Summary
Her beskriver vi en metode til fastlæggelse af en model af Zika virus-induceret microcephalus i musen. Denne protokol omfatter metoder til embryonale, neonatal og voksne-fase intracerebralt podning af virussen Zika.
Abstract
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus i øjeblikket endemisk i nord-, Central- og Sydamerika. Det er nu fastslået, at ZIKV kan forårsage mikrocefali og yderligere hjernen abnormiteter. Men den mekanisme, der ligger til grund for patogenesen af ZIKV i hjernen, udvikle uklart. Intracerebralt kirurgiske metoder anvendes ofte i neuroscience research at behandle spørgsmål om både normal og unormal hjernens udvikling og hjernefunktion. Denne protokol udnytter klassiske kirurgiske teknikker og beskriver metoder, der tillader en at model ZIKV-associerede menneskelige neurologisk sygdom i nervesystemet mus. Mens direkte hjernen podning ikke model den normale tilstand af virus transmission, metoden giver mulighed for efterforskerne at stille målrettede spørgsmål vedrørende konsekvensen efter ZIKV infektion af udvikle hjernen. Denne protokol beskriver embryonale, neonatal og voksne stadier af intraventrikulært podning af ZIKV. Når styr, kan denne metode bliver en simpel og reproducerbar teknik, der kun tager et par timer til at udføre.
Introduction
Microcephalus er en tilstand som følge af defekte hjernens udvikling kendetegnet ved mindre end gennemsnitlig hoved størrelse hos nyfødte. Børn med mikrocefali udviser en række symptomer, som kan omfatte forsinket, beslaglæggelse, mentalt handicap, høretab, vision problemer og problemer med bevægelighed og balance, blandt andre, afhængigt af sværhedsgraden af sygdommen og forårsage1,2,3. Denne betingelse er multifaktoriel i naturen, med genetisk, smitsom agent, og miljømæssige faktorer knyttet til forårsager mikrocefali4,5,6,7,8, 9. Inden 2015-2016 ZIKV udbrud, blev 8 børn ud af 10.000 fødsler diagnosticeret med microcephalus i USA Ifølge CDC10. På februar 1st i 2016 Verdenssundhedsorganisationen erklæret Zika virus en Public Health Emergency International bekymring på grund af den alarmerende stigning i mikrocefali diagnoser tilknyttet ZIKV infektion i mødre11, 12. En nylig undersøgelse fra CDC ZIKV sager i USA tyder på, at mødres ZIKV infektion resultaterne i en 20-fold øget risiko for et barn at udvikle microcephalus i forhold til ikke-inficerede individer, og 4% af ZIKV smittede mødre fra USA har resulteret i børn med mikrocefali11. Satsen for mikrocefali-associerede fosterskader under graviditeten fra ZIKV infektion i Brasilien er blevet rapporteret at have påvirket op til 17% af babyer i smittede mødre, der angiver, at andre faktorer i Latinamerika kan være medvirkende til den øgede risiko 13. selv om vi ved, at ZIKV kan forårsage mikrocefali og patogenese i neurale stamceller celle (NPC) befolkning7,8,14, komplet patogenesen af ZIKV i at udvikle hjernen er fortsat undvigende. Det er vigtigt at udvikle dyremodeller for at yderligere undersøge sygdomsmekanismer underliggende hjernen abnormiteter tilknyttet ZIKV infektion.
For at direkte studere den virkning, at ZIKV har på hjernens udvikling, udviklet vi først en musemodel ved hjælp af intracerebralt podning af embryonale dag 14,5 (E14.5) hjerne med ZIKV7. Denne fase blev valgt som det betragtes som repræsentant for afslutningen af den første trimester i menneskelige drægtigheden14. Hvalpe kan overleve op til postnatal dag 5 (P5) med denne embryonale intracerebralt injektion metode (~ 1 µL af 1,7 x 106 vævskultur smitsom dosis (TCID50/mL)). Disse postnatal pups udviser en række fænotyper ligeledes observeret i inficerede menneskelige spædbørn herunder udvidet hjertekamrene, neuronal tab, cytoskeletale rarefaction, astrogliosis og microglial aktivering12,15. En nyfødt mus hjerne er forholdsvis umoden, beslægtet med udviklingsstadiet af den menneskelige hjerne på midten drægtigheden16, og musen hjernens udvikling omfatter en større postnatal komponent. For at studere senere drægtighed fase infektioner, er en metode til postnatal infektion også beskrevet. Nyfødte inficeret med ZIKV på P1 er købedygtig overleve op til 13 dage efter injektion. Blod-født voksne fase infektion er blevet beskrevet i musen tidligere17 , men kræver brugen af interferon (IFN) regulerende faktor (IRF) transskription faktorer IRF-3, -5,-7 tredobbelt knockout stamme. Denne protokol beskriver en metode til vaccination ZIKV intraventricularly for at omgå, deaktivere den antivirale svar af murine model i voksen. Mens dette omgår murine immunsystemet, efterligne denne rute injektion direkte ikke den typiske rute af infektion. For at løse denne uoverensstemmelse direkte, kan eksperimentatoren udføre en intrauterin infektion af ZIKV i stedet for intrakraniel ruten. Vedtaget fra tidligere arbejde18, har vi kort beskrevet denne teknik i protokollens embryonale infektion.
Zika virusstammer gennemføres med denne teknik omfatter den mexicanske isolat MEX1-447,19 og i Afrika isolere hr.-766 isoleret i 194720. Zika MEX1-44 blev isoleret i Chiapas, Mexico i januar 2016 fra en inficeret Aedes aegypti myg. Vi opnåede denne virus med tilladelse gennem University of Texas Medical filial i Galveston (UTMB). Derudover blev Dengue virus serotype 2 (DENV2) podet ved hjælp af denne teknik i en sammenlignende undersøgelse. DENV2, stamme S16803 (sekvens GenBank GU289914), blev isoleret fra en patient prøve fra Thailand i 1974 og passaged i C6/36 celler. Virussen var passaged to gange i Vero celler af World Reference Center for Emerging vira og Arboviruses (WRCEVA) før musen injektioner. Dette viser, at denne teknik fungerer lige godt for forskellige stammer af ZIKV og andre flavivira, der kan have en indvirkning på hjernens udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr bruger protokoller følge retningslinjerne dyrs pleje af University of Southern California og University of Georgia. Dødshjælp metoder for gravide dæmninger og voksne er udført efter godkendte protokoller: kuldioxid kvælning, efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær metode til at sikre aktiv dødshjælp. Neonatal unger er euthanized ved halshugning.
Advarsel: Følgende protokol indebærer håndtering af en sygdomsfremkaldende virus. Passende forsigtighed bør tages mens håndtering af virus. Alle protokoller skal godkendes af den relevante institutionelle udvalg før brug.
1. embryonale intracerebralt podning af Zika Virus
- Timet gravid parring, overveje middag af dagen efter parring som E0.5. Par mus i slutningen af dagen og tjekke stikkene i de tidlige morgentimer at mindske variabiliteten af parring tid.
- Forbered glas nålen forud for operationen. Trækker nålen og skåret i 1/3 dens længde, så skærpe i en 45° vinkel ved hjælp af en mikropipette vinkelsliber med en vand drypper indtil pore er dimensioneret til 50-70 µm. Check nål tips under en Stereoskopet for kvalitet og brud.
- Holde virus alikvot på is. Lige før kirurgi, skal du indlæse ZIKV injektion mix i rede glas injektion nål. Samle gastætte injektion sprøjte (50 µL volumen), luer-lock vedhæftet fil og slanger, og mætte den forsamlede sprøjte med slanger med mineralsk olie. Når mættet, vedhæfte nålen, og tegne ~ 6-7 µL ZIKV til nålen (~ 1 µL er 1,7 × 106 TCID50/mL).
- Injicere gravid C57BL/6J eller 129S1/SvImJ mus med embryonale dag E14.5 embryoner (for intrakraniel injektion) eller E10.5 embryoner (for intrauterin injektion) med ketamin hydrochlorid (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg) fortyndet i steril saltvandsopløsning intraperitoneal at fremkalde anæstesi hos moderen. Alternativt, bedøver mødre med overvågede isofluran isofluran forudsat ved indånding, med røggas skylningssystem, hvis det er relevant. Injicere buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutant for at fremkalde analgesi.
- Knivspids test bedøvede mødre på tå tip eller hale og derefter lægge dem liggende på en dyr-godkendt varmepude (termisk pad på 100 x 200 2.5 mm). Tå knivspids pincet er ikke sterilt og bruges ikke til at håndtere væv i kirurgi. Alternativt, behandskede hænder kan bruges til at teste tå knivspids tilbagetrækning refleks.
Bemærk: Henvise til din institutionelle veterinaere personale for den foretrukne perioperative opvarmning metode. Et cover blev placeret mellem denne varmepude og dyret. - Tilføje oftalmologiske salve til øjnene.
- Barbere overfladen af maven og sterilisere med jod og alkohol tre gange. Suppleant jod og alkohol Vådservietterne; tør i en cirkulær bevægelse væk fra operationsstedet.
- Drapere huden omkring operationsstedet med steril klude til at undgå forurening af snit og instrumenter.
Bemærk: Drapere åbning bør ikke være større end rede operationsstedet; ingen hår skal ses i drapere åbning. - Knivspids moderens hud fra hendes underliv med pincet og skære underlivet i en 1-1,5 cm linje på den mediale sagittal linje med en steril kirurgiske saks. Dette skærer ind i huden og videre ind i bughulen, således at embryonerne er nu udsat.
Bemærk: Kirurgisk saks bruges til incise hud og peritoneal lag. Sterile instrumenter og handsker anvendes for hver operation. - Skære en slids midt i en lille steril gaze og anvende oven på kirurgisk åbning. Hydrat med sterilt saltvand. Trække embryoner gennem spalten til at hvile på den steril gaze, forsigtigt for at fjerne mere end 4-5 embryoner med fokus på en uterin horn på én gang.
- Hydrat embryoner med sterilt saltvand forud for og i hele podning til at sikre, at de ikke tørrer. Holde styr på hvilke embryoner er injiceres og deres placering i den uterine horn. Individuelt embryoner er således behandles som særskilt eksperimenter, som embryoner ikke ændrer holdning samtidig udvikle i utero. (Fortsæt til trin 1.15 intrauterin injektionsvæske).
- Anbring forsigtigt en spatel under lederen af embryoet. Belyse embryonerne godt med en lampe til at visualisere hoved og kraniet suturerne.
Bemærk: Aseptisk teknik er fulgt, herunder steril kirurgiske handsker og instrumenter. Efter ikke-sterile elementer (f.eks. en lygte) er manipuleret, handsker bør erstattes med nye sterile handsker før håndtering af sterilt instrumenter og områder. - Position i hovedet ved at manipulere embryo med både lampe (bag hovedet for synlighed) og frie fingre, indtil lederen af embryonet er skubbet op direkte mod livmodervæggen og holdes på plads med den ikke-dominerende hånd.
Bemærk: Positionering embryoet er en kritisk del og den teknik, der tager de fleste praksis. For meget fingertryk kan beskadige embryonale membraner fører til dødelighed og ikke tilstrækkeligt pres kan vanskeliggøre injektion. - Bruge blodkarrene, der løber langs kraniet suturen som en guide. Injicere ZIKV virus (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL mexicanske isoleres MEX1-44) i de laterale hjertekamrene af E14.5 embryo hjerner med samlet sprøjte og kanyle. Bruge kontrol medier som en fingeret injektion.
- For at forbedre fastholdelsen af graviditeten, undgå viral injektion af to embryoner ved siden af æggestokkene og de to embryoner ved siden af den øvre vagina (figur 1A). Alt i alt injiceres ikke mere end 6 embryoner pr. kuld til at reducere tid af kirurgi og forhindre tab af fosteret.
- Placere de injicerede embryoner tilbage i de gravide dæmninger, og fylde i bughulen med ~ 0,5 mL sterilt saltvand. At lukke, først sutur både abdominal peritoneal musklen og derefter for det andet sutur ydre hud lag med 4.0 sterilt suturmateriale. Det er at foretrække at bruge afbrudt suturer; der er mulighed for sår opspringning hvis musen tygger sutur.
- Placere musen i et bur, delvis hviler på en varmepude at lade musen til at flygte til en ikke-opvarmet areal, hvis det er nødvendigt. Overvåge mødre mens de inddrive (1-2 h) fra anæstesi. Udvikle embryoner efter operation for varierede gange efter individuelle eksperimenter.
-
Intrauterin injektion
- Med en livmoder horn og embryoner udsat, bruge en 1 mL sprøjte og 27G nål til indsprøjtes 100 μL Zika virus (106 TCID50 enheder suspenderet i 100 μl DMEM), eller kontrol medium, ind i intrauterin rummet eller ind i placenta væv. Bemærk, hvor embryoner har været injiceres til fosterstadiet dissektioner. Se tidligere offentliggjorte arbejde for flere detaljer18.
- Placere injiceres embryoner tilbage i de gravide dæmninger, og fylde i bughulen med ~ 0,5 mL sterilt saltvand. Til sidst vil først sutur peritoneal mavemuskel og derefter for det andet sutur ydre hud lag med 4.0 sterilt suturmateriale. Det er at foretrække at bruge afbrudt suturer; der er mulighed for sår opspringning hvis musen tygger sutur.
- Placere musen i et bur, delvis hviler på en varmepude at lade musen til at flygte til en ikke-opvarmet areal, hvis det er nødvendigt. Overvåge mødre mens de inddrive (1-2 h) fra anæstesi. Udvikle embryoner efter operation for varierede gange efter individuelle eksperimenter.
2. neonatal intracerebralt podning af Zika Virus: P0/P1
- Sikre, at den gastætte injektionssprøjter (10 µL volumen) og nåle ikke er tilstoppet. Ren og teste ved at indlæse tre 20 mL engangsbrug sprøjter med 26-gauge nåle: en med saltvand, en med 70% ethanol, og en med luft til at klare løsningerne. Sterilisere med 10% blegemiddel, hvis tidligere brugt til virus injektion.
- Holde virus på is. Indlæse sprøjten ved at udfylde den med saltvand til at reducere dødvolumen i sprøjten, og tegne 0,75 µL af luft til at adskille at saltvandsopløsning fra injektion materiale.
- Oprette et varmede befugtet opsving kammer for injiceres unger. Brug en varme blok, placere en lukbare container (såsom en tom tip box) med en steril gaze og fugte med saltvand. Forvarm det før du starter injektioner.
- Oprettet af microinjector, herunder pumpen og controller. Afgøre koden enhed type for den specifikke sprøjte (dvs, for en 10 µL sprøjte, enhedstypen er "D"). Bestemme hastigheden af injektion.
- Indsamle postnatal dag 0 eller 1 hvalpe (P0/P1) nær den kirurgiske setup. Indlæse injektion sprøjten med virus. Desinficere pup hoved mount med 70% EtOH.
- Wrap unger i et tyndt lag gaze og begrave dem helt i isen for at opnå et bedøvelsesmiddel tilstand. Hvalpene er cryoanesthetized i 5 min. Kontroller at hvalpene er tilstrækkeligt bedøvede til injektion ved at udføre en hale/tå knivspids uden svar. Det giver ca 15 min af et bedøvelsesmiddel stat.
- Placer pup på hovedet mount, sterilisere overfladen af hovedet med jod og ethanol (tre gange) og derefter tør med en steril tørre (isopropanol eller 70% EtOH).
- Markere lambda med en sort tusch og registrere koordinater på lambda ved hjælp af stereotaxisk instrumentet. Mål afstanden fra lambda til kanten af øjet og begyndelsen af stereotaxisk koordinaterne for lambda beregne 2/5 afstanden fra lambda til øjet (for begge hjernehalvdele, hvis du injicerer begge).
- Re-indskrive den bedøvende dybde forud for at skabe et hul til injektionsstedet. Bruge en 26-gauge kanyle til omhyggeligt og overfladisk punktere hovedbunden og kraniet på lokationen injektion (kraniet er meget bløde i nyfødte) for at skabe en åbning for injektion nålen.
- Sænke injektion nålen ind i den punkteret placering, og når nålen har bare overtrådt huden, beregne en 1 mm dybde for injektionsstedet (lateral ventrikel) ved hjælp af stereotaxisk instrumentet.
- Når nålen er sænket til injektion dybde, programmere microinjector at injicere: 1 µL af virus, med en hastighed på 10 nL/s, indsprøjte ca 1 µL over 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- Hvornår indsprøjtningen finish, vent 30 s, og trække nålen i 0,5 mm intervaller ved at dreje skruen (dorsalt), venter 30 s efter hver tilvækst.
Bemærk: Dette reducerer lækage af injicerede virus. - Når fjernet, enten hurtigt indlæse nål og sprøjte med flere virus (der skal indlæses forskellige vira eller mock objekter i separat sprøjter/kanyler) eller fjerne pup fra hoved mount til pre varmede befugtet kammer. Overvåge pup hver par minutter for at måle opsving. Erstatte pups med sit kuld.
3. voksen intracerebralt podning af Zika Virus
- Injicere voksne mus intraperitoneal med ketamin hydrochlorid (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg) opløses i sterilt saltvand til at fremkalde anæstesi. Injicere buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutant for at fremkalde analgesi. Toe/hale knivspids musen til at sikre sin bedøvelsesmiddel tilstand, og derefter montere den på den stereotaxisk instrument (med en varmepude) for at immobilisere hovedet under kirurgi.
- Tilføje oftalmologiske salve til øjnene at forhindre musen øjne fra udtørring under kirurgi. Barbere hovedbunden starter bag øjnene til begyndelsen af ørerne. Sterilisere den eksponeret hud med jod og 70% EtOH tre gange. Suppleant jod og alkohol Vådservietterne; tør i en cirkulær bevægelse væk fra operationsstedet.
- Re-indskrive den bedøvende dybde før incising huden. Ved hjælp af en skalpel, gøre en 0,5 cm indsnit langs den mediale sagittal af hovedet i lokationen steriliseret udsætter bregma. Ved hjælp af en rullende bevægelse med en bomuld tippes applikator, klart overfladen af kraniet af meningeal væv, mens samtidig presser huden væk fra injektionssteder.
- Startende fra bregma, tilpasse den kirurgiske borehoved og identificere injektionssteder ved hjælp af følgende koordinater: AP -0,5 mm, ML: + /-1,5 mm. ved hjælp af fodpedal kontrol, bore i kraniet langsomt, kun bore knogle indtil et hul er blevet tømt for nålen.
- Erstatte boret med microinjector pumpe og lufttæt sprøjte (10 µL volumen) på den stereotaxisk. Forlader en lille luftboble mellem at saltvandsopløsning og virus, tegne ~ 4-5 µL af virus. Afgøre koden enhed type for specifikke sprøjte volumen (dvs, D for 10 μL volumen sprøjte). Sænk nålen til DV:-1.5 mm fra hjernen overflade. For at Injicér 1 µL af virus, programmere en sats på 10 nL/s, indsprøjte ca 1 µL over 1,5 min.
- Hvornår indsprøjtningen finish, vent 30 s, og fjerne nålen i 0,5 mm trin, venter 30 s efter hver omdrejning. Dette reducerer tilbagestrømning og udsivning af den injicerede virus.
- Når injection(s) er færdig, skal du bruge pincet løsne huden og genoprette det udsatte kraniet. Sutur hovedbunden tilbage sammen ved hjælp af 4.0 suturer og fjerne musen fra den stereotaxisk instrument. Sted musen i et bur, delvis hviler på en varmepude til musen til at flygte til et ikke-opvarmede område, hvis det er nødvendigt og overvåge mens de inddrive (1-2 h) fra anæstesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative billeder af vores injektion metoder for ZIKV podning af embryonale hjerne er vist i diagrammer skildrer intracerebralt injektioner (figur 1A) og intrauterin og intraplacental injektioner (figur 1B), illustrerer den måde gravid dæmningen og embryoner skal ses og orienteret for kirurgi (embryonale podning protocol). Figur 2A udstiller ZIKV (MEX1-44) infektion (immunostained med antistof mod flavivirus gruppe antigen, grønne) i E18.5 cerebral cortex. Pax6 (rød) etiketter NPCs i udviklingslandene cortex. ZIKV blev podet ind E14.5 embryonale hjerner. Ved hjælp af TCID50 analysen fra væv prøver7, vores vækst kurve analyser viser, at ZIKV kan effektivt replikere og vokse i udviklingslandene hjerner (figur 2B, 2 C), som publicerede7. Figur 2D viser vellykket infektion med DENV2 i udviklingslandene cortex ved hjælp af metoden embryonale podning. DENV2 er fundet ved hjælp af en antistof mod flavivirus gruppe antigen (grøn). Figur 2E viser infektion med en anden stamme af ZIKV, den afrikanske lineage (hr.-766). Figur 2F viser en repræsentativ infektion for alternativ-rute, intraplacental podning af ZIKV-Asien (MEX1-44) på scenen E10.5.
Figur 3A er et diagram, der skildrer de vartegn, bruges til at identificere placeringen af injektion i de laterale hjertekamrene til ZIKV podning af P0/1 hvalpe. Figur 3B viser ZIKV (MEX1-44) infektion på P13 hjernebarken efter P0/1 injektion. ZIKV (MEX1-44) er opdaget ved hjælp af antistof mod flavivirus gruppe antigen (rød). Figur 4 viser de fluorescerende perler (rød) der blev brugt til at praktisere injektion placering og lateral ventrikel injektion succes hos voksne.
Figur 1: embryonale podning af ZIKV. (A) diagrammet, der repræsenterer eksponering af en uterin horn, med en note for at undgå injektion af embryoner ved siden af vagina og den mest laterale embryo langs Afrikas horn. (B) Diagram repræsenterer eksponering af en uterin horn, skildrer placeringen af intraplacental og intrauterin injektioner. Disse diagrammer er blevet ændret fra deres oprindelige publikation21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ZIKV embryonale podning ved E14.5. (A) på E18.5 embryonale hjernen er inficeret med ZIKV-Asien (MEX1-44) på tværs af alle lag af udvikle neocortex (skalalinjen er 200 µm). Neurale stamceller er immunolabeled med Pax6 (rød) og ZIKV via flavivirus antigen (grøn). (B) TCID50 resultater fra Postnatal dag 3 (P3) hjernevæv podes på E14.5 med ZIKV-Asien (MEX1-44). Fejllinjer angive s.e.m. af tre uafhængige målinger med en mock og en ZIKV-inficerede hjernen i hver måling (***p < 0,0001, Student's t-test)7. (C) TCID50 resultater beskriver typiske øget vækstkurve af ZIKV viræmi i inficerede føtal hjernevæv. Fejllinjer angive s.e.m. af tre uafhængige målinger med en mock og en ZIKV-Asien (MEX1-44) inficeret hjernen i hver måling. Variansanalyse (ANOVA) registrerer en betydelig stigning i viral titer, efterhånden som udviklingen skrider frem7. (D) Dengue virus (DENV2) inficeret repræsentative histologi (E14.5 embryoner podet med ~ 1 µL af 3,4 x 105 TCID50/mL, skalalinjen er 200 um) og (E) ZIKV-Afrika (MR766) inficeret repræsentative histologi (skala bar 200 µm). (F) ZIKV-Asien (MEX1-44) inficeret repræsentative histologi fra intraplacental injektion strategi (skalalinjen er 200 µm). I alle billeder pletter Hoechst kerner. Disse tal er blevet ændret fra deres oprindelige publikation7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant histologi af P1 podning af ZIKV. (A) Diagram viser metoden til at bestemme injektion placering i de laterale hjertekamrene P1 unger. (B) repræsentative koronale snit frosset organmateriale immunostained for flavivirus gruppe antigen med lav (venstre skala bar er 100 µm) og høj (højre skala bar er 50 µm) forstørrelse af P1 podning af ZIKV på P15 (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst pletter kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: voksen stage intraventrikulært injektion. Voksen mus injiceres med fluorescerende perler blev ofret kort efter operation for at bestemme injektion placering succes (skalalinjen er 200 µm). Sagittal cryosection kunne ses umiddelbart efter skæring som perler ikke kræver yderligere farvning. Hoechst pletter kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en metode til intracerebralt podning af ZIKV i embryonale, neonatal og voksne faser for undersøgelse af ZIKV-induceret skader i hjernens udvikling. Mens ligetil, er der et par overvejelser, at efterforskere bør træffe for at sikre kvaliteten af undersøgelsen og sikkerhed for de involverede.
DENV er nært beslægtet med ZIKV i flavivirus slægten. DENV er ikke blevet aarsagsforbundet forbundet med pediatric hjernen lidelser hos mennesker. DENV2 kan med held inficere og replikere i udviklingslandene hjernen bruger de embryonale indpodningsmetode (~ 1 µL af 3,4 x 105 TCID50/mL) (figur 2D). Derfor, ud over ikke-inficerede Vero celle medier (mock), kan DENV infektion bruges som en negativ kontrol for at studere ZIKV-specifikke patogenese i udviklingslandene hjernen. Det er vigtigt at undgå virus lækage i utero, hvilket kan resultere i uønskede kontaminering af andre embryoner. Det er derfor nødvendigt at kontrollere inficeret og ikke-inficerede individer gennem isolerende hjernevævet fra hvert foster efterfulgt af qRT-PCR eller TCID50 assay. En farvestof kan føjes til viral mellemlang og visuelt bekræfte indsprøjtningen, men test for at sikre, at farven ikke forårsager skader sig selv.
Musen stammer udstille vækst variabilitet, og P1 injektion placeringer skal derfor kontrolleres for hver mus linje. Udføre en mock nyfødte injektion med fluorescerende perler til at visualisere injektionsstedet. Denne indledende undersøgelse vil informere om injektion når ventriklen eller går for dybt ind i hjernevævet. Ideelle resultater, kan blive ofret unger kort efter injektion til at identificere placeringen af de fluorescerende perler i ventriklen. Hele hovedet af pup kan fastsættes natten, indlejret, og cryosectioned at observere den nøjagtige injektion placering. Injektion med olie-mættet sprøjten kræver erfaring og det anbefales at øve med fingeret injektioner med farvestof på parafilm til at kontrollere, at Injektionsvolumen er nøjagtige.
Foranstaltninger, biosikkerhed er kritisk i disse undersøgelser at undgå utilsigtet infektion af laboratoriepersonalet arbejder med virus. Biosikkerhed godkendelser skal foretages på forhånd på anlægget hvor arbejde er ved at blive afsluttet. ZIKV anses en biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) patogen af Forenede Stater Centers for Disease Control og forebyggelse. Alle enkeltpersoner, der arbejder med virus eller arbejder i områder, hvor virus bliver håndteret bør være klar og fortrolig med biosikkerhed protokoller for deres institution. Alle værktøjer og overflader, der udsættes for ZIKV eller DENV2 skal desinficeres med 10% blegemiddel at ødelægge resterende viruspartikler efter brug. Kvinder, der er gravid eller forsøger at blive gravide anbefales ikke interagere med forskningsområder udsat for ZIKV eller DENV2. Alle væv bruges til histologi er fast i 4% PFA til at inaktivere virus til analyse. Opbevaring og dyrkning af virus bør ske i Vero celler i en hætte, der er udpeget for BSL2 arbejde. Stock vira og væv titrering kan kvantificeres ved hjælp af TCID50 protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Abdellatif Benraiss på University of Rochester for hans mentorarbejde og diskussioner relevante til at lære voksne kirurgisk og nyfødte teknikker. Forfatterne også gerne anerkende Dr. James Lauderdale på UGA for brug af hans stereotaxisk udstyr og drøftelser relateret til opsætning af metode for denne teknik, og fremgang for forskning College forskere (BUER) grundlaget for deres støtte og vores NIH støtte (NINDS grants R01NS096176-02, R01NS097231-01 og F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
