (som kvantificeret ved diameteren af hver koloni) vil variere, forhåndsdefinere en reference kolonistørrelse at afgøre, hvilke kolonier scores. For eksempel indbefatter koloni størrelser på 70 um eller derover i dataanalysen.
- Opbevare prøverne ved 4 ° C for at forhindre yderligere dannelse koloni og til fremtidig tælling. Forsegle 6-brønds dyrkningsplade med Parafilm at forhindre gelerne tørrer ud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den bløde agar kolonidannelse assay kan anvendes til en bred vifte af applikationer dokumenterer tumorigeniciteten af cancerceller. En stor fordel ved denne teknik er, at den halvfaste matrix selektivt favoriserer væksten af celler, der kan proliferere i en forankringsuafhængig måde. Dette træk er hovedsageligt udvises af cancerceller, men ikke af normale celler. Vi bruger primært denne teknik til at teste effektiviteten af tumorvækst inhibering med narkotika og til at teste for virkningen af overekspression eller udtømning af vores gener af interesse, herunder PADI gener, om tumorgenicitet af brystcancerceller. Her har vi vurderet virkningen af BB-CLA på tumorigen inhibering af PADI2-overekspression MCF10DCIS celler (figur 1 og 2).
Resultaterne viser, at BB-CLA signifikant inhiberer dannelsen af MCF10DCIS celle-afledte kolonier. Figur 3 viser, at i nærvær af en PADI inhibitor t, her var en reduktion i både kolonidannelse og koloni størrelse sammenlignet med DMSO-kontrol. [Note:. BB-CLA blev opløst i DMSO og blev således DMSO anvendt som kontrol] Størrelsen af kolonier for BB-CLA behandlede MCF10DCIS celler var overvejende i området fra 20 til 100 um, mens størrelsen af kolonier for DMSO kontrol udviste et større udvalg på 70 til 150 pm efter 2,5 ugers vækst.
Kolonier større end 70 um blev talt og analyseret (figur 4). Der var et gennemsnit på 3.536 kolonier i DMSO kontrol mens kun 1.967 kolonier blev set i BB-CLA behandlede gruppe efter 2,5 ugers blød agar kultur. Dette er en nedgang i den gennemsnitlige kolonidannelse i nærvær af 1 pM BB-CLA 44%, hvilket indikerer en betydelig tumorigen inhibering af brystcancerceller (MCF10DCIS celler) ved PADI inhibitor.
pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
Figur 1. kemiske struktur af BB-CLA.
Figur 2. Skematisk Oversigt over protokollen om Soft Agar Colony Formation analysen. Hver brønd af dyrkningspladerne 6 brønde blev først belagt med 0,6% agarose gel (nederste lag). En 0,3% agarosegel blanding indeholdende MCF10DCIS celler og enten BB-CLA-inhibitor (1 uM) eller DMSO (kontrol) blev derefter lagt oven på den 0,6% gel. En gang om ugen, blev 0,3% agarose-blanding gelen (indeholdende BB-CLA) tilsat oven på det blødt lag. Efter 2 til 4 uger, blev kolonidannelse observeret og talt til dataanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Billeder af kolonidannelse i BB-CLA-behandlede MCF10DCIS celler. MCF10DCIS celler blev dyrket i blød agar i nærvær (1 uM BB-CLA) eller fravær af BB-CLA (0 uM DMSO). Efter 2,5 uger blev kolonierne filmede med et omvendt mikroskop for lav forstørrelse billeder og et lysmikroskop for høj forstørrelse billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af MCF10DCIS Colony Antal efter BB-CLA behandling. MCF10DCIS celler blev dyrket i blød agar ved forskellige koncentrationer af BB-CLA (0 uM (DMSO) eller 1 uM BB-CLA). Efter 2,5 uger større individuelle kolonier then 70 um blev talt. Forsøg blev gentaget 4 gange (n = 4). Den statistiske signifikans af den samlede celletal forskel mellem kontrol- og behandlingsgruppen prøver blev bestemt ved to-prøve t-test (* p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hastigheden af kolonidannelse i blød agar varierer afhængigt af celletype 9. Derfor, at antallet af celler begynde med bør optimeres og justeres i overensstemmelse hermed. En foreslået udgangspunkt interval er mellem 5 x 2-01 oktober x 10 4 celler per brønd under anvendelse af en 6-brønds plade. Desuden varierer koloni størrelse afhængig vækstraten for hver celle. Derfor er en foruddefineret en cut-off for kolonien skal bruge for at anmærke individuelle kolonier for downstream kvantitative analyser. Her kolonier større end 70 um blev kvantificeret for at undgå optagelse af ikke-prolifererende celler afledt fra den indledende udpladning.
For optimal vækst, når de foretager 3D agarosegeler, er det tilrådeligt at bruge den samme celle dyrkningsmedium normalt anvendes til 2D cellekulturer. Dette skyldes skiftende medium ofte gange ændrer celler væksthastighed, hvilket nødvendiggør yderligere passage for at tillade cellerne at tilpasse sig det nye medium. For eksempelKan MCF10DCIS dyrkes optimalt i RPMI-1640, DMEM, eller DMEM / F12-medium. Men når MCF10DCIS dyrkningsmedier ændres fra RPMI-1640 til DMEM / F12, er der en mærkbar reduktion i celleproliferation sats. Derudover bør være omhyggelig med at opretholde serumkoncentrationer på et konstant niveau, for uden serum, vil kolonidannelse hæmmes 10. Desuden udviste de agarose microwaved, lader man flasken ækvilibrere i en 45 ° C vandbad før blanding med medier indeholdende celler til at forhindre overophedning af cellerne. Eftersom agarose størkner hurtigt ved stuetemperatur, anbefaler vi også, at alle pipetter og 6-brønds dyrkningsplader forvarmes i en 37 ° C inkubator før tilsætning agaroseopløsning for at forhindre for tidlig størkning ved håndtering.
Mens blød agar-kolonidannelse teknik er et værdifuldt værktøj til måling af tumorgenicitet i en række cancer-cellelinjer, nogle linier ikke vokse i blød agar. Anothendes potentiel ulempe ved fremgangsmåden er, at levedygtige celler ikke kan gendannes, når de udplades i blød agar. Desuden, hvis en forbindelse har en kortere biotilgængelighed periode, vil trin fodring skal udføres hyppigere (dvs. hver anden dag), og prøverne skal indsamles i mindre end syv dage. Skal også reduceres, mens der stadig giver mulighed for potentielle forskelle mellem de, der skal overholdes prøver Tærsklen for kolonien størrelse. I disse tilfælde vil kontrollen være nødvendigt at indgå for at optimere eksperimentelle parametre for at minimere falsk positive og falsk negative resultater. Endvidere kan denne teknik være tidskrævende og vanskeligt ved test af en stort antal prøver. Imidlertid har teknologiske fremskridt bidraget til at overvinde nogle af disse begrænsninger. Den konventionelle blød agar-assay (som dokumenteret i dette manuskript) anvender typisk 6-brønds dyrkningsplader eller 6mm dyrkningsskåle. Med automatiserede plade læsere dog multiple prøver kan behandles i 384-brønds plader 11. For eksempel undersøgere pre-loaded tumorceller med farvestoffer, såsom alamarBlue og tetrazoliumfarvestoffer og kolonier kvantificeres ved anvendelse pladelæser, hvorved behovet for manuelt at tælle koloni nummer 11. Denne high-throughput kapacitet er derfor medgørlige til store cancer drug skærme.
I alt har blød agar-assayet er en værdifuld præklinisk teknik, der kan anvendes til at vurdere tumorigeniciteten af en bred vifte af cancerceller (bryst, prostata, ovarie og andre) med hensyn til deres følsomhed over for lægemidler, hormoner, varme, hypoxi, og en lang række andre behandlingsbetingelser. Analysen fortsætter med at yde en enkel og informativ værktøj til kræftforskere, der ønsker at bedre at forstå de mekanismer i kræft progression og teste anti-tumor potentiale af nye behandlinger mod kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
