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Bioengineering

Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56347
Automatic Translation
1,2, 3,1, 1, 4,5, 4,5, 4,5, 6, 3,6, 1,3,7, 8,3, 8,3,5, 1,3,2
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

Summary

Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.

Abstract

Zelluläre Adhäsion und Differenzierung ist bedingt durch die nanoskaligen Disposition Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) mit lokalen Konzentrationen, die eine große Wirkung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns von Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) zu erhalten-funktionalisierten Dendrimere, die es die nanoskaligen Kontrolle der lokalen RGD ermöglichen Oberfläche Dichte. Nanopatterns von Oberfläche Adsorption von Dendrimere aus Lösungen in verschiedenen ursprünglichen Konzentrationen gebildet werden und zeichnen sich durch Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und scanning Mikroskopiertechniken wie z. B. Sonde Scanning tunneling Microscopy (STM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Die lokalen Oberflächendichte des RGD wird gemessen mit AFM Bilder mittels Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände und dann korreliert mit Zell-Adhäsion-Antwort und Differenzierung. Die hier vorgestellte Methode der Nanopatterning ist ein einfaches Verfahren, das auf einfache Weise zu großen Flächen skaliert werden kann. Es ist daher voll kompatibel mit Zelle Kultur Protokolle und kann auch auf andere Liganden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.

Introduction

Hier beschreiben wir eine einfache und vielseitige Dendrimer-basierte Nanopatterning Prozedur Zelloberflächen Kultur zu erhalten, die der Kontrolle der lokalen Haftfähigkeit im Nanobereich zu ermöglichen. Nanoskalige Details der ECM-Organisation wurden gemeldet,1,2,3 und die Nanopatterning der Zelle Klebeflächen hat tiefe Einblicke in die zellulären Anforderungen in Bezug auf Haftung4zur Verfügung gestellt, 5. Experimente mit Mizellen Lithographie-basierte Nanopatterns ergab einen Schwellenwert von etwa 70 nm für RGD Peptid Nanospacing, Zelladhäsion verzögert deutlich über diesem Wert6,7,8 ,9. Diese Studien hervorgehoben, auch die größeren Einfluss der lokalen als globale Liganden Dichte Zelle Adhäsion9,10,11.

Während der Morphogenese auslösen Zell-Interaktionen mit der Umgebung die ersten Differenzierung Ereignisse, die fortfahren, bis endgültige komplexer Gewebestrukturen gebildet haben. In diesem Rahmen wurden Nanopatterned Oberflächen gegen den Einfluss der anfänglichen Zelloberfläche Interaktionen auf Morphogenese verwendet. Lithographie-basierte RGD Nanopatterns mit einem seitlichen Abstand von 68 nm in β-Typ Ti-40Nb Legierungen Hilfe weiterhin die undifferenzierten Phänotyp nicht begangen Stammzellen12, während RGD Nanospacings der zwischen 95 und 150 nm die Differenzierung der erhöhen mesenchymale Stammzellen (MSCs) in Richtung adipogenen/osteogene13,14,15 und Chondrogenic Schicksale16. Auch wurden selbstorganisierende Makromoleküle mit Signalisierung Komponenten geändert, Zelladhäsion und Differenzierung zu lenken, durch die Bereitstellung von nanoskaligen architektonische Verordnung der Signalisierung Cues17gezeigt. In diesem Zusammenhang wurde die Ablagerung von Dendrimere mit Zelle Interaktion Moieties in ihre äußere Kugel18,19,20 auf Oberflächen verwendet, um die Zelle Adhäsion21,22zu studieren, Morphologie23,24und Migration Veranstaltungen25,26. Allerdings erschwert der Mangel an Oberflächencharakterisierung in diesen Studien keinen Zusammenhang zwischen Dendrimer Oberflächengestaltung und Zell-Antwort zu etablieren.

Dendrimer-Nanopatterns mit Flüssigkeit-wie Ordnung und definierten Abstand erhalten Sie beim Dendrimere aus Lösungen mit geringen Ionischen stärken zu niedrig geladene Oberflächen adsorbieren. 27 auf der Grundlage dieser Eigenschaft, hier präsentieren wir eine Methode, um groß angelegte unebenen Nanopatterns RGD funktionalisiert Dendrimere auf Low-geladene Oberflächen zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale RGD Oberflächendichte ermöglichen. Wasser Kontaktwinkel (CA), Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) und Scannen Sonde Mikroskopie-Techniken (STM und AFM Nanopatterns) zeigen, dass lokale Liganden dichten ändern die anfängliche Dendrimer-Konzentration in Lösung angepasst werden können. Die lokalen RGD Oberflächendichte ist durch Wahrscheinlichkeit Konturkarten der Oberflächenkräfte Mindestabstände von AFM Bilder quantifiziert und dann mit Zellexperimente korreliert. Verglichen mit anderen Nanopatterning Techniken4, Dendrimer-basierten Nanopatterning ist unkompliziert und kann leicht bis auf großen Flächen, so wird voll kompatibel mit Zelle Kultur Anwendungen skaliert werden. Nanopatterns werden als bioaktive Substrate zur Bewertung der Wirkung der lokalen RGD Oberfläche Dichte Zelle Adhäsion28 und auf die Chondrogenic Induktion der Erwachsenen menschlichen MSCs-29. Unsere Ergebnisse zeigen, dass RGD Dendrimer-basierte Nanopatterns Zelle Wachstum aufrechtzuerhalten und Zelladhäsion durch hohe lokale RGD Oberfläche dichten verstärkt wird. In den Experimenten Differenzierung begünstigt intermediate Haftfähigkeit der Zellen auf den Substraten MSC Kondensation und frühen Chondrogenic Differenzierung. Wegen der Leichtigkeit, mit welcher, die Dendrimer Randgruppen geändert werden können, kann die hier beschriebene Methode zu anderen ECM-Liganden erweitert werden, die Konzentration-abhängige Effekte auf Zellen ausüben.

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Protocol

(1) Substrataufbereitung

  1. 1,4 x 1,1 cm Au(111) auf Glimmer Substraten glühen.
    1. Ein Glaskeramik-Kochfeld setzen Sie Au(111) Substrat auf und Tempern Sie es mit Butan Flamme für 3 min. zulassen das Substrat unter Argon Atmosphäre abkühlen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes Au(111) Substrat.
      Hinweis: Au(111) Substrate sollten sofort nach dem Glühen verwendet werden.
  2. Vorbereitung von Poly (L-Milchsäure) (PLLA)-beschichtete Glassubstrate.
    1. Schneiden Sie und waschen Sie den Objektträger.
      1. Geschnitten Sie Mikroskopie-Folien in 18 Folien von 1,25 x 1,25 cm mit einem Diamant-Tip-Cutter. Machen Sie eine kleine Einbuchtung auf der unteren Seite der einzelnen Folien, so dass die oberen und unteren Seiten später unterschieden werden können.
      2. Waschen Sie die Folien mit entionisiertem Wasser, gefolgt von 96 % igem Ethanol. An der Luft trocknen lassen.
    2. Bereiten Sie die 2 % PLLA Lösung.
      1. 10 mL 1,4-Dioxan in ein Druckrohr 200 mg PLLA hinzufügen. Fügen Sie eine Stir Bar und verschließen Sie das Röhrchen fest.
      2. Legen Sie die Druckleitung in ein Glycerin-Bad auf einer heißen Platte bei 60 ° C unter schonenden rühren für 24 h, und übertragen Sie dann die Lösung auf eine 15-mL-Glasflasche.
    3. Beschichtung der Glas-Objektträger mit den PLLA Lösung.
      1. Legen Sie den Objektträger und das Fläschchen mit der Lösung PLLA auf einer sauberen Herdplatte bei 60 ° C. Stellen Sie sicher, legen Sie die Folien nach oben und lassen sie für mindestens 10 min bis zum Erreichen der erforderlichen Temperatur bleiben.
      2. Bereiten Sie der Spin Coater vor und stellen Sie das Programm, die in Tabelle 1angegeben.
      3. Legen Sie eine der Folien aufgedeckten auf der Spin Coater, mit Hilfe eines Vakuum-Systems. Gelten Sie mit einer Pasteurpipette 0,25 mL der PLLA Lösung für die Folie, um sicherzustellen, dass die ganze Oberfläche bedeckt ist. Führen Sie das Programm der Beschichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Folie.

(2) Dendrimer-Nanopatterning

  1. Vorbereitung der RGD funktionalisiert Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 -Lösungen.
    1. 5 mg Dendrimer in 6,494 mL entionisiertem Wasser auflösen. Dies ist Lösung A.
      Hinweis: Verwenden Sie Dendrimer-Stammlösung innerhalb von 6 Monaten der Vorbereitung.
    2. Beschallen Sie Lösung A 10 min und erarbeiten Sie Lösungen B und C nach Tabelle 2.
    3. Beschallen Sie Lösung C für 10 min und erarbeiten Sie Lösungen, D, E und F nach Tabelle 2.
    4. Lösungen B, C, D, E und F bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern. Lösung A kann bei-20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
  2. Nanopatterning RGD-Cys-D1 Dendrimere auf den Substraten
    1. In einer Gewebekultur Kapuze Sterilisieren der Substrate durch Bestrahlen sie mit UV-Licht für 13 min..
      Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn Nanopatterned Substrate werden als Zelle Kultursubstrate verwendet werden. In diesem Fall erhalten Sie die sterilen Bedingungen (Gewebekultur Haube, Sterilgut, Lösungen und Techniken) für die folgenden Schritte.
    2. Platzieren Sie jedes Substrat aufgedeckt in den Vertiefungen der Platte, Umgang mit ihnen vorsichtig mit einer Pinzette.
    3. Beschallen Sie Lösungen B, C, D, E und F für 10 min.
    4. Übergeben Sie die RGD-Cys-D1-Dendrimer-Lösungen durch einen 0,22 µm Durchmesser Filter mit einer Spritze direkt in den Vertiefungen, die mit den Substraten (2 mL/Na). Mindestens drei Replikate pro Dendrimer-Konzentration werden empfohlen. Schließen und die Dichtplatte und lassen es bei Raumtemperatur (RT) für 16 h.
    5. Entfernen Sie und entsorgen Sie die Lösungen. Waschen Sie die Substrate mit sterilem entionisiertem Wasser und trocken. Substraten bei 4 ° c lagern
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Vorbereitung der Kontrolle Substrate

Hinweis: Alle Schritte wurden durchgeführt in einer sterilen Gewebekultur Kapuze und nur sterile Materialien, Lösungen und Techniken wurden verwendet. Zumindest Steuern sechs Substrate verwendet (drei Nachbauten der Positivkontrolle) und drei Nachbildungen von der negativen Kontrolle waren.

  1. In einer Gewebekultur Kapuze Sterilisieren der Substrate durch Bestrahlen sie mit UV-Licht für 13 min..
  2. Kontrolle-Substrate für Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Verwenden Sie Flamme geglüht Au(111) Substrate als die negativ-Kontrolle. Gold hat eine bekannte Protein-Denaturierung Wirkung, die Anti-Zelle Klebeeigenschaften28verleiht. Alle Lösungen zu beschallen und vor Substratinkubation zu filtern.
    2. Tauchen Sie für die Positivkontrollen Flamme geglüht Au(111) Substrate in einer Lösung von RGD-modifizierte PEG Thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene Glykol Mono-11-Mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 und Triethylene Glycol ein Mono-11-Mercaptoundecyl Äther (PEG-SH) in einem Molverhältnis von 1: 100 in 96 % igem Ethanol für 16 h bei RT
    3. Waschen Sie Substrate in Ethanol gründlich und trocknen Sie sie mit Argon. Substraten bei 4 ° c lagern
  3. Kontrolle-Substrate für werden.
    1. Verwenden Sie unberührte PLLA Substrate als die negativ-Kontrolle. Ohne jede Oberflächenbehandlung zeigt PLLA schlechte Anbindung an lebenden Zellen. 31
    2. Bereiten Sie für die Positivkontrollen 5 mL 0,1 mg/mL Fibronektin in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie jedes PLLA Substrat mit 1,6 mL der Fibronektin-Lösung für 1 h bei RT
    3. Entfernen und entsorgen der Fibronektin-Lösung und die Substrate mit PBS waschen. Substraten bei 4 ° c lagern

4. Oberflächencharakterisierung

  1. AFM Imaging
    1. Durchführen Sie AFM-Bildgebung von PLLA Substraten für eine Rauheit-Analyse. Da Dendrimere einen Durchmesser von 4-5 nm, Rauheiten von 1 haben nm erhalten Sie für die richtige Darstellung der Nanopatterns. Außerdem führen Sie AFM Imaging von der Nanopatterns. Führen Sie in beiden Fällen AFM bei der Erschließung von Modus in Luft.
    2. Wählen Sie ein Silizium-Freischwinger mit einem Frühling Konstante k = 40 N/m und einer Resonanzfrequenz ν = 300 kHz und montieren Sie es auf die AFM-Ausrüstung.
    3. Montieren Sie die Probe auf der Bühne das Rasterkraftmikroskop. Je nach Aufbau des Apparates variieren tuning und imaging-Spezifikationen. Wenden Sie sich an den Hersteller-Handbuch.
    4. Die Probe mit der Spitze des Mikroskops bis zum Kontakt zu nähern.
    5. Um PLLA für Rauheit Analyse Bild, wählen Sie mindestens vier repräsentative Bereiche von 20 x 20 µm pro Substrat aus drei unabhängigen Substrate. Bild Dendrimer-Nanopatterns, wählen mindestens drei repräsentative Bilder von 5 × 5 µm pro Substrat aus drei unabhängigen Substraten pro Zustand (erste Dendrimer-Konzentration in Lösung). Um Beschädigungen der Dendrimer-Schicht während der Bildgebung zu vermeiden, stellen Sie den Sollwert um die Kraft auf ein Minimum zu halten.
      Hinweis: Die Wahl der imaging-Bereich hängt auch von der Arbeitsbereich des piezoelektrischen Scanners. Bitte konsultieren Sie das Instrument Handbuch in dieser Hinsicht.
    6. Prozess die AFM-Höhe durch den Einbau Bilder jeder Messbahn, Polynom-Funktionen mit der proprietären Software des Herstellers des AFM Apparates Planieren und analysieren von PLLA, Oberflächenrauhigkeit zu berechnen. Root-Mean-Square (RMS) Analyse kann eine geeignete Option bieten.
  2. Lokalen RGD Oberfläche Dichtemessung.
    1. Erhalten Sie die Bild-Schwellenwerte der verarbeiteten AFM Höhe Bilder der Dendrimere auf der Oberfläche auswählen.
    2. Bestimmen Sie die Partikelpositionen mit Bildverarbeitungs-Software und nutzen sie, um die Oberflächenkräfte Mindestabstände (dmin) zu erhalten.
    3. Plot- d-min -Werte in Z , um die entsprechenden Partikelpositionen die Wahrscheinlichkeit Konturkarten dminzu erhalten. Passen Sie die Farbskala des Grundstücks, die Regionen des höchsten lokalen RGD Oberflächendichte (dmin < 70 nm) zu visualisieren.
    4. Das Gebiet der Regionen mit der höchsten lokalen RGD Oberfläche Dichte mit einer Bildbearbeitungssoftware zu quantifizieren. Die Bereichen Dendrimer-Aggregate in die Berechnung einbeziehen.
  3. STM-Bildgebung.
    Hinweis: STM-Bildgebung kann nur für Nanopatterns auf leitfähigen Au(111) Substraten durchgeführt werden. Messungen erfolgen in Luft.
    1. Legen Sie das Nanopatterned Substrat in der Probenhalter der STM-Ausrüstung. Überprüfen Sie die elektrische Verbindung zwischen Probe und Halter mit einem Testgerät.
    2. Etch ein Trinkgeld von ausgewählten Sondenmaterial (i.e. PT 0,8: Ir 0,2) mit einem Durchmesser, die ordnungsgemäße Montage auf den Kopf der STM Ausrüstung gewährleistet. Ätzen kann entweder durch manuelles Schneiden oder durch elektrochemische Ätzung erfolgen. 32
      Hinweis: Elektrochemische Ätzen macht mehr symmetrischen Tipps.
    3. Montieren Sie die Spitze in den Kopf der STM-Ausrüstung und verbinden Sie die Probe.
    4. Set "ausgewählt" in den Rückkanal (in dieser Art der Messstrom, werden ständig durch Feedback-tuning). Passen Sie die Bias-Spannung und aktuellen Sollwert und Scangröße, ein gut gelöst Bild zu erhalten, sobald die Spitze beschäftigt ist.
      Hinweis: Die Wahl der imaging-Bereich hängt auch von der Arbeitsbereich des piezoelektrischen Scanners. Bitte konsultieren Sie das Instrument Handbuch in dieser Hinsicht.
    5. Prozess die STM topographische Bilder durch den Einbau jeder Scan-Linie um Polynom Nivellierung funktioniert die proprietäre Software des Herstellers des Geräts STM.
  4. CA-Messungen.
    1. Maß CA der Nanopatterned Substrate durch sessile-Drop-Methode an drei verschiedenen Positionen auf drei unabhängige Substraten pro Zustand (erste Dendrimer-Konzentration in Lösung) mit einem optischen CA-System.
    2. Füllen Sie die Microsyringe mit entionisiertem Wasser und legen Sie die Parameter in der CA-Software, Tropfen von 1 µL zu produzieren.
    3. Legen Sie die Probe auf der Bühne, so dass die Oberfläche der Probe deutlich sichtbar auf dem Computer für die Bildgebung ist.
    4. Die Spritze mit dem Mikromanipulator zu bewegen, bis es in der Nähe der Oberfläche bekommt und die Tropfen auf die Oberfläche. Nehmen Sie das Bild sofort nach Tröpfchen Stabilisierung.
      Hinweis: In CA-Messungen ist es sehr wichtig, die Feuchtigkeit zu regulieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
    5. Analysieren Sie die CAs mit der proprietären Software des Herstellers des Geräts CA gemessen. Die passende Methode kann an Benutzeranforderungen angepasst werden. Die elliptische Anpassungsmethode kann eine Option sein.

5. die Zellkultur

Hinweis: Alle Schritte wurden durchgeführt in einer Gewebekultur Kapuze und nur sterile Materialien, Lösungen und Techniken wurden verwendet.

  1. Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Kultur NIH-3 t 3 Maus embryonale Fibroblasten aus frühen Passagen (< 10) bei 37 ° C und 4,6 % CO2 Atmosphäre im basalen Medium mit hoher Glucose ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 1 % Natrium Pyruvat (Wachstumsmedium). T75 Flaschen für eine totale Aussaat von 500.000 Zellen pro Flasche 10 ml Wachstumsmedium werden empfohlen.
    2. Entfernen Sie altes Medium mit einer 10 mL-Pipette alle 2 Tage zu und ersetzen Sie mit 10 mL frisch zubereitete Wachstumsmedium.
    3. Zellkulturen in das Wachstumsmedium bis sie rund um 80 % Zusammenfluss, dann entfernen Sie das Medium erreichen und 5 mL Trypsin pro Flasche. Um die richtige Zelle Loslösung von der Unterseite des Kolbens zu gewährleisten, pflegen Sie die Trypsin-Lösung in Kontakt mit den Zellen für 5 min bei 37 ° C.
    4. Geben Sie 5 mL Wachstumsmedium pro Flasche hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen bei 470 X g für 5 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL Wachstumsmedium. Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
    5. Übertragen Sie die Substrate auf Platten nicht für Gewebekultur (nicht haftend) behandelt.
    6. Die Zellen der Substrate bei einer Dichte von 4.000 Zellen/cm2 im Wachstumsmedium Saatgut und inkubieren sie 4,5 h bei 37 ° C und 10 % CO2 -Atmosphäre.
  2. Chondrogenic Induktion der MSCs.
    1. Kultur menschlichen MSCs aus frühen Passagen (< 5) bei 37 ° C und 4,6 % CO2 Atmosphäre im MSC Wachstumsmedium. T75 Flaschen für eine totale Aussaat von 500.000 Zellen pro Flasche 10 ml Wachstumsmedium werden empfohlen.
    2. Ändern Sie Medium alle 3 Tage (siehe 5.1.2).
    3. Trypsinize Zellen vor dem Zusammenfluss von 80 % erreicht ist, und Zentrifugieren und Aufschwemmen sie im MSC Wachstumsmedium (siehe 5.1.3). Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder und aufzuwirbeln sie in 10 mL Medium werden-induzierende.
    5. Übertragen Sie die Substrate von den Platten auf neue well-Platten nicht für Gewebekultur (nicht haftend) behandelt. Samen der Zellen auf den Substraten bei einer Dichte von 3.000 Zellen/cm2.
    6. Ändern Sie das Chondrogenic Medium alle 3 Tage (siehe 5.1.2).

6. Zelle Fixierung und Immunostaining

Hinweis: Die folgenden Schritte können in nicht-sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen sanft mit PBS. Beheben sie durch Zugabe von 10 % Formalin Lösung für 20 min bei RT
  2. Entfernen Sie das Formalin und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Die freien Aldehyd-Gruppen durch Hinzufügen einer 50 mM-Lösung von Ammoniumchlorid (NH4Cl) mit PBS-Puffer zu blockieren. Lassen Sie die Zellen für 20 min bei RT entfernen NH4Cl-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° c lagern
  4. Entfernen Sie PBS und permeabilize der Zellen durch Hinzufügen einer 0,1 % igen Lösung von Saponin in die blockierende Lösung (1 % Albumin mit PBS-Puffer) für 10 min am RT. Wash die Zellen mit PBS und Proben zu einem neuen well-Platte zu übertragen.
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit einer Lösung aus primären Antikörper in der blockierenden Lösung (Tabelle 3) für 1 h bei RT Dann entfernen Sie die primären Antikörper-Lösung und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit sekundären Antikörper in der blockierenden Lösung (Tabelle 3) für 1 h bei RT
    Hinweis: Vermeiden Sie Licht Exposition.
  7. Die sekundäre Antikörper-Lösung entfernen und Waschen der Zellen mit PBS und trocken.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C im Dunkeln.
  8. Probe-Halterung für Mikroskop Beobachtung: mit einem Diamant-Tip-Cutter, gelten 50 µL 1,25 x 1,25 cm. Montage Medium auf die Proben-Mikroskopie Deckgläsern geschnitten und bedecken Sie sie sanft mit der geschliffenen Deckgläsern.
  9. Übertragen Sie die Proben auf einen bequemen Empfänger, bedecken Sie es mit Alufolie und Store im Dunkeln bei 4 ° C bis Beobachtung.

7. Zell-Imaging und Datenanalyse

Hinweis: Für undurchsichtige Au(111) und Dicke Objektträger-basierte Substrate, muss eine aufrechte Mikroskop verwendet werden.

  1. Fibroblasten Adhäsion Experiment.
    1. Verwendung eines Mikroskops Epifluoreszenz ausgestattet mit einer digitalen Kamera und Low (also 10 X) und hohen (d.h. 40 X) Vergrößerung Ziele. Führen Sie Messungen in Luft.
    2. Legen Sie die Probe auf der Bühne und Bild Zellkerne mit 10 X-Objektiv mit einer ultravioletten Erregung, Langpass-Emission Filter, Hoechst/DAPI Fleck zu visualisieren.
    3. Bild Zelle Cytoskelett und fokale Adhäsionen (FAs) mit dem Ziel, 40 X, Auswahl des Mikroskop-Filters, der die entsprechenden Antikörper Fluorochrom-Spezifikationen entspricht.
    4. Verwenden Sie für FA-Quantifizierung Bildverarbeitungs-Software, um Bilder in 8-Bit-Dateien zu konvertieren. Entfernen Sie die Hintergrund und konvertiert Bilder in Binary durch das Festlegen eines Schwellenwerts. Mindestens 30 Bilder pro Probe zu berechnen und FAs von 1 µm-2 für die Berechnung zu berücksichtigen.
  2. Chondrogenic Induktion der MSCs.
    1. Bild Zelle Kondensate in der Anfangsphase der Chondrogenic Induktion (< 5 Tage) mit einem aufrechten Epifluoreszenz Mikroskop, ausgestattet mit einer Digitalkamera und einem niedrigen (z.B. 10 X) Vergrößerung Ziel. Ultraviolett Anregung und Langpass-Emission Filter verwenden, Hoechst/DAPI Fleck zu visualisieren.
    2. Für die Messung der Kondensat-Bereich, eine Bildverarbeitungssoftware, umwandeln Sie Bilder in 8-Bit-Dateien, entfernen Sie den Hintergrund und wählen Sie eine Schwelle, die die aggregierte Kontur unterstreicht. Berechnen Sie die Fläche der Partikel.
    3. Bild Immunostained Proben für FAs, Zellskelett Aktin Fasern und Knorpel-spezifische Kollagen Typ II Alpha 1 (COL2A1) mit einer aufrechten confocal Mikroskop bei hoher Vergrößerung (z.B. 40-60 X). Sammeln Sie Abschnitte in einem repräsentativen Intervall (d.h. 0,5 – 1 µm).
    4. Um den Stapel zu verarbeiten, verwenden Sie ein Bildbearbeitungsprogramm. Bilder in 8-Bit-Dateien umwandeln, den Hintergrund zu entfernen und durch das Festlegen eines Schwellenwerts Binär zu machen. Ein Minimum von drei Zelle Kondensate pro Zustand der drei unabhängige Stichproben zu behandeln.
    5. Das FA-Protein gefärbten Bereiche aus der basalen Zone der Zelle Kondensate zu quantifizieren und als der entsprechende Anteil der Fläche geteilt durch die Anzahl der Zellkerne im Bild auszudrücken.
    6. Zur Messung der COL2A1 Färbung verwenden Sie konfokale Z-Projektionen und quantifizieren Sie die Summe der projizierten Fläche (maximale COL2A1 Fläche pro Probe) zu. Den Bereichswert gegen den Bereich des entsprechenden Kondensats zu normalisieren.

(8) Quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)-Analyse

Hinweis: Um RNase-Kontamination zu verhindern, verwenden Sie Einweg, steril Kunststoff Ware und Einweg-Handschuhe beim Umgang mit Reagenzien und RNA. Immer verwenden Sie richtige mikrobiologische aseptische Techniken und eine entsprechende Dekontaminationslösung RNase Kontamination von Arbeitsflächen und nicht-Einweg-Artikel wie Zentrifugen und Pipetten entfernen.

  1. Gesamt-RNS zu isolieren und in einer RNA-Disruptor zu pulverisieren. Behandeln Sie RNA-Proben mit DNase zu, und wandeln sie in cDNA mit einem cDNA Synthese-Kit.
  2. Durchführung von qRT-PCR unter Verwendung Zündkapseln für den Transkriptionsfaktor SOX9. Beta-2-Mikroglobulin (B2M) und ribosomale Protein L13a (RPL13a) kann als Housekeeping-Gene verwendet werden.
  3. Berechnen Sie die Ausdruck Ebenen und gegen die negativ-Kontrolle (PLLA) zu normalisieren.

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Representative Results

Wir präsentieren eine Nanopatterning Methode, die Oberfläche Haftfähigkeit auf der Nanoebene (Abbildung 1) angesprochen werden kann. Die chemische Struktur der RGD-Cys-D1 zeigt Abbildung 1A. Dendrimere wurden auf elektrische leitende Au(111) Oberflächen für hochauflösende STM Charakterisierung gemustert. Niedrige Dendrimer-Konzentrationen in Lösung (bis zu 10-5% w/w) gerendert isoliert Dendrimere 4-5 Nm im Durchmesser (Abb. 1 b), während hoch verpackt Dendrimer-Aggregate gebildet, bei höheren Konzentrationen (Abbildung 1). AFM Oberflächencharakterisierung (Zahlen 1-D-G, obere Reihe) ergab, dass die Flächenverteilung RGD-Cys-D1 Dendrimere als Funktion der ersten Dendrimer-Konzentration in Lösung angepasst werden kann. Auf die Wahrscheinlichkeit Konturkarten dminführt dies zu unterschiedlichen lokalen RGD nanoskaligen dichten auf der Oberfläche (Zahlen 1-D-G, untere Reihe).

In Zelle Kultur Experimente, die Zellmembran Rezeptor Integrine von etwa 10 nm im Durchmesser erkannt die RGD-Sequenz an der Peripherie Dendrimere. Obwohl acht Kopien dieser Sequenz pro Dendrimer bereitgestellt wurden, interagiert nur 1 Dendrimer pro Integrin aufgrund seiner Größe (ca. 4-5 nm gemessen von STM; Abbildung 1 b). Das heißt, vorgesehenen jedes Dendrimer eine einzelne Website Integrin-Bindung, dadurch ermöglicht eine direkte Korrelation von Dendrimer-Verteilung (wie in der AFM-Bildern zu sehen) und die RGD-Verteilung für Zelladhäsion. Darüber hinaus fanden sich keine signifikanten Unterschiede in der CA-Werte, die für die verschiedenen Nanopattern-Konfigurationen, die Zelle Adhäsion29beeinflussen können. Diese Eigenschaften machen Dendrimer-Nanopatterns auf biokompatible Oberflächen geeignete, die Substrate durch das modulieren und Zelle Verhalten zu studieren.

Zelladhäsion, Nanopatterned Au(111) wurde mit Fibroblasten innerhalb der ersten 24 Stunden der Kultur (Abbildung 2A) und mit MSCs auf Nanopatterned PLLA (Abb. 2 b) getestet. In beiden Fällen gebeizt der Prozentsatz des Bereichs für die FA Protein Paxillin (Pax) erhöht schrittweise mit Dendrimer-Konzentration, wie lokale RGD Oberflächendichte (Prozentsatz der Nanopatterned Bereich mit dmin unterhalb der Schwelle von 70 nm für effiziente Zelladhäsion; ( Tabelle 4). Für eine erste Dendrimer-Konzentration von 10-2% w/w und Positivkontrollen, den Prozentsatz des Bereichs gebeizt für Pax pro Zelle verringert und die Korrelation mit dem Prozentsatz der Nanopatterned Bereich mit dmin < 70 nm ging verloren.

Der Anteil der Fläche von dmin besetzt < 70 nm (Abbildung 1-G untere Reihe und Tabelle 4) ist ein guter Indikator für lokale RGD Oberflächendichte für Nanopatterns bis zu 10-5% w/w erste Dendrimer Konzentration, aber nicht von denen bis zu 10-2% w/w, wegen Dendrimer-Aggregation. Aggregation produziert sehr heterogene Proben hinsichtlich der Liganden Verteilung, wobei nur ein geringer Prozentsatz der Oberfläche mit d-min -Werte unter dem Grenzwert von 70 nm (untere ReiheAbbildung 1 und Tabelle 4). XPS-Ergebnisse zeigten, dass diese Flächen eine globale RGD Dichte vergleichbar mit 10-5% w/w präsentieren-Nanopatterns28abgeleitet. Diese Beobachtung zeigt, dass RGD Maximaldichte in den Regionen mit Dendrimer Aggregate erreicht wurde und der Anteil der Fläche von dmin besetzt < 70 nm ist nicht repräsentativ für die lokale RGD Oberfläche Dichte in diesem Fall.

Die Beobachtung, dass Positivkontrollen (homogenen Beschichtungen) mit lokalen RGD Oberfläche Maximaldichte nicht die erwartete Steigerung in Zelladhäsion zeigte kann eine sterische Behinderung Wirkung zugeschrieben werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im Vergleich zu den entsprechenden homogenen Oberflächen allgemein verwendet in der Zellkultur, RGD Nanopatterns nachhaltig Zelladhäsion effizienter. Dieser Befund unterstreicht damit die Bedeutung der lokalen Liganden Dichte.

Interaktionen mit der Umgebung in Morphogenese der ersten Zelle Differenzierung Ereignisse auslösen und bis zur Erstellung der endgültigen komplexer Gewebestrukturen zu propagieren. Um die Auswirkungen der Dendrimer-Nanopatterns auf Zelle Adhäsion und Differenzierung zu bewerten, haben wir die Chondrogenic Induktion der MSCs als Vorbild verwendet. Werden gibt es Aktivmatrix Umbau, eine lehrreiche Rolle in der Leitung der Zellen durch die verschiedenen Stufen der Bildung von Knorpel.

MSCs unterzogen werden auf die Nanopatterns (Abbildung 3). Chondrogenic Differenzierung beginnt mit einem Zelle Kondensation Schritt, der Zelle Rekrutierung zu dichten Kondensate, die Einrichtung von Zell-Zell-Kommunikation und damit einhergehende Veränderungen in der Zelle Morphologie33beinhaltet. Abbildung 3A zeigt, die dass die Zelle Kondensation in allen Substraten und die Kondensate aufgetreten stieg im Bereich mit steigenden Dendrimer-Konzentrationen bis zu 2,5 x 10-8% w/w Bereich Kondensat dann wieder für eine Dendrimer verringert Konzentration von 10-2% w/w und für die positive Kontrolle. Der Zelle Kondensation Schritt in werden erfolgt durch aktive Zelle Bewegung nicht durch eine Erhöhung der Zelle Verbreitung34. Diese Zelle Bewegung wird durch flexible Verklebung mit dem Untergrund begünstigt: stabile Verklebungen sollten gebildet werden, um Zugkräfte Zellkörper bewegen zu ermöglichen, und zur gleichen Zeit diese Verwachsungen sollte schwach genug, um Zelle Release vom Substrat während ermöglichen Bewegung. Zelle Kondensation wird begünstigt durch eine Erhöhung der in lokalen RGD Oberfläche Dichte bis 2.5x10-8% w/w-Nanopatterns, mit einer guten Balance zwischen Zelladhäsion und Zelle Bewegung abgeleitet. Für 10-2 und die positive Kontrolle die lokalen RDG Oberflächendichte zu hoch war, dadurch Beeinträchtigung der Kondenswasser-Veranstaltung.

Chondrogenic Differenzierung Erlöse aus Prechondrogenic Kondensate: Zellen in Kondensate werden stärker abgerundet und die Synthese spezifischer Marker Knorpel zu starten, wie z. B. das ECM-Protein COL2A1 und die Transkription Faktor SOX933, 34 , 35. Dementsprechend Substrate mit einer mittleren Haftfähigkeit, begünstigt die Bildung von Zelle Kondensate, zeigte höhere COL2A1 Färbung (Abb. 3 b) und höhere SOX9 mRNA Ausdruck (Abbildung 3).

Unsere Ergebnisse zeigen den Einfluss der Zell-Zell-Matrix-Interaktionen in den frühen Phasen der Chondrogenic Differenzierung. Solche Interaktionen können leicht durch Dendrimer-basierte Nanopatterns angesprochen werden.

Schritt Zeit (s) Drehzahl (u/min) Beschleunigung (u/min/s)
1 5 500 300
2 30 3.000 1.500

Tabelle 1: Spinner Programmschritte Glas-Objektträger mit den vorbereiteten PLLA Lösung beschichtet. Ein erster Schritt der Homogenisierung diente bei 500 u/min mit einer Beschleunigung von 300 u/min/s für 5 s. gefolgt von einem letzten Schritt bei 3.000 u/min bei einer Beschleunigung von 1.500 u/min/s für 30 s.

Lösung RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) MQ-Wasser (µL)
A 0,77 5 6.494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Lösung (µL)
B 10-2 779 5.220
C 10-5 0.78 6.000
Lösung C (µL)
D 2,5 x 10-8 15.0 5.985
E 10-8 6.0 5.994
F 4 x 10-9 2.4 5.998

Tabelle 2: Details der Zubereitung die RGD-Cys-D1 Solutions verwendet. Eine Stammlösung RGD-Cys-D1 Dendrimere wurde auf eine Endkonzentration von 0,77 mg/mL (Lösung A), vorgelegt von denen Lösungen B und C 10-2 und 10-5% w/w Konzentrationen vorbereitet wurden. C Lösung mit einer Konzentration von 10-5% w/w der RGD-Cys-D1 Dendrimer wurde verwendet, um Lösungen bei Endkonzentrationen von 2,5 x 10-8, 10-8 und 4 x 10-9% w/w, D, E und F bzw. vorzubereiten.

Name Volumen (µL) Blockierende Puffer (mL)
Primäre Mischung Kaninchen-mAb, pax 65 12.870
Maus-mAb, COL2A1 32,5
Sekundäre Mischung Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus 13 12.961
Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Kaninchen 13
Hoechst-Lösung 13

Tabelle 3: Vorbereitung der Antikörper-Lösung. Der Primärantikörper Mischung enthaltenen monoklonale Antikörper gegen Pax in Kaninchen produziert verdünnt 1: 200 in der blockierenden Lösung mit monoklonalen Antikörper gegen COL2A1 in Maus verdünnt 1: 400 in der blockierenden Lösung produziert. Die Sekundärantikörper Mischung enthaltenen Zelle Kerne Fleck Hoechst und der Sekundärantikörper produziert bzw. bei Ziege gegen Maus und Kaninchen (jeweils mit Alexa Fluor 488 und 568 Fluorophore beschriftet).

Figure 1
Abbildung 1 : RGD-Cys-D1 Dendrimer-Nanopatterning für die nanoskaligen Kontrolle der lokalen RGD Oberflächendichte. (A) RGD-Cys-D1 Dendrimer-Struktur mit bis zu acht Kopien der Zelle Klebstoff RGD Peptid. Vertreter STM Bilder (Bias = 200 mV, Sollwert = 0,5 nA) des RGD-Cys-D1 Nanopatterns auf Au(111) aus einer anfänglichen wässrigen Lösung von 10-8% w/w (Maßstabsleiste = 3 nm, B) und die entsprechende Höhe Streckenprofil bezogen auf die gestrichelte Region in (B)und (C) 10-2% w/w zeigt Dendrimer-Aggregation angegeben (Maßstabsleiste = 20 nm). (D-G) Vertreter AFM Bilder von RGD-Cys-D1 Nanopatterns auf PLLA erhalten von den entsprechenden Dendrimer wässrige Lösungen von 10-2%, 2,5 X 10-8%, 10-8% und 4 x 10-9% w/w, bzw. (Maßstab = 1 µm). Die entsprechende Wahrscheinlichkeit Höhenlinienkarte Oberflächenkräfte Mindestabstand (dmin) zeigt unter jedem AFM-Bild mit hoher Dichte RGD Regionen gezeigt in dunkelrot (dmin < 70 nm). Dendrimere und Dendrimer-Aggregate sind in schwarz aus Gründen der Übersichtlichkeit dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Zelle Adhäsion auf der RGD-Cys-D1-Nanopatterns. Grundstück von den Prozentsatz des Bereichs gebeizt für FA Protein Pax pro Zelle für die Zellen in Kontakt mit dem Substrat (linke Achse) mit ersten Dendrimer-Konzentration. Werte werden verglichen mit den lokalen RGD Oberfläche Dichte (Anteil der Fläche in der Nanopatterns mit d-min -Werte unter 70 nm-Schwelle) (rechte Achse) mit 100 und 0 Prozentsätze zugewiesen den positiven Pol (+ Kontrolle) und negativen (- Control) steuert, beziehungsweise. (A) Fibroblasten Haftung auf Dendrimer-Nanopatterns auf Au(111) nach 4,5 h Kultur. (B) MSC Haftung auf Dendrimer-Nanopatterns auf PLLA an Tag 1 der Chondrogenic Induktion ausgewertet. Werte werden als Mittelwert mit der Standardabweichung angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Bereich (< dmin = 70 nm) (%) auf Au(111) Bereich (< dmin = 70 nm) (%) auf PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tabelle 4: Prozentsatz der Fläche mit d min Werte unter 70 nm erhalten für RGD-Cys-D1 Dendrimer Ablagerung auf Au(111) und PLLA in Abhängigkeit von der anfänglichen Dendrimer-Konzentrationen verwendet werden Oberflächen.

Figure 3
Abbildung 3 : Chondrogenic Differenzierung von MSCs auf die RGD-Cys-D1-Nanopatterns. (A) Kondensation von MSCs auf RGD-Cys-D1 Nanopatterns auf PLLA nach 5 Tagen der Chondrogenic Induktion kultiviert. Vertreter Epifluoreszenz Bilder von gefärbten Zellkernen (Hoechst; Maßstabsleiste = 300 µm; obere Reihe) und Handlung des Raums der Zelle Kondensate (untere Zeile) erhielt am RGD-Cys-D1 Nanopatterns aus verschiedenen ursprünglichen Dendrimer-Konzentrationen. Differenzierung Erlöse aus Zelle Kondensation Schritt mit dem Ausdruck der spezifischen Chondrogenic Marker: (B) Prozentsatz der Fläche der COL2A1 Färbung mit einer Fläche von der Zelle Kondensat aus den entsprechenden konfokalen Z-Projektionen normalisierte nach 5 Tagen der Chondrogenic Induktion erhalten. (C) Relative SOX9 mRNA Ausdruck (gegen negative Kontrolle) nach 3 Tagen der Chondrogenic Induktion. Werte werden als Mittelwert mit der Standardabweichung (B) und (C)angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Bei der Entwicklung des Protokolls beschrieben sollte eine Reihe von kritischen Schritte berücksichtigt werden. Die erste bezieht sich auf Nanopattern Charakterisierung mit Scan-Sonde-Mikroskopie-Techniken. Um die Nanopatterns sichtbar zu machen, muss die Oberfläche, wo Musterung entsteht liegt der Rauheitswert unterhalb der mittlere Durchmesser der Dendrimere, was ungefähr 4 – 5 nm gemessen an STM (Abbildung 1 b). Auch sollte berücksichtigt werden, dass hochauflösende STM Bildgebung auf leitfähigen Substrate, in diesem Fall Au(111) beschränkt ist. Eine Aufhebung des Polymers aus den Ecken der Folie nach dem Spin-Coating mit biokompatibler Kleber behoben werden kann.

Dendrimer-Nanopatterning ist ein Prozess, bei dem zu lokalen Zelle Haftfähigkeit auf der Nanoebene gesteuert. Auf der Grundlage der Selbstmontage Dendrimere auf der Oberfläche durch Adsorption, diese Technik erfordert keine komplexe Nanopatterning Geräte, also im Gegensatz zu vorher beschrieben Lithographie-basierte Methoden36,37, 38. Dendrimer-Nanopatterning kann bis auf großen Flächen leicht skaliert werden und ist voll kompatibel mit Zelle Kultur Protokolle.

Die hier beschriebene Methode der Dendrimer-Nanopatterning finden zukünftige Anwendungen in der regenerativen Medizin. Die Steuerung von Dendrimer-Nanopatterning auf Zelle Haftfähigkeit ausgeübte eignet sich diese Technik für die Konditionierung der Biomaterialien vor der Implantation, wodurch ihre Integration in die Host-Gewebe. Darüber hinaus macht die Leichtigkeit, mit welcher, die Dendrimer peripheren Moieties geändert werden können, Dendrimer-Nanopatterning geeignet für andere Liganden, die Konzentration-abhängige Aktivität auf Zellen ausüben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen Oriol Font-Bach und Albert G. Castaño für ihre Hilfe bei dmin Quantifizierung. Sie erkennen auch die erweiterte digitale Mikroskopie Einheit am Institut für Forschung in der Biomedizin (IRB Barcelona), die Autoren, die das Video in ihren Räumlichkeiten aufnehmen zu lassen. Diese Arbeit wurde durch die Vernetzung Biomedical Research Center (CIBER), Spanien unterstützt. CIBER ist eine Initiative der VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programm, CIBER Aktionen und das Instituto de Salud Carlos III, mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung für Innovation, Universitäten und Unternehmen von der Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Es wurde auch von den Projekten OLIGOCODES (Nr. finanziert. MAT2012-38573-C02) und CTQ2013-41339-P, verliehen durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit, zusätzlich zu INTERREG V-A Spanien / Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkennt finanziellen Unterstützung vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit gewähren (No. IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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References

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

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Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung
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