Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de tejido gonadal de larvas de pez cebra, que facilitará las investigaciones de la diferenciación sexual de pez cebra y el mantenimiento.
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Artículo de método
La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales
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En este artículo
Resumen
Resumen
Aunque el pez cebra salvaje poseen un sistema de determinación del sexo / ZW ZZ, pez cebra domesticado han perdido el cromosoma sexual. Ellos utilizan un sistema de determinación del sexo poligénica, donde varios genes distribuidos en todo el genoma determinar colectivamente las identidades sexuales de peces individuales. Actualmente, los genes implicados en la regulación del desarrollo de las gónadas y cómo funcionan siendo difícil de alcanzar. Normalmente, el aislamiento de tejido gonadal es el primer paso para examinar los procesos de desarrollo de sexo. A continuación, presentamos un procedimiento para aislar el tejido gonadal de 17 dpf (días después de la fertilización) y 25 dpf larvas de pez cebra. El tejido gonadal aislado puede ser examinada posteriormente por la morfología y la expresión de genes de perfiles.
Introducción
El principal determinante del sexo femenino en salvaje cromosoma pez cebra 4 se pierde o se modifica en el pez cebra domesticado (es decir, las cepas de laboratorio comunes) 1. En cambio, tienen un sistema de determinación del sexo poligénica acompañado por factores ambientales como la temperatura, la hipoxia, la disponibilidad de alimentos y la densidad de población. Los mecanismos detallados del desarrollo sexual del pez cebra no se entienden completamente. Las preguntas fundamentales tales como cuando se produce la determinación del sexo de pez cebra, lo que es la señal de la determinación del sexo primario (s) / son, y que los gen....
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Protocolo
experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan. El pez cebra se plantearon y criado de acuerdo con procedimientos estándar de 20.
1. Preparativos
- Cultivar 17 dpf y 25 dpf larvas de pez cebra
- Transfer 2 hombres y 2 mujeres adultos de pez cebra (sana, de 3 a 6 meses de edad, de laboratorio AB strain) a un tanque de cruce en la tarde antes del día de travesía. Separar los machos y las hembras con una barrera. A la mañana siguiente, refrescar el agua del tanque y eliminar la barrera para que puedan aparearse. Recoger los....
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Resultados
Las disecciones de las gónadas se realizaron en AB strain larvas de pez cebra. La figura 1 muestra de tejido gonadal típico de larvas de pez cebra a las 17 dpf y 25 dpf. En primer lugar, la piel y los músculos de un lado del abdomen se corta para exponer los órganos internos. Después de retirar la masa de los órganos internos, la vejiga natatoria, junto con la gónada permanecen en el maletero. La gónada estaba unido a la parte ventral de vejiga natatoria (fl.......
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Discusión
El pez cebra se ha convertido en un modelo de gran alcance y se utiliza ampliamente en el desarrollo y la investigación relacionada con la enfermedad. Los métodos para el aislamiento de los órganos en el pez cebra adultos, tales como cerebro, corazón, gónadas, y el riñón, se han documentado bien 23, 24, 25. Debido al pequeño tamaño y remodelación dinámica de los tejidos gonadales en el larvas de pez cebra, el aislamiento de tej.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a C Zhang para el cuidado de los peces. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31171074, 31371099 y 31571067 a GP) y por el Proyecto Talento Pujiang (09PJ1401900 a GP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular 100 mm | Corning | 430167 | Para la incubación de embriones |
| 20x EM | Para 1 L necesario: añadir 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl y 2,9 g de CaCl· 2H2O; luego agregue 0,41 g de KH2PO4, 0,412 g de Na2HPO4 anhidro y 4,9 g de MgSO4· 7H2O. | ||
| 1x EM | Diluido 20x EM en agua destilada | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | Para la preparación de las placas de agar al 2% |
| Trizol Reactivo | Invitrogen | 15596-026 | Para el aislamiento de ARN |
| Medidor de vidrio | Shen Bo | 250 ml | Para preparar las placas de agar al 2% |
| Horno microondas | Midea | M1-211A | Para calentar el AGAR |
| Pinza DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | Para disección |
| Microscopio estereoscópico | Motic | SMZ168 | Para disección |
| Equipo de agua pura | Millipore | ||
| Ringer' | Para necesitar 1 L: Añadir 6,78 g de NaCl, 0,22 g de KCl, 0,26 g de CaCl2 y 1,19 g de Hepes; luego llenar hasta 1 L; Ajuste el pH a 7.2. Esterilizar por filtración y guardar en un recipiente de policarbonato transparente esterilizado en autoclave. | ||
| Pipeta de transferencia | Samco | 202, 204 | |
| Baño metálico | QiLinbeier | Modelo GL-150 | |
| Microscopio | Leica | M205 FA | Para centrífuga de fotomicrografía |
| Eppendorf | 5417R | ||
| Kit de aislamiento de ARN a microescala | Ambion | AM1931 | Para el aislamiento de ARN de tejidos gonadales |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | Para la digestión de ADN en la solución de ARN |
| RevertAid Kit de síntesis de ADNc de primera hebra | Thermo Scientific | #K1631 | Para la síntesis de ADNc de primera cadena |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | Para digerir el ARN residual en la solución de ADNc. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Este producto es una mezcla maestra 2x basada en ADN polimerasa Taq para PCR en tiempo real y aplicable para ensayos de intercalación con SYBR Green I. |
| Espectrofotómetro | Ne Drop | OD-2000+ | Medición de la concentración del ARN total |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | Perfil de expresión génica |
Referencias
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
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Reimpresiones y permisos
