MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.
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Artículo de método
Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares
En este artículo
Resumen
Resumen
Circulación del suero microRNAs (miRNAs) han demostrado promesa como biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y el infarto agudo de miocardio (IAM), siendo liberado de las células cardiovasculares a la circulación. Circulación miRNAs son muy estables y pueden cuantificarse. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede vincularse con la patología y algunos miRNAs Mostrar tejido alta y especificidad de la enfermedad. Búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares es de importancia para la investigación médica. Recientemente, se ha inventado la reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica. dPCR exhibe cualidades técnicas superiores, incluyendo una baja variabilidad, alta linealidad y alta sensibilidad en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Así, la dPCR es un método más exacto y reproducible para cuantificar directamente el miRNAs, particularmente para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación describimos cómo realizar efectivamente la PCR digital para evaluar el número de copia absoluta en muestras de suero.
Introducción
Circulación miRNAs se han identificado como marcadores promisorios para un número de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares1. Los miRNAs son pequeñas, moléculas de ARN monocatenario no codificante (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) están implicadas en la regulación postranscripcional mediante la alteración de la traducción del ARN mensajero y que influencia gene expression2, y son liberados a la circulación en los Estados fisiológicos y patológicos. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede ser vinculada a la patología, y algunos miRNAs tejido alta y especificidad de la enferme....
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Protocolo
1. extracción de miRNA de suero, Plasma
Nota: Para cuantificar apropiadamente miRNAs, el aislamiento correcto microRNA del plasma/suero es un paso crucial. Una cosa fundamental a tener en cuenta, sobre todo porque existen diferentes protocolos, es seguir el mismo flujo de trabajo durante el procesamiento de las muestras. En este protocolo, miRNA se extrae de 50 μl de suero. No use más de 200 μL como este límite el proceso de extracción correcto.
- Preparar suero o descongelar las muestras congeladas.
- Añadir 250 μl (5 volúmenes) de reactivo de lisis comercial a 50 μl de suero. Apoyar la lisis con un vórtex. Coloque el tubo ....
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Resultados
PCR digital combinado con sondas fluorescentes de hidrólisis permite a los investigadores cuantificar directamente las cantidades absolutas de miRNAs específicos en copias/μl. Como la muestra de dPCR se reparte en reacciones de PCR individuales aproximadamente 20.000, dPCR no requiere técnica Replica10. El sistema de dPCR utiliza un análisis estadístico matemático de Poisson de señales fluorescentes (diferencia entre las reacciones positivas y negativas) que permit.......
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Discusión
PCR digital es un método relativamente novedoso punto final de la PCR que permite la cuantificación absoluta directa de ácidos nucleicos dentro de una muestra. El método posee ventajas particulares, incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día y una sensibilidad superior11,12. Además, debido a la partición de la muestra en aproximadamente 20.000 solo reacciones y análisis de punto final, dPCR es más robusto a substancias que interf.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ARN | |||
| 50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Alemania | 217184 | Kit para la extracción de microARN. El kit contiene tampón comercial RWT (llamado número uno en el manuscrito) y RPE (llamado número dos en el manuscrito). |
| miRNeasy Suero/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Muestra & Assay Technologies, Hilden, Alemania | 219610 | Espiga para normalización, Secuencia: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'< |
| strong>Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | Kit de 4366597 para transcripción inversa de microARN | |
| Ensayos de microARN TaqMan M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | . 4440887 | Ensayos utilizados en transcripción inversa |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | . 4440887 | Número de ensayo 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | Número de | ensayo 4440887 000200 |
| Placa de PCR, 96 pocillos, segmentado, semifaldón | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | AB0900 | Placa de 96 pocillos para transcripción inversa |
| Microseal ' B’ sellos | Sellos Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | MSB1001 Lámina para garantizar un almacenamiento adecuado | |
| C1000 Termociclador | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | 1851196 | Cycler utilizado para transcripción inversa |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p | Tecnologías de ADN integradas | personalizadas | Secuencia: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR |
| Supermix para sondas (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 1863024 | Supermix utilizada en la generación de gotas |
| Ensayos de microARN TaqMan | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | . 4440887 | Assays utilizados en PCR digital (sonda de hidrólisis fluorescente) |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | . | 4440887 Número de ensayo 001352, cebadores comerciales |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU | . 4440887 | Número de ensayo 000200, cebadores comerciales |
| DG8 Cartuchos y juntas | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | El cartucho 1864007 toma hasta 8 muestras para la generación de gotas | |
| Cartucho DG8 Soporte | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. | 1863051 | Sostiene cartuchos en generación de gotas Generación de gotas |
| Aceite para sondas | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 1863005 | Aceite utilizado en la generación de gotas |
| ddPCR Placas de 96 pocillos | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 12001925 | Placa de 96 pocillos para ddPCR |
| Placa de PCR Termosellado, lámina, perforable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU. | 1814040 | Lámina perforable, compatible con el lector de gotas |
| ddPCR Aceite | lector de gotas Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | 1863004 | Aceite utilizado en la lectura de gotas |
| Generador de gotas QX100 o QX200 Bio-Rad | Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | 1863002 | Generador de gotas, genera las gotas a partir de la emulsión de muestra/aceite |
| PX1 PCR Sellador de placas | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | 1814000 | Sella la placa antes de PCR |
| C1000 Termociclador | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 1851196 | Ciclador utilizado para ddPCR |
| QX100 o QX200 Lector de gotas | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 1863003 | Lee las gotas positivas y negativas para PCR con un detector óptico |
| Control de tampón ddPCR para sondas | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | . 1863052 | Control de blanco y para llenar los pocillos restantes de cassette de 8 pocillos |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU | 1864011 Programa para la lectura de gotas | |
| Prisma Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU | Programa de análisis estadístico |
Referencias
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al.
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Reimpresiones y permisos
