Summary
היכולת של בתאי גזע עובריים אנושיים עצמית לחדש להתמיין לכל סוגי התאים בגוף עולה כי הם מחזיקים הבטחה גדולה עבור שניהם יישומים רפואיים ככלי מחקר להתמודדות עם שאלות יסוד בהתפתחות מחלות. כאן, אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול הגזירה של בתאי גזע עובריים אנושיים מעוברים על ידי בידוד immunosurgical של מסת התאים הפנימית.
Abstract
היכולת של בתאי גזע עובריים אנושיים עצמית לחדש להתמיין לכל סוגי התאים בגוף עולה כי הם מחזיקים הבטחה גדולה עבור שניהם יישומים רפואיים ככלי מחקר להתמודדות עם שאלות יסוד בהתפתחות מחלות. כאן, אנו מספקים תמציתי, צעד אחר צעד פרוטוקול הגזירה של בתאי גזע עובריים אנושיים מעוברים על ידי בידוד immunosurgical של מסת התאים הפנימית.
Protocol
עוברי אדם קפוא המשמש הגזירה עובריים אנושיים (הס) בתאי גזע נתרמו למחקר בעקבות הסכמה מדעת תקין תחת פרוטוקולים המחקר נבדקו ואושרו על ידי הוועדה הן על שימוש בבני אדם ואת בתאי גזע עובריים למחקר ועדת פיקוח באוניברסיטת הרווארד .
בפרוטוקול נכתב להלן מתבסס על פרמטרים שפורסמו שדווחו על ידי קוון et al. 2004, עם שינויים קלים.
העובר תרבות
הפשירי עוברים אנושיים באמצעות הפשירי יתרון של קווין קיט תרבות טיפות של המדיום הגלובלי בתוספת Plasmanate 15% עד פיתוח לשלב הבלסטוציסט מורחבת.
Immunosurgery מבוססי הבידוד של מסת התאים הפנימית
אופן ההכנה:
- הכינו צלחות להסרת pellucida zona ו immunosurgery (ראה להלן) על ידי הקמת טיפות של תמיסת כל צלחות 10 ס"מ. שכבת עם שמן מינרלי כדי למנוע אידוי. הכן שורה אחת לכל העובר מיועד הגזירה.
- EmbryoMax Tyrodes חומציים, כמו גם השימוש.
- הגזירה הס תא התקשורת: 75% KO-DMEM, 10% KO-סרום החלפה, Plasmanate 10%, 2.5% תאים ES נבדק בסרום שור העובר (FBS), 2mm Glutamax-I, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 יחידות / ml לפניצילין, סטרפטומיצין 50μg/ml, 0.055mM ב-mercaptoethanol, 5ng/ml bFGF.
- הארנב נגד אדם דם אדומים תא נוגדן ראשוני, מחדש על פי הצעתו של היצרן, בדילול מלא ב 1:10 עם הגזירה התקשורת הס התא.
- גינאה חזירים משלים בסרום, מחדש על פי הצעתו של היצרן, בדילול מלא ב 1:10 עם הגזירה התקשורת הס התא.
- לאזן את כל צלחות 37 ° C בתרבות רקמה חממה לפני השימוש.
- משוך 50μl-100μl pipettes נימי (VWR) לשימוש עוברי העברה. גזור מסתיים עם עט היהלומים לשימוש עם צינורות פיפטה בפה מצויד במסנן 0.2μm.
Immunosurgery נוהל:
הערות:
- בהליך זה, תאים של trophectoderm נהרסים על ידי חשיפה קצרה נוגדנים כנגד תאים אנושיים בד בבד עם פעילות משלימים. לפיכך, הפרוטוקול עובד בצורה הטובה ביותר עם איכות גבוהה בעוברים עם trophectoderm שלמים, כמו שרק את השלמות המבנית של הבלסטוציסט מונע ICM החל גם להיות רגישים התגובה החיסונית.
- כל ההליכים שבוצעו באמצעות היקף לנתיחה מצויד הבמה מחומם.
שלבים:
- יש לשטוף את הפה פיפטה לשמש להעברת העובר עם FBS למנוע עוברים יידבקו.
- העברת הבלסטוציסט מצלחת התרבות לירידה החזקה הס של AT צלחת.
- בגין ההליך על ידי העברת הבלסטוציסט מירידה הס באמצעות סדרה של AT טיפות. ירידה ב שלישי, לצפות פירוק zona pellucida (בדרך כלל 5-30 שניות). היזהר שלא שלמות לטיפול יתר או העובר עלול להיות בסכנה.
- הבלסטוציסט העברה באמצעות סדרה של הגזירה התקשורת הס תא טיפות כדי לשטוף AT. פיפטה וטעינה מוקדמת עם התקשורת מומלץ לנטרל מיד AT התגובה. Blastocysts ניתן לקיים עד כאן הכל היה AT-מעובד.
- העברת הבלסטוציסט דרך סדרה של טיפות נוגדן ראשוני, עוזב ירידה השלישי 30 דקות של הדגרה ב 37 מעלות צלזיוס תרבות רקמות חממה.
- הבלסטוציסט העברה באמצעות סדרה של הגזירה התקשורת הס תא טיפות כדי לשטוף העיקרי.
- העברת הבלסטוציסט דרך סדרה של טיפות משלימים, עוזב ירידה השלישי לצפות תמוגה של תאים trophectoderm. שימו לב הבלסטוציסט במשך 30 השניות הראשונות על הבמה "מבעבע" של תאים trophectoderm כפי שהם lyse. אם תמוגה הוא ציין במסגרת הזמן הזה, לשמור על צלחת על הבמה מיקרוסקופ כדי לפקח על התגובה עד לסיום. אם לא מבעבע הוא ציין במהלך 30 השניות הראשונות, לחזור החממה, בדיקת כל 5 דקות עד שרוב trophectoderm יש lysed. זה יכול לקחת 5-15 דקות. צג התגובה מקרוב כדי למזער את זמן התגובה נזק אפשרי מסת התאים הפנימית.
- הבלסטוציסט העברה באמצעות סדרה של הגזירה התקשורת הס תא טיפות כדי לשטוף את פעילות משלימים.
- בעזרת פיפטה זכוכית בקוטר כי הוא מעט קטן יותר הבלסטוציסט (הנשלפת 10μl צינורות VWR נימי), לצייר את הבלסטוציסט מעלה ומטה כדי להפשיט את רוב trophectoderm lysed.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "גובה =" 270 "/> - פלייט ICM לבודד תאים על מזין של מומת mitotically העובר fibroblasts העכבר (MEFs). MEFs יש להכין יום לפני הגזירה ועברו יום הס הגזירה התקשורת של התא. 4-היטב מנות NUNC לעבוד גם עבור השלבים הראשונים של הגזירה.
- נא לא להפריע צלחת 1-2 הימים הראשונים. לאחר מכן, לבדוק מדי יום תולדה של מושבות גזע עובריים (בדרך כלל לעין בתוך 1-2 שבועות). התקשורת צריכה להיות שונה בכמויות וחצי בכל תחילת יום אחר יום 3.
ES תולדה התא passaging
כאשר תוצאה תא הס הגיע כ 0.5mm או יותר, הוא מוכן להרחבת ידי בחירת מכני.
- מבחינה מכנית לפזר מחצית תוצאה ולהעביר צלחות חדשות המכילות ניזונים טריים. תא גזע עובריים גושים צריך להיות כ 30-50 תאים כל אחד. השאירו החצי השני של תוצאה כמו גיבוי למעבר הראשון (P1). תוצאה (P0) יכול להיות שנקטפו מספר פעמים, תוך שהיא ממשיכה להתרחב.
- מושבות משני ניתן לפזר באופן דומה והרחיב על פני תרבות מנות גדולות עד 3-5 קטעים, בו בזמן שורות תאים חדשים ניתן להתאים passaging האנזימטית עם טריפסין. התוכן בסרום של התקשורת והתרבות צריכים גם להיות מופחת בהדרגה עד 1% 0% במהלך מעברים אלה הראשוני כדי למזער את התא בידול ES.
- הוקמה כל קווי גזע עובריים יש הפקידה על ידי הקפאת למטה חלק קטעים מוקדם הרחבות בעתיד.
- בנוסף, כל שורה התא צריך להיות מאופיין על ידי ניתוח קריוטיפ ומאומתים על ידי מחקרים pluripotency והבחנה במבחנה in vivo.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק החוקרים עם תמציתי, קל לעקוב אחר קווי המתאר של איך להפיק האדם קווי גזע עובריים על ידי בידוד immunosurgical של מסת התאים הפנימית.
Acknowledgments
AEC הוא עמית של קופין ג'יין צ'יילדס הזיכרון הקרן למחקר רפואי ו מעבדות המחקר של מרק. אנו מודים ד Egli ו-C קוואן עצה דיון ניסיוניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
