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Methodenartikel

Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

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DOI:

10.3791/56347

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20. Januar 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.

Zusammenfassung

Zelluläre Adhäsion und Differenzierung ist bedingt durch die nanoskaligen Disposition Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) mit lokalen Konzentrationen, die eine große Wirkung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns von Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) zu erhalten-funktionalisierten Dendrimere, die es die nanoskaligen Kontrolle der lokalen RGD ermöglichen Oberfläche Dichte. Nanopatterns von Oberfläche Adsorption von Dendrimere aus Lösungen in verschiedenen ursprünglichen Konzentrationen gebildet werden und zeichnen sich durch Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und scanning Mikroskopiertechniken wie z. B. Sonde Scanning tunneling Microscopy (STM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die lokalen Oberflächendichte des RGD wird gemessen mit AFM Bilder mittels Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände und dann korreliert mit Zell-Adhäsion-Antwort und Differenzierung. Die hier vorgestellte Methode der Nanopatterning ist ein einfaches Verfahren, das auf einfache Weise zu großen Flächen skaliert werden kann. Es ist daher voll kompatibel mit Zelle Kultur Protokolle und kann auch auf andere Liganden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.

Einleitung

Hier beschreiben wir eine einfache und vielseitige Dendrimer-basierte Nanopatterning Prozedur Zelloberflächen Kultur zu erhalten, die der Kontrolle der lokalen Haftfähigkeit im Nanobereich zu ermöglichen. Nanoskalige Details der ECM-Organisation wurden gemeldet,1,2,3 und die Nanopatterning der Zelle Klebeflächen hat tiefe Einblicke in die zellulären Anforderungen in Bezug auf Haftung4zur Verfügung gestellt, 5. Experimente mit Mizellen Lithographie-basierte Nanopatterns ergab einen Schwellenwert von etwa 70 nm für RGD Peptid Nanospacing, Zelladhäsion verzögert deutlich über diesem Wert6,7,8 ,9. Diese Studien hervorgehoben, auch die größeren Einfluss der lokalen als globale Liganden Dichte Zelle Adhäsion9,10,11.

Während der Morphogenese auslösen Zell-Interaktionen mit der Umgebung die ersten Differenzierung Ereignisse, die fortfahren, bis endgültige komplexer Gewebestrukturen gebildet haben. In diesem Rahmen wurden Nanopatterned Oberflächen gegen den Einfluss der anfänglichen Zelloberfläche Interaktionen auf Morphogenese verwendet. Lithographie-basierte RGD Nanopatterns mit einem seitlichen Abstand von 68 nm in β-Typ Ti-40Nb Legierungen Hilfe weiterhin die undifferenzierten Phänotyp nicht begangen Stammzellen12, während RGD Nanospacings der zwischen 95 und 150 nm die Differenzierung der erhöhen mesenchymale Stammzellen (MSCs) in Richtung adipogenen/osteogene13,14,15 und Chondrogenic Schicksale16. Auch wurden selbstorganisierende Makromoleküle mit Signalisierung Komponenten geändert, Zelladhäsion und Differenzierung zu lenken, durch die Bereitstellung von nanoskaligen architektonische Verordnung der Signalisierung Cues17gezeigt. In diesem Zusammenhang wurde die Ablagerung von Dendrimere mit Zelle Interaktion Moieties in ihre äußere Kugel18,19,20 auf Oberflächen verwendet, um die Zelle Adhäsion21,22zu studieren, Morphologie23,24und Migration Veranstaltungen25,26. Allerdings erschwert der Mangel an Oberflächencharakterisierung in diesen Studien keinen Zusammenhang zwischen Dendrimer Oberflächengestaltung und Zell-Antwort zu etablieren.

Dendrimer-Nanopatterns mit Flüssigkeit-wie Ordnung und definierten Abstand erhalten Sie beim Dendrimere aus Lösungen mit geringen Ionischen stärken zu niedrig geladene Oberflächen adsorbieren. 27 auf der Grundlage dieser Eigenschaft, hier präsentieren wir eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns RGD funktionalisiert Dendrimere auf Low-geladene Oberflächen zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale RGD Oberflächendichte ermöglichen. Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und Scannen Sonde Mikroskopie-Techniken (STM und AFM Nanopatterns) zeigen, dass lokale Liganden dichten ändern die anfängliche Dendrimer-Konzentration in Lösung angepasst werden können. Die lokalen RGD Oberflächendichte ist durch Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände von AFM Bilder quantifiziert und dann mit Zellexperimente korreliert. Verglichen mit anderen Nanopatterning Techniken4, Dendrimer-basierten Nanopatterning ist unkompliziert und kann leicht bis auf großen Flächen, so wird voll kompatibel mit Zelle Kultur Anwendungen skaliert werden. Nanopatterns werden als bioaktive Substrate zur Bewertung der Wirkung der lokalen RGD Oberfläche Dichte Zelle Adhäsion28 und auf die Chondrogenic Induktion der Erwachsenen menschlichen MSCs-29. Unsere Ergebnisse zeigen, dass RGD Dendrimer-basierte Nanopatterns Zelle Wachstum aufrechtzuerhalten und Zelladhäsion durch hohe lokale RGD Oberfläche dichten verstärkt wird. In den Experimenten Differenzierung begünstigt intermediate Haftfähigkeit der Zellen auf den Substraten MSC Kondensation und frühen Chondrogenic Differenzierung. Wegen der Leichtigkeit, mit welcher, die Dendrimer Randgruppen geändert werden können, kann die hier beschriebene Methode zu anderen ECM-Liganden erweitert werden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.

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Protokoll

(1) Substrataufbereitung

  1. 1,4 x 1,1 cm Au(111) auf Glimmer Substraten glühen.
    1. Ein Glaskeramik-Kochfeld setzen Sie Au(111) Substrat auf und Tempern Sie es mit Butan Flamme für 3 min. zulassen das Substrat unter Argon Atmosphäre abkühlen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Au(111) Substrat.
      Hinweis: Au(111) Substrate sollten sofort nach dem Glühen verwendet werden.
  2. Vorbereitung von Poly (L-Milchsäure) (PLLA)-beschichtete Glassubstrate.
    1. Schneiden Sie und waschen Sie den Objektträger.
      1. Geschnitten Sie Mikroskopie-Folien in 18 Folien von 1,25 x 1,25 cm mit einem Diamant-Tip-Cutter. Machen Sie eine kleine Einbuchtung auf der unteren Seite der einzelnen Folien, so dass die oberen und unteren Seiten später unterschieden werden können.
      2. Waschen Sie die Folien mit entionisiertem Wasser, gefolgt von 96 % igem Ethanol. An der Luft trocknen lassen.
    2. Bereiten Sie die 2 % PLLA Lösung.
      1. 10 mL 1,4-Dioxan in ein Druckrohr 200 mg PLLA hinzufügen. Fügen Sie eine Stir Bar und verschließen Sie das Röhrchen fest.
      2. Legen Sie die Druckleitung in ein Glycerin-Bad auf einer heißen Platte bei 60 ° C unter schonenden rühren für 24 h, und übertragen Sie dann die Lösung auf eine 15-mL-Glasflasche.
    3. Beschichtung der Glas-Objektträger mit den PLLA Lösung.
      1. Legen Sie den Objektträger und das Fläschchen mit der Lösung PLLA auf einer sauberen Herdplatte bei 60 ° C. Stellen Sie sicher, legen Sie die Folien nach oben und lassen sie für mindestens 10 min bis zum Erreichen der erforderlichen Temperatur bleiben.
      2. Bereiten Sie der Spin Coater vor und stellen Sie das Programm, die in Tabelle 1angegeben.
      3. Legen Sie eine der Folien aufgedeckten auf der Spin Coater, mit Hilfe eines Vakuum-Systems. Gelten Sie mit einer Pasteurpipette 0,25 mL der PLLA Lösung für die Folie, um sicherzustellen, dass die ganze Oberfläche bedeckt ist. Führen Sie das Programm der Beschichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Folie.

(2) Dendrimer-Nanopatterning

  1. Vorbereitung der RGD funktionalisiert Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 -Lösungen.
    1. 5 mg Dendrimer in 6,494 mL entionisiertem Wasser auflösen. Dies ist Lösung A.
      Hinweis: Verwenden Sie Dendrimer-Stammlösung innerhalb von 6 Monaten der Vorbereitung.
    2. Beschallen Sie Lösung A 10 min und erarbeiten Sie Lösungen B und C nach Tabelle 2.
    3. Beschallen Sie Lösung C für 10 min und erarbeiten Sie Lösungen, D, E und F nach Tabelle 2.
    4. Lösungen B, C, D, E und F bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern. Lösung A kann bei-20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
  2. Nanopatterning RGD-Cys-D1 Dendrimere auf den Substraten
    1. In einer Gewebekultur Kapuze Sterilisieren der Substrate durch Bestrahlen sie mit UV-Licht für 13 min..
      Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn Nanopatterned Substrate werden als Zelle Kultursubstrate verwendet werden. In diesem Fall erhalten Sie die sterilen Bedingungen (Gewebekultur Haube, Sterilgut, Lösungen und Techniken) für die folgenden Schritte.
    2. Platzieren Sie jedes Substrat aufgedeckt in den Vertiefungen der Platte, Umgang mit ihnen vorsichtig mit einer Pinzette.
    3. Beschallen Sie Lösungen B, C, D, E und F für 10 min.
    4. Übergeben Sie die RGD-Cys-D1-Dendrimer-Lösungen durch einen 0,22 µm Durchmesser Filter mit einer Spritze direkt in den Vertiefungen, die mit den Substraten (2 mL/Na). Mindestens drei Replikate pro Dendrimer-Konzentration werden empfohlen. Schließen und die Dichtplatte und lassen es bei Raumtemperatur (RT) für 16 h.
    5. Entfernen Sie und entsorgen Sie die Lösungen. Waschen Sie die Substrate mit sterilem entionisiertem Wasser und trocken. Substraten bei 4 ° c lagern
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Vorbereitung der Kontrolle Substrate

Hinweis: Alle Schritte wurden durchgeführt in einer sterilen Gewebekultur Kapuze und nur sterile Materialien, Lösungen und Techniken wurden verwendet. Zumindest Steuern sechs Substrate verwendet (drei Nachbauten der Positivkontrolle) und drei Nachbildungen von der negativen Kontrolle waren.

  1. In einer Gewebekultur Kapuze Sterilisieren der Substrate durch Bestrahlen sie mit UV-Licht für 13 min..
  2. Kontrolle-Substrate für Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Verwenden Sie Flamme geglüht Au(111) Substrate als die negativ-Kontrolle. Gold hat eine bekannte Protein-Denaturierung Wirkung, die Anti-Zelle Klebeeigenschaften28verleiht. Alle Lösungen zu beschallen und vor Substratinkubation zu filtern.
    2. Tauchen Sie für die Positivkontrollen Flamme geglüht Au(111) Substrate in einer Lösung von RGD-modifizierte PEG Thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene Glykol Mono-11-Mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 und Triethylene Glycol ein Mono-11-Mercaptoundecyl Äther (PEG-SH) in einem Molverhältnis von 1: 100 in 96 % igem Ethanol für 16 h bei RT
    3. Waschen Sie Substrate in Ethanol gründlich und trocknen Sie sie mit Argon. Substraten bei 4 ° c lagern
  3. Kontrolle-Substrate für werden.
    1. Verwenden Sie unberührte PLLA Substrate als die negativ-Kontrolle. Ohne jede Oberflächenbehandlung zeigt PLLA schlechte Anbindung an lebenden Zellen. 31
    2. Bereiten Sie für die Positivkontrollen 5 mL 0,1 mg/mL Fibronektin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie jedes PLLA Substrat mit 1,6 mL der Fibronektin-Lösung für 1 h bei RT
    3. Entfernen und entsorgen der Fibronektin-Lösung und die Substrate mit PBS waschen. Substraten bei 4 ° c lagern

4. Oberflächencharakterisierung

  1. AFM Imaging
    1. Durchführen Sie AFM-Bildgebung von PLLA Substraten für eine Rauheit-Analyse. Da Dendrimere einen Durchmesser von 4-5 nm, Rauheiten von 1 haben nm erhalten Sie für die richtige Darstellung der Nanopatterns. Außerdem führen Sie AFM Imaging von der Nanopatterns. Führen Sie in beiden Fällen AFM bei der Erschließung von Modus in Luft.
    2. Wählen Sie ein Silizium-Freischwinger mit einem Frühling Konstante k = 40 N/m und einer Resonanzfrequenz ν = 300 kHz und montieren Sie es auf die AFM-Ausrüstung.
    3. Montieren Sie die Probe auf der Bühne das Rasterkraftmikroskop. Je nach Aufbau des Apparates variieren tuning und imaging-Spezifikationen. Wenden Sie sich an den Hersteller-Handbuch.
    4. Die Probe mit der Spitze des Mikroskops bis zum Kontakt zu nähern.
    5. Um PLLA für Rauheit Analyse Bild, wählen Sie mindestens vier repräsentative Bereiche von 20 x 20 µm pro Substrat aus drei unabhängigen Substrate. Bild Dendrimer-Nanopatterns, wählen mindestens drei repräsentative Bilder von 5 × 5 µm pro Substrat aus drei unabhängigen Substraten pro Zustand (erste Dendrimer-Konzentration in Lösung). Um Beschädigungen der Dendrimer-Schicht während der Bildgebung zu vermeiden, stellen Sie den Sollwert um die Kraft auf ein Minimum zu halten.
      Hinweis: Die Wahl der imaging-Bereich hängt auch von der Arbeitsbereich des piezoelektrischen Scanners. Bitte konsultieren Sie das Instrument Handbuch in dieser Hinsicht.
    6. Prozess die AFM-Höhe durch den Einbau Bilder jeder Messbahn, Polynom-Funktionen mit der proprietären Software des Herstellers des AFM Apparates Planieren und analysieren von PLLA, Oberflächenrauhigkeit zu berechnen. Root-Mean-Square (RMS) Analyse kann eine geeignete Option bieten.
  2. Lokalen RGD Oberfläche Dichtemessung.
    1. Erhalten Sie die Bild-Schwellenwerte der verarbeiteten AFM Höhe Bilder der Dendrimere auf der Oberfläche auswählen.
    2. Bestimmen Sie die Partikelpositionen mit Bildverarbeitungs-Software und nutzen sie, um die Oberflächenkräfte Mindestabstände (dmin) zu erhalten.
    3. Plot- d-min -Werte in Z , um die entsprechenden Partikelpositionen die Wahrscheinlichkeit Konturkarten dminzu erhalten. Passen Sie die Farbskala des Grundstücks, die Regionen des höchsten lokalen RGD Oberflächendichte (dmin < 70 nm) zu visualisieren.
    4. Das Gebiet der Regionen mit der höchsten lokalen RGD Oberfläche Dichte mit einer Bildbearbeitungssoftware zu quantifizieren. Die Bereichen Dendrimer-Aggregate in die Berechnung einbeziehen.
  3. STM-Bildgebung.
    Hinweis: STM-Bildgebung kann nur für Nanopatterns auf leitfähigen Au(111) Substraten durchgeführt werden. Messungen erfolgen in Luft.
    1. Legen Sie das Nanopatterned Substrat in der Probenhalter der STM-Ausrüstung. Überprüfen Sie die elektrische Verbindung zwischen Probe und Halter mit einem Testgerät.
    2. Etch ein Trinkgeld von ausgewählten Sondenmaterial (i.e. PT 0,8: Ir 0,2) mit einem Durchmesser, die ordnungsgemäße Montage auf den Kopf der STM Ausrüstung gewährleistet. Ätzen kann entweder durch manuelles Schneiden oder durch elektrochemische Ätzung erfolgen. 32
      Hinweis: Elektrochemische Ätzen macht mehr symmetrischen Tipps.
    3. Montieren Sie die Spitze in den Kopf der STM-Ausrüstung und verbinden Sie die Probe.
    4. Set "ausgewählt" in den Rückkanal (in dieser Art der Messstrom, werden ständig durch Feedback-tuning). Passen Sie die Bias-Spannung und aktuellen Sollwert und Scangröße, ein gut gelöst Bild zu erhalten, sobald die Spitze beschäftigt ist.
      Hinweis: Die Wahl der imaging-Bereich hängt auch von der Arbeitsbereich des piezoelektrischen Scanners. Bitte konsultieren Sie das Instrument Handbuch in dieser Hinsicht.
    5. Prozess die STM topographische Bilder durch den Einbau jeder Scan-Linie um Polynom Nivellierung funktioniert die proprietäre Software des Herstellers des Geräts STM.
  4. CA-Messungen.
    1. Maß CA der Nanopatterned Substrate durch sessile-Drop-Methode an drei verschiedenen Positionen auf drei unabhängige Substraten pro Zustand (erste Dendrimer-Konzentration in Lösung) mit einem optischen CA-System.
    2. Füllen Sie die Microsyringe mit entionisiertem Wasser und legen Sie die Parameter in der CA-Software, Tropfen von 1 µL zu produzieren.
    3. Legen Sie die Probe auf der Bühne, so dass die Oberfläche der Probe deutlich sichtbar auf dem Computer für die Bildgebung ist.
    4. Die Spritze mit dem Mikromanipulator zu bewegen, bis es in der Nähe der Oberfläche bekommt und die Tropfen auf die Oberfläche. Nehmen Sie das Bild sofort nach Tröpfchen Stabilisierung.
      Hinweis: In CA-Messungen ist es sehr wichtig, die Feuchtigkeit zu regulieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
    5. Analysieren Sie die CAs mit der proprietären Software des Herstellers des Geräts CA gemessen. Die passende Methode kann an Benutzeranforderungen angepasst werden. Die elliptische Anpassungsmethode kann eine Option sein.

5. die Zellkultur

Hinweis: Alle Schritte wurden durchgeführt in einer Gewebekultur Kapuze und nur sterile Materialien, Lösungen und Techniken wurden verwendet.

  1. Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Kultur NIH-3 t 3 Maus embryonale Fibroblasten aus frühen Passagen (< 10) bei 37 ° C und 4,6 % CO2 Atmosphäre im basalen Medium mit hoher Glucose ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % Natrium Pyruvat (Wachstumsmedium). T75 Flaschen für eine totale Aussaat von 500.000 Zellen pro Flasche 10 ml Wachstumsmedium werden empfohlen.
    2. Entfernen Sie altes Medium mit einer 10 mL-Pipette alle 2 Tage zu und ersetzen Sie mit 10 mL frisch zubereitete Wachstumsmedium.
    3. Zellkulturen in das Wachstumsmedium bis sie rund um 80 % Zusammenfluss, dann entfernen Sie das Medium erreichen und 5 mL Trypsin pro Flasche. Um die richtige Zelle Loslösung von der Unterseite des Kolbens zu gewährleisten, pflegen Sie die Trypsin-Lösung in Kontakt mit den Zellen für 5 min bei 37 ° C.
    4. Geben Sie 5 mL Wachstumsmedium pro Flasche hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen bei 470 X g für 5 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Wachstumsmedium. Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
    5. Übertragen Sie die Substrate auf Platten nicht für Gewebekultur (nicht haftend) behandelt.
    6. Die Zellen der Substrate bei einer Dichte von 4.000 Zellen/cm2 im Wachstumsmedium Saatgut und inkubieren sie 4,5 h bei 37 ° C und 10 % CO2 -Atmosphäre.
  2. Chondrogenic Induktion der MSCs.
    1. Kultur menschlichen MSCs aus frühen Passagen (< 5) bei 37 ° C und 4,6 % CO2 Atmosphäre im MSC Wachstumsmedium. T75 Flaschen für eine totale Aussaat von 500.000 Zellen pro Flasche 10 ml Wachstumsmedium werden empfohlen.
    2. Ändern Sie Medium alle 3 Tage (siehe 5.1.2).
    3. Trypsinize Zellen vor dem Zusammenfluss von 80 % erreicht ist, und Zentrifugieren und Aufschwemmen sie im MSC Wachstumsmedium (siehe 5.1.3). Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder und aufzuwirbeln sie in 10 mL Medium werden-induzierende.
    5. Übertragen Sie die Substrate von den Platten auf neue well-Platten nicht für Gewebekultur (nicht haftend) behandelt. Samen der Zellen auf den Substraten bei einer Dichte von 3.000 Zellen/cm2.
    6. Ändern Sie das Chondrogenic Medium alle 3 Tage (siehe 5.1.2).

6. Zelle Fixierung und Immunostaining

Hinweis: Die folgenden Schritte können in nicht-sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen sanft mit PBS. Beheben sie durch Zugabe von 10 % Formalin Lösung für 20 min bei RT
  2. Entfernen Sie das Formalin und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Die freien Aldehyd-Gruppen durch Hinzufügen einer 50 mM-Lösung von Ammoniumchlorid (NH4Cl) mit PBS-Puffer zu blockieren. Lassen Sie die Zellen für 20 min bei RT entfernen NH4Cl-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° c lagern
  4. Entfernen Sie PBS und permeabilize der Zellen durch Hinzufügen einer 0,1 % igen Lösung von Saponin in die blockierende Lösung (1 % Albumin mit PBS-Puffer) für 10 min am RT. Wash die Zellen mit PBS und Proben zu einem neuen well-Platte zu übertragen.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit einer Lösung aus primären Antikörper in der blockierenden Lösung (Tabelle 3) für 1 h bei RT Dann entfernen Sie die primären Antikörper-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit sekundären Antikörper in der blockierenden Lösung (Tabelle 3) für 1 h bei RT
    Hinweis: Vermeiden Sie Licht Exposition.
  7. Die sekundäre Antikörper-Lösung entfernen und Waschen der Zellen mit PBS und trocken.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C im Dunkeln.
  8. Probe-Halterung für Mikroskop Beobachtung: mit einem Diamant-Tip-Cutter, gelten 50 µL 1,25 x 1,25 cm. Montage Medium auf die Proben-Mikroskopie Deckgläsern geschnitten und bedecken Sie sie sanft mit der geschliffenen Deckgläsern.
  9. Übertragen Sie die Proben auf einen bequemen Empfänger, bedecken Sie es mit Alufolie und Store im Dunkeln bei 4 ° C bis Beobachtung.

7. Zell-Imaging und Datenanalyse

Hinweis: Für undurchsichtige Au(111) und Dicke Objektträger-basierte Substrate, muss eine aufrechte Mikroskop verwendet werden.

  1. Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Verwendung eines Mikroskops Epifluoreszenz ausgestattet mit einer digitalen Kamera und Low (also 10 X) und hohen (d.h. 40 X) Vergrößerung Ziele. Führen Sie Messungen in Luft.
    2. Legen Sie die Probe auf der Bühne und Bild Zellkerne mit 10 X-Objektiv mit einer ultravioletten Erregung, Langpass-Emission Filter, Hoechst/DAPI Fleck zu visualisieren.
    3. Bild Zelle Cytoskelett und fokale Adhäsionen (FAs) mit dem Ziel, 40 X, Auswahl des Mikroskop-Filters, der die entsprechenden Antikörper Fluorochrom-Spezifikationen entspricht.
    4. Verwenden Sie für FA-Quantifizierung Bildverarbeitungs-Software, um Bilder in 8-Bit-Dateien zu konvertieren. Entfernen Sie die Hintergrund und konvertiert Bilder in Binary durch das Festlegen eines Schwellenwerts. Mindestens 30 Bilder pro Probe zu berechnen und FAs von 1 µm-2 für die Berechnung zu berücksichtigen.
  2. Chondrogenic Induktion der MSCs.
    1. Bild Zelle Kondensate in der Anfangsphase der Chondrogenic Induktion (< 5 Tage) mit einem aufrechten Epifluoreszenz Mikroskop, ausgestattet mit einer Digitalkamera und einem niedrigen (z.B. 10 X) Vergrößerung Ziel. Ultraviolett Anregung und Langpass-Emission Filter verwenden, Hoechst/DAPI Fleck zu visualisieren.
    2. Für die Messung der Kondensat-Bereich, eine Bildverarbeitungssoftware, umwandeln Sie Bilder in 8-Bit-Dateien, entfernen Sie den Hintergrund und wählen Sie eine Schwelle, die die aggregierte Kontur unterstreicht. Berechnen Sie die Fläche der Partikel.
    3. Bild Immunostained Proben für FAs, Zellskelett Aktin Fasern und Knorpel-spezifische Kollagen Typ II Alpha 1 (COL2A1) mit einer aufrechten confocal Mikroskop bei hoher Vergrößerung (z.B. 40-60 X). Sammeln Sie Abschnitte in einem repräsentativen Intervall (d.h. 0,5 – 1 µm).
    4. Um den Stapel zu verarbeiten, verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm. Bilder in 8-Bit-Dateien umwandeln, den Hintergrund zu entfernen und durch das Festlegen eines Schwellenwerts Binär zu machen. Ein Minimum von drei Zelle Kondensate pro Zustand der drei unabhängige Stichproben zu behandeln.
    5. Das FA-Protein gefärbten Bereiche aus der basalen Zone der Zelle Kondensate zu quantifizieren und als der entsprechende Anteil der Fläche geteilt durch die Anzahl der Zellkerne im Bild auszudrücken.
    6. Zur Messung der COL2A1 Färbung verwenden Sie konfokale Z-Projektionen und quantifizieren Sie die Summe der projizierten Fläche (maximale COL2A1 Fläche pro Probe) zu. Den Bereichswert gegen den Bereich des entsprechenden Kondensats zu normalisieren.

(8) Quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)-Analyse

Hinweis: Um RNase-Kontamination zu verhindern, verwenden Sie Einweg, steril Kunststoff Ware und Einweg-Handschuhe beim Umgang mit Reagenzien und RNA. Immer verwenden Sie richtige mikrobiologische aseptische Techniken und eine entsprechende Dekontaminationslösung RNase Kontamination von Arbeitsflächen und nicht-Einweg-Artikel wie Zentrifugen und Pipetten entfernen.

  1. Gesamt-RNS zu isolieren und in einer RNA-Disruptor zu pulverisieren. Behandeln Sie RNA-Proben mit DNase zu, und wandeln sie in cDNA mit einem cDNA Synthese-Kit.
  2. Durchführung von qRT-PCR unter Verwendung Zündkapseln für den Transkriptionsfaktor SOX9. Beta-2-Mikroglobulin (B2M) und ribosomale Protein L13a (RPL13a) kann als Housekeeping-Gene verwendet werden.
  3. Berechnen Sie die Ausdruck Ebenen und gegen die negativ-Kontrolle (PLLA) zu normalisieren.

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Ergebnisse

Wir präsentieren eine Nanopatterning Methode, die Oberfläche Haftfähigkeit auf der Nanoebene (Abbildung 1) angesprochen werden kann. Die chemische Struktur der RGD-Cys-D1 zeigt Abbildung 1A. Dendrimere wurden auf elektrische leitende Au(111) Oberflächen für hochauflösende STM Charakterisierung gemustert. Niedrige Dendrimer-Konzentrationen in Lösung (bis zu 10-5% w/w) gerendert isoliert Dendrimere 4-5 Nm im Dur...

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Diskussion

Bei der Entwicklung des Protokolls beschrieben sollte eine Reihe von kritischen Schritte berücksichtigt werden. Die erste bezieht sich auf Nanopattern Charakterisierung mit Scan-Sonde-Mikroskopie-Techniken. Um die Nanopatterns sichtbar zu machen, muss die Oberfläche, wo Musterung entsteht liegt der Rauheitswert unterhalb der mittlere Durchmesser der Dendrimere, was ungefähr 4 – 5 nm gemessen an STM (Abbildung 1 b). Auch sollte berücksichtigt werden, dass hochauflösende STM Bildgebung auf leitfähigen Subs...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren erkennen Oriol Font-Bach und Albert G. Castaño für ihre Hilfe bei dmin Quantifizierung. Sie erkennen auch die erweiterte digitale Mikroskopie Einheit am Institut für Forschung in der Biomedizin (IRB Barcelona), die Autoren, die das Video in ihren Räumlichkeiten aufnehmen zu lassen. Diese Arbeit wurde durch die Vernetzung Biomedical Research Center (CIBER), Spanien unterstützt. CIBER ist eine Initiative der VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programm, CIBER Aktionen und das Instituto de Salud Carlos III, mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung für Innovation, Universitäten und Unternehmen von der Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Es wurde auch von den Projekten OLIGOCODES (Nr. finanziert. MAT2012-38573-C02) und CTQ2013-41339-P, verliehen durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit, zusätzlich zu INTERREG V-A Spanien / Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkennt finanziellen Unterstützung vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit gewähren (No. IFI15/00151).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gold (111) auf Glimmer. 1,4x1,1 cm Spi Supplies466PS-AB
Glas-Objektträger, glattCorning2947-75x25
Deionisiertes WasserMillipore18MΩ cm
Ethanol 96%PanReac131085.1212
L-Lactid/DL-Lactid CopolymerCorbion95/05 molare Übersetzung
1,4 - DioxanSigma-Aldrich296309-1L
Silikonöl, HochtemperaturAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Laminar-Flow-Haube für GewebekulturenTelstarBio II AdvanceKlasse II biologische Sicherheitswerkbank
FiltereinheitMillex-GPSLGP033RB0,22 µ m
Spritze 10 mLDiscardit309110
RasterkraftmikroskopVeeco InstrumentsDimension 3000 AFM-Instrument
Silikon-AFM-SondenBudget SensorsTap300AI-GResonanzfrequenz 300 kHz, k = 40 N/m
RastertunnelmikroskopMolekulare BildgebungPicoSPM-Mikroskop
Pt0,8:Ir0,2 DrahtAdventPT671012Durchmesser 0,25 mm
WSxM 4.0 SoftwareNanotec electronica
Optisches Kontaktwinkelsystem (CA) Dataphysics
SCA20 SoftwareDataphysics
Röntgen-PhotoelektronenspektrometerPhysikalische ElektronikPerkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronektin aus RinderplasmaSigma-AldrichF1141-1MG1,0 mL Lösung
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Gibco21600-10Pulver
Mausembryo FibroblastenATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) flüssiges flüssiges Serum mit hohem GlukosegehaltGibco11960044flüssiges Serum mit hohem Glukosegehalt, kein Glutamin, 500 mL
fötales Rinderserum (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutaminInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140
NatriumpyruvatInvitrogen11360039100 mL
T75 KulturflaschenNunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25% EDTA
ZentrifugeHermle LabortechnikZ 206 A
Nicht mit Gewebekulturen behandelte Platte, 12 WellFalcon351143Nicht adhärente
hMSCs aus FettgewebeATCCATCC PCS-500-011Zellfläschchen 1 mL
MSC BasalmediumATCCATCC PCS-500-030
MSC Growth KitATCCATCC PCS-500-040Niedriges Serum
Chondrozyten-DifferenzierungswerkzeugATCCATCC PCS-500-051
FormalinlösungSigma-AldrichHT5011-15MLneutral gepuffert, 10%
AmmoniumchloridSigma-AldrichA9434-500Gfür die Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur, ≥ 99,5%
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-Ffür die Molekularbiologie, verwendet als nichtionisches Tensid, Adjuvans
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Kaninchen monoklonal [Y113] Anti-Paxillin AntikörperAbcamab32084Verdünnt 1:200
Maus monoklonal [1F5] Anti-Kollagen alpha-1 XX Kette Acris AntikörperAM00212PU-NVerdünnt: 1:400
Alexa Fluor 488-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) SekundärantikörperInvitrogenA106672 mg/ml. Verdünnter 1:1000
Alexa Fluor 568-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-SekundärantikörperInvitrogenA110362 mg/ml. Verdünnt 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/ml. Verdünntes 1:1000
Deckglas 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
EpifluoreszenzmikroskopNikonEclipse E1000 aufrechtes Mikroskopmit CCD-Kamera
Konfokales MikroskopLeica MicrosystemsLeica SPE aufrechtes konfokales Mikroskop
ImageJ 1,50g Freeware
MATLAB-SoftwareDie MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 Software OriginLab Zusammenarbeit
http://imgej.nih.gov/ij

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