Utnyttelse i Soft Agar Colony Forming analyse for å identifisere hemmere av tumorgenisitet i brystkreftceller

Protocol

1. Fremstilling av 3% 2-hydroksyetyl ​​Agarose

1. I en ren, tørr 100 ml glassflaske, tilsett 0,9 g 2-hydroksyetyl-agarose (Agarose VII) etterfulgt av 30 ml destillert vann.
2. Mikrobølgeovn blandingen i 15 sekunder og forsiktig virvel. Gjenta dette trinnet minst tre ganger til agarose pulveret helt oppløst.
3. Autoklaver oppløsningen inneholdende flaske i 15 min.
4. Tillat agarose løsningen avkjøles til romtemperatur før videre bruk. Oppbevar løsningen ved RT.

2. Fremstilling av de nederste lag: 0,6% agarosegel

1. Pre-varm flere 5 ml og 10 ml pipetter i en 37 ° C inkubator for å hindre at agarose fra å størkne i pipetten ved håndtering.
2. Delvis løsne flasken lokket og mikrobølge pre-laget 3% 2-hydroksyetyl-agarose-løsning i 15 sek. Deretter virvle løsningen og mikrobølgeovn for ytterligere 15 sek. FORSIKTIG: Vær forsiktig når virvlende AgaroSE løsning fordi oppløsningen stiger opp når de utsettes for luft, og kan renne over.
3. Hvis det er rest solid gel i flasken, mikrobølgeovn for noen flere sekunder.
4. Hold flasken inneholder agarose løsning i en 45 ° C vannbad i løpet av de neste trinnene for å hindre agarose løsning fra størkne tidlig.
5. Varm MCF10DCIS media i en 37 ° C vannbad. Merk: MCF10DCIS media består av DMEM / F12, 5% hesteserum, 5% penicillin streptomycin.
6. Overføring 3 ml av 3% agarose-løsning ved hjelp av forvarmet pipetter inn i et sterilt 50 ml konisk rør.
7. Umiddelbart legge 12 ml varme MCF10DCIS media og forsiktig invertere konisk rør for å blande agarose med media. Prøv ikke å danne noen bobler som det vil forstyrre kolonien teller senere.
8. Tilsett 2 ml av denne blanding i hver brønn av en 6-brønners kulturplate uten at det dannes luftbobler.
9. Inkuber 6-brønns kulturplate horisontalenlly på en flat overflate ved 4 ° C i 1 time for å la blandingen størkne.
10. Etter at blandingen størkner, plasseres platen i en 37 ° C inkubator i 30 min. Bunnlaget er nå klar til bruk.

3. Fremstilling av den celleholdige lag: 0,3% agarosegel

1. MCF10DCIS trypsineres cellene, og fortynne dem til en celle konsentrasjon på 4 x 10 ⁴ / ml.
2. Ta 2 ml 3% agarose bruker forvarmet pipetter og overføre til en steril 50 ml konisk tube.
3. Umiddelbart legge 8 ml MCF10DCIS media til konisk rør og forsiktig snu å blande agarose med media. Unngå at det dannes bobler.
4. Ta 2 ml av MCF10DCIS-celler (4 x 10 ⁴ / ml) og behandle med BB-CLA (0 um (DMSO) eller 1 uM).
5. I en 1: 1 fortynning, blanding av cellene med 0,6% agarose.
6. Ta 1 ml av celle-agarose blanding og tilsett til det nederste laget av 6-brønners kultur psen (2 x 10 ⁴ celler / ml).
7. Plasser 6-brønns kulturplate horisontalt på en flat overflate ved 4 ° C i minst 15 min for å la topplaget for å størkne.
8. Etter at blandingen størkner, plasseres platen i en 37 ° C inkubator i en uke før tilsetning av foringslaget.

4. Fremstilling av materen lag: 0,3% agarosegel

1. Microwave pre-laget 3% 2-hydroksyetyl-agarose-løsning i 15 sek. virvle løsningen og mikrobølgeovn for ytterligere 15 sek.
2. Ekvilibrere agarose løsning flasken i et 45 ° C vannbad.
3. Varm MCF10DCIS media i en 37 ° C vannbad.
4. Bland 1 ml 3% agarose løsning med 9 ml varm MCF10DCIS medier i en 50 ml konisk rør og forsiktig snu å blande agarose med media. Unngå dannelse av luftbobler.
5. Behandle blandingen med BB-CLA (0 um (DMSO) eller 1 uM).
6. Tilsett 1 ml av denne blandingen (uten forming bobler) i hver brønn på 6-brønners kulturplate inneholdende bunnen og myke lag.
7. Plasser 6-brønns kulturplate horisontalt på en flat overflate ved 4 ° C i minst 15 minutter for å la blandingen størkne.
8. Etter materen lag stivner, plasserer platen inn i en 37 ° C inkubator.
9. Gjenta denne fôring prosedyren ukentlig av overliggende 1 ml 0,3% agarose / medium / behandling løsning på eksisterende mater lag å fylle cellene med nye medier til kolonidannelse er observert. Merk: Agar i den myke og næringslag er meget myk, og derfor vil de tilsatte næringsstoffer fra materen sjiktet lett diffunderer inn i cellen inneholdende lag for å nå cellene.

5. Datainnsamling

1. Etter 2,5 uker med cellevekst i bløt agar, telle antallet kolonier i hver brønn ved hjelp av et lysmikroskop. For å lette kvantifisering, skrive ut et rutenett på en transparent og fest rutenettet til6-brønns plate for å bidra til å lokalisere hvor cellene er under telling. Siden kolonistørrelse (som kvantifiseres ved diameteren på hver koloni) vil variere, forhåndsdefinere en referanse kolonistørrelse for å bestemme hvilke kolonier scores. For eksempel, inkluderer koloni størrelser på 70 pm eller større i dataanalysen.
2. Oppbevar prøvene ved 4 ° C for å hindre ytterligere kolonidannelse og for senere telling. Tett 6-brønnen kultur plate med Parafilm for å hindre at gels tørker ut.

Representative Results

Den myke agar kolonidannelse analysen kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner som dokumenterer tumorgenisiteten av kreftceller. En stor fordel med denne teknikken er at den semi-faste matriks selektivt favoriserer vekst av celler som kan formere seg i et forankrings-uavhengig måte. Denne egenskap er hovedsakelig oppvises av kreftceller, men ikke av normale celler. Vi bruker først og fremst denne teknikken for å teste effekten av tumorvekst hemmingen med medisiner og for å teste virkningen av overekspresjon eller uttømming av de gener som er av interesse, inkludert PADI gener, på den tumorigenisitet av brystkreftceller. Her, vurderte vi effekten av BB-CLA på hemming av tumorgene PADI2-overekspresjon MCF10DCIS-celler (figur 1 og 2).

Resultatene viser at BB-CLA inhiberer dannelsen av MCF10DCIS celle-stammer kolonier betydelig. Figur 3 viser at, i nærvær av en inhibitor PADI, t her var en reduksjon i både kolonidannelse og kolonistørrelse sammenlignet med DMSO kontroll. [Merknad:. BB-CLA ble oppløst i DMSO og dermed DMSO ble anvendt som en kontroll] Størrelsen på kolonier for BB-CLA behandlede MCF10DCIS cellene var hovedsakelig innenfor området fra 20 til 100 um, mens størrelsen av kolonier for DMSO kontroll viste et større område på 70 til 150 pm etter 2,5 uker med vekst.

Kolonier som er større enn 70 um ble tellet og analysert (figur 4). Det var i gjennomsnitt 3536 kolonier i DMSO kontroll mens bare 1967 kolonier ble sett i BB-CLA gruppen behandlet etter 2,5 uker med myk agar kultur. Dette representerer en 44% reduksjon i gjennomsnittlig kolonidannelse i nærvær av 1 pM BB-CLA, noe som indikerer en signifikant inhibering av tumorigen brystkreftceller (MCF10DCIS celler) ved PADI inhibitor.

pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
Figur 1. kjemiske strukturen av BB-CLA.

Figur 2. Skjematisk oversikt av protokollen for soft agar-kolonidannelse analysen. Hver brønn på 6-brønners kulturplater ble først belagt med 0,6% agarose-gel (bunnlag). En 0,3% agarose-gel inneholdende blanding MCF10DCIS celler og enten BB-CLA-inhibitor (1 uM) eller DMSO (kontroll) ble deretter lagt på toppen av 0,6% gel. En gang i uken, ble 0,3% agarose-gel-blanding (inneholdende BB-CLA) legges på toppen av det myke lag. Etter 2 til 4 uker, ble kolonidannelse observert og telles for dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Bilder av kolonidannelse i BB-CLA-behandlede celler. MCF10DCIS MCF10DCIS-celler ble dyrket i myk agar i nærvær av (1 uM BB-CLA) eller fravær av BB-CLA (0 uM DMSO). Etter 2,5 uker, kolonier ble fotografert ved hjelp av en invertert mikroskop for lav forstørrelse bilder og et lysmikroskop for høy forstørrelse bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Kvantifisering av MCF10DCIS Colony nummer etter BB-CLA Treatment. MCF10DCIS-celler ble dyrket i myk agar ved forskjellige konsentrasjoner av BB-CLA (0 pM (DMSO), eller 1 uM BB-CLA). Etter 2,5 uker, enkelte kolonier større then 70 mikrometer ble talt opp. Forsøkene ble gjentatt 4 ganger (n = 4). Den statistiske signifikans av det totale celletall forskjell mellom kontroll- og behandlingsprøvene ble bestemt ved to-prøve t-test (* p <0.005).

Discussion

Frekvensen av kolonidannelse i bløt agar varierer avhengig av celletype ^9. Derfor, for å antall celler begynne med bør optimaliseres og justeres tilsvarende. En foreslått startområde er mellom 5 x oktober ² til 1 x 10 ⁴ celler pr brønn ved bruk av en 6-brønns plate. I tillegg varierer kolonistørrelse avhengig av veksthastigheten til hver celle. Derfor er en forhåndsdefinert en cut-off for kolonistørrelse for å kommentere enkelte kolonier for nedstrøms kvantitative analyser. Her ble kolonier større enn 70 um ble kvantifisert for å unngå innlemmelse av ikke-formerende celler avledet fra den opprinnelige plettering.

For optimal vekst, ved fremstilling av 3D-agarosegeler, er det tilrådelig å bruke den samme cellekulturmedium som normalt brukes for 2D-cellekulturer. Dette skyldes at endring av medium ofte endrer celler vekst, noe som nødvendiggjør ytterligere aging for å tillate cellene å tilpasse seg det nye medium. For eksempelKan MCF10DCIS celler dyrkes optimalt i RPMI-1640, DMEM, eller DMEM / F12 media. Men når MCF10DCIS kulturmedium blir forandret fra RPMI-1640 til DMEM / F12, er det en merkbar reduksjon i celleformering hastighet. I tillegg bør man sørge for å opprettholde serumkonsentrasjonen på et konstant nivå, fordi uten serum, vil kolonidannelse bli hemmet ^10. Videre, etter at agarose blir varmes i mikrobølgeovn, la flasken til likevekt i et 45 ° C vannbad før blanding med media inneholdende celler for å unngå overoppheting av cellene. Gitt at agarose størkner raskt ved værelsestemperatur, anbefales også at alle pipetter og 6-brønners kulturplater blir forvarmet i en 37 ° C inkubator før tilsetning av agarose-løsning for å forhindre for tidlig størkning ved håndtering.

Mens soft agar-kolonidannelse teknikk er et verdifullt verktøy for måling av tumorgenisitet i en rekke kreftcellelinjer, er det noen linjer ikke vokse i bløt agar. Anothennes potensiell ulempe ved fremgangsmåten er at levedyktige celler som ikke kan gjenopprettes når de er belagt inn i soft agar. I tillegg, hvis en forbindelse som har en kortere periode biotilgjengelighet, vil matetrinn må utføres oftere (dvs. annenhver dag) og prøvene må samles i mindre enn syv dager. Terskelen for størrelse kolonien må også reduseres samtidig gir potensielle forskjeller mellom prøvene som skal overholdes. I disse tilfeller ville kontrollene trenger å bli tatt med for å optimalisere eksperimentelle parametere for å minimalisere falske positive og falske negative resultater. Videre kan denne teknikken være tidkrevende og vanskelig ved testing av et stort antall prøver. Imidlertid har teknologiske fremskritt bidratt til å overvinne noen av disse begrensningene. Den konvensjonelle myke agar assay (som dokumentert i dette manuskriptet) bruker vanligvis seks-brønns kulturplater eller 6mm kultur retter. Med automatiserte plate lesere, men multiple prøver kan behandles i 384-brønns plater ^11. For eksempel, søkere forhåndslastet tumorceller med fargestoffer som alamarBlue og tetrazoliumsalter fargestoffer og koloniene blir kvantifisert ved anvendelse av plateleser, og dermed unngå behovet for manuelt å telle antall ¹¹ koloni. Det høy-overføringskapasiteten er derfor anvendelig for storskala kreftmedikament skjermer.

I sum er det myke agar assay en verdifull pre-klinisk teknikk som kan brukes til å vurdere tumorgenisiteten av et bredt spekter av kreftceller (bryst, prostata, eggstokkene og andre) med hensyn til deres følsomhet for legemidler, hormoner, varme, hypoksi, og en rekke andre behandlingsforhold. Analysen fortsetter å gi en enkel og informativ verktøy for kreftforskere som ønsker å bedre forstå mekanismene for kreft progresjon og teste anti-tumor potensialet for nye kreftbehandlingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1