Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Data innsamling og analyse i hjernestammen fremkalt respons Audiometri i mus

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59200
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 3, 4, 5, 5, 6, 1,7, 1, 1
1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

Summary

Hjernestammen fremkalt respons audiometri er et viktig redskap i klinisk nevrofysiologi. I dag, hjernestammen fremkalt respons audiometri er også brukt i grunnleggende vitenskap og prekliniske studier som involverer både farmakologiske og genetiske dyremodeller. Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan hørsels hjernestammen responser kan bli vellykket innspilt og analysert hos mus.

Abstract

Hjernestammen fremkalt respons audiometri (BERA) er av sentral relevans i klinisk nevrofysiologi. Som andre fremkalt (EP) teknikker, slik som visuelt fremkalt potensiale (VEPs) eller somatosensory fremkalt potensiale (SEPs), utløses hørsels potensialet (AEPs) av repeterende presentasjon av identiske stimuli, elektroencefalografiske (EEG) respons som senere gjennomsnitt resulterer i distinkte positive (p) og negative (n) krengingen. Hos mennesker kan både amplituden og ventetiden til individuelle topper brukes til å karakterisere endringer i synkronisering og Lednings hastighet i de underliggende neuronal kretser. Viktigere, AEPs er også brukt i grunnleggende og prekliniske vitenskap å identifisere og karakterisere hørsels funksjonen i farmakologiske og genetiske dyremodeller. Enda mer, er dyremodeller i kombinasjon med farmakologisk testing benyttet for å undersøke for potensielle fordeler i behandlingen av sensorineural hørselstap (f. eks, alder-eller støy-indusert hørsels underskudd). Her gir vi en detaljert og integrerende beskrivelse av hvordan å spille inn hørsels hjernestammen-fremkalt respons (ABRs) i mus ved hjelp av klikk og tone-burst program. Et bestemt fokus for denne protokollen er på pre-eksperimentelle dyr bolig, anestesi, ABR-opptak, ABR filtreringsprosesser, automatiserte wavelet amplitude vekst funksjon analyse, og latency deteksjon.

Introduction

Et sentralt aspekt av hjernen fysiologi er dens evne til å behandle miljøinformasjon som resulterer i ulike iboende eller ytre produksjon, for eksempel læring, minne, følelsesmessige reaksjoner, eller motoriske svar. Ulike eksperimentelle og diagnostiske tilnærminger kan brukes til å karakterisere den elektrofysiologisk respons av individuelle neuronal celletyper eller klynger/ensembler av neurons innenfor en stimulans-relaterte neuronal kretser. Disse elektrofysiologisk teknikkene dekker ulike spatiotemporal dimensjoner på mikro-, Meso-og macroscale1. Mikroskala nivået inkluderer spenning og strøm klemme tilnærminger i forskjellige patch-Clamp moduser ved hjelp, for eksempel, kultivert eller akutt dissosiert neurons1. Disse in vitro-teknikkene gjør det mulig å karakterisering av individuelle nåværende enheter og deres farmakologiske moduleringshjul2,3. En vesentlig ulempe er imidlertid mangelen på systemisk informasjon når det gjelder mikro-og macrocircuitry informasjons integrasjon og prosessering. Denne verdifall er delvis overvunnet av in vitro teknikker av mesoscale, slik som multielectrode arrays som tillater for samtidige ekstracellulære multielectrode innspillinger ikke bare i kulturperler neurons men også i akutte hjerne skiver4, 5. mens microcircuitries kan bevares i hjernen skiver til en viss grad (for eksempel i hippocampus), langtrekkende sammenkoblinger er vanligvis tapt6. Til syvende og sist, for å studere den funksjonelle sammenkoblinger innen neuronal kretser, er systemisk in vivo elektrofysiologisk teknikker på macroscale metoden for valg7. Disse tilnærmingene inkluderer blant annet overflate (epidural) og dype (intracerebrale) EEG innspillinger som utføres i både mennesker og dyremodeller1. EEG signaler er overveiende basert på synkronisert Synaptic input på pyramideformet neurons i ulike kortikale lag som kan være hemmende eller eksitatoriske i hovedstol, til tross for generell overvekt av eksitatoriske input8. Ved synkronisering, eksitatoriske postsynaptic potensielle-baserte skift i ekstracellulære elektriske felt summeres for å danne et signal av tilstrekkelig styrke til å bli registrert i hodebunnen ved hjelp av overflate elektroder. Spesielt krever en synlig hode bunns innspilling fra en individuell elektrode aktiviteten til 10000 av pyramideformet neurons og en kompleks armamentarium av tekniske enheter og prosesserings verktøy, inkludert en forsterker, filtreringsprosesser (low-pass filter, høypassfilter, hakk filter), og elektroder med spesifikke lederegenskaper.

I de fleste eksperimentelle dyrearter (dvs. mus og rotter), den menneske-baserte hodebunnen EEG tilnærmingen er teknisk ikke aktuelt, da signalet generert av underliggende cortex er for svakt på grunn av begrenset antall synkroniserte pyramideformet neurons9, 10,11. I gnagere, overflate (hodebunn) elektroder eller subdermal elektroder er dermed sterkt forurenset av elektro og hovedsakelig electromyogram gjenstander som gjør høykvalitets EEG innspillinger umulig9,11, 12. Når du bruker unanesthetized fritt bevegelige mus og rotter, er det derfor obligatorisk å direkte ta opp enten fra cortex via epidural elektroder eller fra de dype, intracerebrale strukturene for å sikre direkte fysisk tilkobling av sensing spissen av bly/implantert elektroden til signal-generering neuronal celle klynger. Disse EEG-tilnærmingene kan utføres enten i et begrensende bundet systemoppsett eller ved hjelp av nonrestraining implanterbare EEG-radio telemetri tilnærming9,10,11. Begge teknikkene har sine fordeler og ulemper, og kan være en verdifull tilnærming i den kvalitative og kvantitative karakterisering av beslag mottakelighet/beslag aktivitet, døgn rhythmicity, søvn arkitektur, oscillasjon aktivitet, og synkronisering, inkludert tids frekvens analyse, kilde analyse, etc.9,10,13,14,15,16,17.

Mens bundet systemer og radio telemetri tillater EEG innspillinger under begrensende/semirestraining eller nonrestraining forhold, henholdsvis relaterte eksperimentelle forhold ikke samsvarer med kravene for ABR innspillinger. Sistnevnte etterspørsel etter definerte akustiske stimuli som presenteres full av gjentagelser over tid med definerte posisjoner av en høyttaler og eksperimentelle dyr og kontrollerte lydtrykksnivåer (SPLs). Dette kan oppnås enten ved hode fiksering under begrensende forhold eller etter anestesi18,19. For å redusere eksperimentell stress, dyr er normalt anesthetized under ABR eksperimentering, men det bør vurderes at anestesi kan forstyrre ABRs19,20.

Som en generell karakteristikk, er EEG bygget opp av forskjellige frekvenser i et spenningsområde på 50-100 μV. bakgrunns frekvenser og amplituder sterkt avhengig av den fysiologiske tilstanden til forsøks dyret. I våken tilstand, beta (β) og gamma (γ) frekvenser med lavere amplitude dominerer. Når dyr blir søvnig eller sovner, Alpha (α), theta (θ), og deltaet (δ) frekvenser oppstår, viser økt EEG amplitude21. Når en sensorisk kanal (f. eks, den akustiske veien) stimuleres, informasjon forplantning er formidlet via neuronal aktivitet gjennom perifere og sentrale nervesystemet. En slik sensorisk (f.eks. akustisk) stimulering utløser såkalte EPs-eller fremkalt respons. Spesielt, Event-relaterte potensialer (ERPs) er mye lavere i amplitude enn EEG (dvs. noen mikrovolt bare). Således, alle individ ERP basert på en enkelt stimulans ville gå tapt imot det høyere-amplitude EEG miljøet. Derfor, en innspilling av en ERP krever repeterende anvendelse av identiske stimuli (f. eks, klikk i ABR innspillinger) og påfølgende snitt for å eliminere enhver EEG bakgrunns aktivitet og gjenstander. Hvis ABR innspillinger er gjort i anesthetized dyr, er det lett å bruke subdermal elektroder her.

I hovedsak inkluderer AEPs kort ventetid EPs, som normalt er relatert til ABRs eller BERA, og videre, senere utbruddet potensialer som midlatency EPs (midlatency responser [MLR]) og lang ventetid EPs22. Det er viktig at forstyrrelse i informasjons behandlingen av hørsels informasjonen ofte er et sentralt trekk ved nevropsykiatriske sykdommer (demyeliniserende sykdommer, schizofreni, etc.) og assosiert med AEP-forandringer23,24 ,25. Mens atferdsmessige undersøkelser er bare i stand til å avsløre funksjonell svekkelse, AEP studier tillater presis spatiotemporal analyse av hørbar dysfunksjon knyttet til spesifikke nevroanatomi strukturer26.

ABRs så tidlig, kort latens, er akustisk EPs vanligvis oppdaget ved moderat til høy-intens klikk program, og det kan forekomme opptil sju ABR-topper (WI-wVII). De viktigste bølgene (Wi-wV) er knyttet til følgende nevroanatomi strukturer: Wi til hørselsnerven (den ytre delen, i det indre øret); WII til cochlear nucleus (proksimale del av hørselsnerven, hjernestammen terminering); WIII til overlegen olivary kompleks (SoC); WIV til lateral LEMNISCUS (ll); WV til opphør av lateral LEMNISCUS (ll) i den underlegne COLLICULUS (IC) på kontralateral side27 (supplerende figur 1). Det bør bemerkes at WII-WV er sannsynlig å ha mer enn én anatomisk struktur av stigende hørbar veien bidrar til dem. Spesielt er den nøyaktige sammenhengen mellom topper og underliggende strukturer i hørsels trakten fortsatt ikke helt avklart.

I audiology, ABRs kan brukes som en screening og diagnostisk verktøy og for kirurgisk overvåking28,29. Det er viktigst for identifisering av dysacusis, hypacusis og anacusis (f.eks. i alders relatert hørselstap, støy indusert hørselstap, metabolsk og medfødt hørselstap, og asymmetrisk hørselstap og hørsels underskudd på grunn av misdannelser eller misdannelser, skader og svulster)28. ABRs er også relevant som en screening test for hyperaktiv, intellektuelt nedsatt barn eller for andre barn som ikke ville være i stand til å svare på konvensjonelle audiometri (f. eks, i nevrologiske/psykiatriske sykdommer som ADHD, MS, autisme etc.29 , 30) og i utvikling og kirurgisk montering av cochlea implantater28. Til slutt kan ABRs gi verdifull innsikt i de potensielle ototoxic bivirkningene av neuropsychopharmaceuticals, slik som antiepileptika31,32.

Verdien av oversettelsen av nevrofysiologiske kunnskap innhentet fra farmakologiske eller transgene mus modeller til mennesker har blitt demonstrert i en rekke innstillinger, spesielt på nivået av ERPs i hørbar paradigmer hos mus og rotter33, 34,35. Ny innsikt i endrede tidlige AEPs og tilhørende endringer i hørsels informasjonsbehandling hos mus og rotter kan dermed oversettes til mennesker og er av sentral betydning for karakterisering og endophenotyping av hørsels-, nevrologiske og nevropsykiatriske sykdommer i fremtiden. Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan ABRs kan bli vellykket registrert og analysert hos mus for grunnleggende vitenskapelige, toksikologiske og farmakologiske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene i det tyske Rådet for Animal Care og alle protokoller ble godkjent av den lokale institusjonelle og nasjonale komité for dyr omsorg (Landesamt für natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, State Kontoret til Nordrhein-Westfalen, Institutt for natur, miljø og forbruk [LANUV NRW], Tyskland). Forfatterne videre sertifisere at alle dyr eksperimentering ble utført i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr (NIH Publications no. 80-23) revidert 1996 eller UK Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 og tilhørende retningslinjer, eller det europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24. november 1986 (86/609/EØF) og september 22, 2010 (2010/63/EU). Spesifikk innsats ble gjort for å minimere antall dyr som brukes og deres lidelse (3R [utskifting, reduksjon, og raffinement] strategi).

1. eksperimentelle dyr

  1. Utvalg av forsøksdyr og arter
    1. Utfør ABR-studier i gnagere/gnagere-modeller (dvs. mus eller rotter) som oppfyller kravene til homologi, isomorphism og forutsigbarhet knyttet til en bestemt menneskelig sykdom. Dette er av spesiell betydning i form av grunnleggende aspekter i translational nevrovitenskap.
      Merk: Tenk at tilgjengelig diverse mus og rotte stammer kan vise forskjeller i grunnleggende fysiologiske og patofysiologiske egenskaper36,37,38. Disse mus/rotte line-relaterte særegenheter må tas i betraktning i eksperimentell planlegging.
    2. Vurder mus-og rotte belastnings spesifikke endringer i fysiologi og farmakologi som kan ha innvirkning på elektrofysiologisk eksperimenter (f.eks. endret bedøvelse følsomhet, døgn rhythmicity, [audiogenic] anfall mottakelighet, alder, og genetisk bakgrunn)39,40,41,42.
    3. Inkluder den kjønnsspesifikke lagdeling i studie utformingen. Husk at estrous syklus kan ha stor innvirkning på anestesi mottakelighet, sentrale rhythmicity, døgn avhengig het og beslag aktivitet (hørsels anfall) og sensorisk (hørbar) informasjonsbehandling43,44 , 45. dermed utføre en kjønnsspesifikk analyse.
      Merk: Begrens til mannlige mus hvis den økonomiske og eksperimentelle kapasiteten er begrenset, selv om ulike nevrofysiologiske parametre fra normalt sykling kvinner ikke synes å vise økt variasjon i forhold til menn46.
  2. Hus og håndtering av dyr
    1. Huset mus eller rotter i individuelt ventilerte bur inne i et dyr anlegg.
    2. Flytte forsøksdyr fra dyret anlegget til ventilerte skap ligger i spesielle Lab rom beregnet for anestesi, ABR elektrodeplassering, og ABR innspillinger.
    3. Sørg for at dyrene er plassert i et ventilert kabinett under standardmiljø forhold (dvs. med en temperatur på 21 ± 2 ° c, 50%-60% relativ fuktighet, og en konvensjonell 12/12 h lys/mørk syklus). La dyrene akklimatisere seg og tilpasse seg dette døgn mønsteret i minst 14 dager før påfølgende eksperimentering.
    4. Bruk klar polykarbonat bur type II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, et område på 410 cm2) for boliger mus i grupper av 3-4 og bruke klart polykarbonat bur type III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, et område på 800 cm2) for rotter. Gi Ad lib tilgang til drikkevann og standard mat pellets.
    5. Unngå separasjon/isolering av forsøksdyr før og etter ABR innspillinger som isolasjon kan utøve alvorlig stress påvirker eksperimentelle resultater. Således, sted dyrene rygg i deres hjem bur fulgte bedøvelse, ABR elektrode plasseringen, og ABR registreringene.
    6. Ikke Påfør åpne bolig forhold som de er utsatt for en rekke eksperimentelle ulemper, spesielt i hørsels studier. Ventilerte skap, i stedet beskytte mot akustisk stress før og mellom eksperimentelle hørsels prosedyrer som ellers kunne føre til sensorineural hørselstap (f. eks, støy-indusert hørselstap) og dermed påvirke resultatene.
    7. Bruk mus-og rotte-spesifikke sanitær, anestesi, og teknisk utstyr slik at verken mus eller rotter kan fornemme tilstedeværelsen av hverandre som gjensidig sensorisk oppfatning av rivaling arter kan gi opphav til unødvendige forvirrende faktorer i studiene.

2. mus anestesi

  1. Utføre anestesi ved hjelp av injiserbare anestesi. Forbered en kombinasjon av ketamin hydrochloride (gnagere dosering: 100 mg/kg) og xylazine hydrochloride (gnagere dosering: 10 mg/kg) i 0,9% NaCl eller ringer løsning og injisere dyret intraperitonealt basert på sin kroppsvekt.
    Merk: innånding narkose via isoflurane er ikke anbefalt som ABR prosedyren normalt krever en lyddemping avlukke og Faraday buret, noe som resulterer i romlige begrensninger i innspillingen oppsett. Selv om mange bedøvelse handle på NMDA systemet og åpenbart påvirke ABR innspillingen utfall, en ikke-bedøvelse begrensende tilnærming i ABR innspillinger er ikke anbefalt som begrensende prosedyrer under bevissthet indusere dramatiske stress til dyret, med alvorlig påfølgende gjenstand formasjon i ABRs.
  2. Observer dyrene nøye for dybden av anestesi ved å utføre en hale knipe, foten klemme, og overvåking åndedrett rate (mus: 150-220 åndedrag/min). Se etter mulige gisper og motvirke om nødvendig.
    Merk: ulike muse linjer eller farmakologiske musemodeller kan vise ulike følsomhet for anestesi. Det samme gjelder for mutant mus modeller. Endotrakeal intubering er ikke et must i denne eksperimentelle innstillingen og ikke anbefalt. Som intubering øker risikoen for traumer til luftrøret og infeksjon, fordelen/risikoen for endotrakeal intubering under ABR prosedyren er negativ.

3. generelle aspekter ved perianesthetic ordninger og instrumentering

  1. Påfør supplerende varme under og etter ABR-opptak ved hjelp av et homeothermic varmeteppe for å opprettholde dyrets kropps kjernetemperatur. Oppretthold sistnevnte ved 36.5-38.0 ° c (98.6-100.4. ° f).
    Merk: nedkjøling er en risikofaktor i små gnagere på grunn av deres høye forhold kroppsoverflate (mus kroppsoverflate = 10,5 x (vekt i g)2/3; Rat Body surface = 10,5 x (vekt i g)2/3) til kroppen volumet.
  2. Dekket dyrene ' Eyes med Petroleum-basert kunstig tåre salve eller 5% dexpanthenol under hele ABR innspillingen forarbeide å unngå hornhinnen uttørking. Fortsett med denne prosedyren til den blinkende refleks er ferdig restaurert.
  3. Sterilisere de eksperimentelle instrumentene (se materialfortegnelsen) ved hjelp av en autoklav eller desinfeksjonsmidler.
    Merk: bruk av et varme BAS ert kirurgisk instrument steriliseringsapparat med glassperler anbefales.
  4. For nøyaktig ABR-elektrodeplassering, bruk et kikkert kirurgisk forstørrelses mikroskop med en kald lyskilde for intens belysning via fleksible eller selvbærende bevegelige lys føringer.
  5. Bruk en ren Laboratoriefrakk, en ansiktsmaske, et hode deksel og sterile hansker under eksperimentell dyr håndtering og eksperimentering.
    Merk: optimale instrumenter og rekvisita kan variere mellom laboratorier og må oppfylle laboratorie spesifikke og institusjonelle standarder.

4. ABR-opptak

Merk: protokollen som beskrives her, er basert på et kommersielt tilgjengelig ABR-system for monaural og binaural innspillinger. Viktigere, det vitenskapelige spørsmålet skal tas opp må oppfylle de tekniske spesifikasjonene til ABR-systemet som brukes. ABR-analyse av binaural innspillinger kan for eksempel brukes til å undersøke den laterale kodingen av hørsels stimuli på hørsels veien og studere perifer lateral asymmetri i nevropsykiatriske sykdommer.

  1. Utfør en kalibrering av stimulering frekvenser på hver dag med opptak ved å plassere en mikrofon koblet til en forforsterker og behandlingssystemet (se tabell over materialer) inne i lyddemping avlukke på stedet med riktig Det eksperimentelle murine øret vil plasseres.
    1. Slå på forforsterker som er koblet til mikrofonen minst 5 min før kalibreringen for å muliggjøre likevekts av systemet.
    2. Slå på oscilloskop.
    3. Plasser mikrofonen som er koblet til en forforsterker inne i lyddemping skapet for å etterligne det eksperimentelle murine øret.
    4. Åpne den kommersielt tilgjengelige programvaren for behandling og oppkjøp (se tabell over materialer).
    5. Velg kalibreringen Cal200K -filen i programvaren for å aktivere kalibrerings konfigurasjonsmodus og velg parametere i henhold til de eksperimentelle forholdene.
    6. Bruk prosessor systemet til å utføre kalibreringsprosedyren. Sørg for at de tekniske spesifikasjonene til mikrofonen og høyttaleren i form av SPL-grenser, frekvensområde og distribusjon harmonerer.
    7. Velg og start den forhåndsdefinerte Klikk stimulering protokollen.
    8. Kjør et enkelt klikk SPL (fortrinnsvis, den maksimale SPL) for å kontrollere at spekteret av lyd stimuli som analyseres av online Fast Fourier Transformation (FFT) av oscilloskop matcher kravene (betydelig energi område).
    9. Velg og start den forhåndsdefinerte stimulering-protokollen med tone burst innen rekkevidde (f.eks. 1-42 kHz).
    10. Bekreft frekvensspekteret av de innspilte akustiske test stimuli ved hjelp av et oscilloskop og online FFT.
      Merk: daglig kalibrering av systemet og stimulering frekvenser er nødvendig for å garantere at stimulering frekvenser og SPLs er innenfor akseptable arbeids områder.
  2. Plasser anesthetized musen inne i en lyddemping avlukke foret med akustisk skum.
    Merk: hele kabinettet skal være dekket av en Faraday bur (skreddersydd meshed metall eller en kommersiell en) for å skjerme ABR innspillinger fra eksterne elektriske forstyrrelser og beskytte dem mot støy.
  3. For opptak av monaural hjernestammen-utløste hørsels potensialer, sett inn subdermal elektroder i rustfritt stål på toppunktet, aksial av pinnae (positiv [+] elektrode) og ventrolateral av høyre eller venstre høyde (negativ [-] elektrode) avhengig av øret som skal måles. For binaural innspillinger plasserer du de negative elektrodene både på høyre og venstre pinnae. Plasser jordelektroden på hofte av dyret (supplerende figur 1).
    1. Før innsetting, danner en krok form på spissen av rustfritt stål elektroden slik at subdermal fiksering av elektrodene er garantert47.
  4. Utfør impedans målinger av alle elektroder før hver innspilling for å verifisere riktig elektrode posisjonering/ledningsevne. Bruk kontrollknappen impedans på de firekanals headstage for å verifisere impedans nivået til hver elektrode.
    Merk: impedans bør være mindre enn 5 kΩ.
  5. Record ABRs under fri-feltet forhold ved hjelp av en enkelt høyttaler (frekvensbåndbredde, for eksempel på 1-65 kHz) plassert 10 cm motsatt til talerstolen av dyrene (høyttaler ledende kant vinkelrett på musen er interaural akse). Sørg for at plasseringen av musen hode/mus ørene er at av kalibrerings mikrofonen, avhengig av den valgte spesifikke avstanden mellom høyttaleren og mikrofonen under kalibrering.
    Merk: i stedet for fritt felts forhold kan øre slangen også brukes. Men, spesielle forholdsregler og tester er nødvendig for å bestemme SPLs i disse innstillingene.
  6. Programmere stimulans protokollene for klikk og tone sprekker ved hjelp av selv-programmert eller kommersielt tilgjengelig programvare (se tabell over materialer). De individuelle stimulans parametrene som er oppført nedenfor, må legges til det relaterte grafiske brukergrensesnittet.
    1. Start med konfigurasjonen av Klikk stimulans enhet (dvs. en 100 μs varighet stimulans med vekslende polaritet [veksling mellom kondens og sjeldnere] og den definerte betydelig energi. Bruk denne stimulans enheten til å analysere og bestemme Klikk terskler, ABR symmetri av venstre og høyre øre, ABR W (I-IV) amplituder, og W (I-IV) latencies senere.
    2. Initiere programvaren og bruke konfigurasjonsvinduet for å legge til Klikk stimulans parametere. Klikk Kjør for å kjøre protokollen.
    3. Fortsett med konfigurasjonen av den andre stimulans foretaket, som er en 4,5 MS tone burst (forbigående sinusformet puls) av vekslende polaritet med hann konvolutt stige og høst tider på 1,5 MS hver (gate/rampe tid varighet). Vurder en minimum tone burst varighet på 3 MS, spesielt for lavfrekvente tone sprekker. Bruk denne stimulans til å analysere og identifisere frekvens spesifikke hørsels terskler i alle genotyper.
    4. Analog med steg 4.6.2, bruk konfigurasjonen vindu å sammenlegge klang briste stimulans parameterene og falle i staver effektuere å løpe protokollen (idet fastslo av fabrikanten48).
    5. For tone burst studier, programmere riktig frekvensområde som skal testes avhengig av det vitenskapelige spørsmålet (f. eks, fra 1-42 kHz i 6 kHz trinn). Sørg for at frekvensområdene som skal brukes, oppfyller de tekniske egenskapene til høyttaleren (i dette tilfellet en multifield magnetisk høyttaler med en frekvensbåndbredde på 1-65 kHz for fri-eller lukkede feltforhold).
    6. For snitt, angi antall sekvensielle akustiske stimuli (Klikk eller tone serieopptak), for eksempel på 300x med en hastighet på 20 Hz.
    7. Øk SPLs i 5 dB trinn for klikk og 10 dB trinn for tone støt, fra 0 dB opptil 90 dB (økende SPL-modus).
      Merk: både økende og synkende SPL-moduser er beskrevet i litteraturen. SPL-trinn størrelsen kan være tilpasset på grunn av vitenskapelige spørsmål.
  7. Bestem en ABR data oppkjøpet varighet på 25 MS, og starter med en 5 MS Baseline periode før den enkelte akustisk stimulans utbruddet (pre-ABR Baseline) og overstiger en 10 MS ABR del av en annen 10 MS Baseline (post-ABR Baseline) (supplerende figur 1 ).
  8. Bruk en passende samplingsfrekvens for ABR-datainnhenting (f.eks. 24,4 kHz) og båndpassfilter (høy pass: 300 Hz, lavt pass: 5 kHz) ved hjelp av et 6-polet Butterworth-filter. Aktiver hakk filteret om nødvendig.
    Merk: samplingsfrekvens og filteregenskaper kan være tilpasset på grunn av eksperimentelle krav.
  9. Overfør de resulterende bioelektriske signalene som er tatt opp fra de subdermal elektrodene til et hoved trinn og videre forover til en forforsterker med passende forsterkning (f.eks. 20 ganger).
  10. Bruk en bestemt ABR system prosessering programvare for å koordinere høyttaler kontroll og ABR oppkjøp, prosessering, snitt, og data Management.
  11. Prøv å utføre hele ABR protokoller (for klikk-og tone burst-fremkalt hørsel terskler, peak amplitude, og Peak latency analyse, etc.) innen ca 45 min. Dette tilsvarer tidspunktet for dyp narkose med 100/10 mg ketamin/xylazine intraperitonealt.
  12. Pass på at kalibreringen, programmering/justeringer for stimulans presentasjon og oppkjøp, filterinnstillinger, etc. fungerer som forventet før anesthetizing dyret og utføre selve opptaket.

5. ABR-analyse

  1. Klikk-og tone burst-fremkalt ABR hørsels terskel analyse
    1. Utfør automatisert terskel deteksjon basert på tidligere publikasjoner for å unngå potensielle uoverensstemmelser i ABR terskelen bestemmelse ved visuell inspeksjon/estimering49,50,51,52.
    2. Definer tre distinkte tidsvinduer (TWs) for å beregne signal-til-støy-forhold (SNR): TW1 (0-5 MS), tw2 (5-15 MS) og tw3 (15-25 MS) (supplerende figur 1).
    3. Beregn støy standardavviket for grunnlinjen i de to distinkte TWs-feltene (dvs. TW1 og tw3) der ingen AEPs er observert. Denne beregningen kan gjøres ved hjelp av selv-programmert programvare.
    4. Beregn for hver SPL-måling i en ABR-post som angir både gjennomsnittet og standardavviket for de samlede dataene til TW1 og tw3.
    5. Tilbakestill alle opptaksprøver enkeltvis med tilsvarende beregnet middel for å fjerne en hvilken som helst DC-forskyvning.
    6. For fastsettelse av hørsels terskel, Identifiser den laveste SPL (dB) der minst én bølge amplitude verdi (WI-wIV) i vinduet ABR responstid (tw2) overskred firedoblet til det tidligere beregnede standardavviket.
      Merk: Hvis det ikke ble oppdaget noen ABR-bølge for klikk-og frekvens terskel analyse ved maksimal SPL, er det tildelt et nominelt terskel nivå på 100dB til øret.
  2. ABR bølge amplitude og Wave latency analyse
    1. Gjennomføre en wavelet tilnærming ved hjelp av den meksikanske hatten wavelet å bestemme Temporal-sekvensiell arrangement av positive (p) bølger (topper) samt negative (n) bølger (groper) ved hjelp av en standard wavelet av kontinuerlig wavelet Transform (CWT)-baserte algoritme for mønster avstemming52 (supplerende figur 1).
      1. Matematisk, er CWT representert som følger53.
        Equation
        Her, s (t) er signalet, a er skalaen, b er oversettelsen, ψ(t) er mor wavelet, ψa, b(t) er skalert og oversatt wavelet, og C er 2D matrise av wavelet koeffisienter.
    2. I utgangspunktet bruke 55-dB måling av hver ABR kjøre for å identifisere de beste skala parametere for hver bølge som skal sendes til CWT, som resulterer i tre klasser: skalaer 0.5-4 for alle n-bølger, 0,5-6 for alle p-bølger, og 0,5-12 for WIV AS dette er den bredeste bølge i prøvene.
      Merk: 55 dB SPL ble valgt som bølger er vanligvis mest fremtredende her og kan bli pålitelig oppdaget.
    3. Bevise alle klasser å pålitelig oppdage riktig Temporal samlokalisering av Wi-wIV innenfor alle 55 dB målinger.
    4. For å fastslå ABRw i-WIV i nøyaktig Temporal rekkefølge innenfor 55 dB-målingen, identifiseres p-topper og n-topper (groper) i en fast sekvens ved hjelp av relative posisjoner på tidligere identifiserte topper for å begrense tidsvinduet til etterfølgende skanninger.
    5. Når alle de ni toppene er identifisert på 55 dB, bruker relaterte verdier som utgangspunkt for den timelige søke rammen for de tilstøtende lyd trykks målingene (50 dB og 60 dB) før identifisering av topper 1-9 gjentas.
    6. På denne måten kan du bestemme p-og n-topper på alle dB-nivåer (55-0 dB og 60-90 dB) hvis det er mulig. Når en p-og n-Peak er ikke lenger identifisert av wavelet analyse, sin timelige ordningen er satt ved å beregne Temporal offset av toppen til andre peak identifisert i forrige dB nivå.
    7. Bruk av Temporal offset til topper til andre p-og n-peak innenfor gjeldende desibel nivå resulterer i maksimalt åtte bestemmes timelige posisjoner for udefinert toppene hvorav gjennomsnittet er tatt som den nærmeste tilnærmingen.
    8. For å evaluere amplituden vekst funksjon og latency sammenligning av alle bølger (WI-wIV), karakteriserer den maksimale amplituder og gjennomsnittlig latencies av hver av p-toppene innenfor tidsrammen for de relaterte n-topper.
    9. Kontroller visuelt alle resultater basert på det selv programmerte automatiske wavelet verktøyet etterpå, og, om nødvendig, Ekskluder individuelle ABR-kjøringer fra statistikken hvis de ikke oppfyller de strenge kriteriene for inkludering/kvalitet.
      Merk: i både automatisert analyse og visuell inspeksjon av ABRs anbefales en dobbel-blindet tilnærming.

6. post-operative omsorg og post-ABR behandling

  1. Kontinuerlig overvåke dyrene før de har fått tilbake bevisstheten og er i stand til å opprettholde sternal recumbency.
  2. Ikke returnere et dyr som har gjennomgått ABR innspillinger til selskap med andre dyr før den er fullstendig gjenopprettet.
  3. Injiser karprofen (mus: 1x 5-10 mg/kg, subkutant; rotte: 1x 2,5-5,0 mg/kg, subkutant) for postoperativ smertebehandling.
    Merk: langvarig smertebehandling er ikke nødvendig da ABR opptaks elektroder er satt inn subkutant.
  4. Postoperativt, fôr fuktet pellets for å lette mat opptak. Forsiktig observere mat (~ 15 g/100 g kroppsvekt/dag; ~ 5 g/24 h) og vann (~ 15 mL/100 g kroppsvekt/dag; ~ 5 mL/24 h) forbruk.
  5. Overvåk dyrene nøye for avkastningen av deres normale stillinger og atferd.
    Merk: systemisk administrasjon av antibiotika som enrofloksacin eller Trimethoprim and-sulfonamide anbefales ikke her, da subdermal elektrodeplassering bare er minimal invasiveness. Anvendelse av antibiotika bør begrenses med mindre tegn til lokal eller generalisert betennelse oppstår.
  6. Oppfølging postexperimental utvinning etter ABR innspillinger ved å kontrollere dyrets kroppsvekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klikk-og tone burst-fremkalt ABR-innspillinger kan brukes til å evaluere forskjeller i hørsels terskelen, funksjon for amplitude vekst og sammenligning av tidsforsinkelser. Click-fremkalt ABRs i SPL økende modus er avbildet i figur 1 for kontroller og to eksemplarisk mutant muse linjer som er mangelfull for Cav3,2 T-type spenning-gated ca2 + channel (dvs. cav3,2+/- og ca v3,2 null mutanter [Cav3,2-/-]). Som skissert ovenfor, er en kjønnsspesifikk undersøkelse generelt anbefalt, på grunn av sex-spesifikke forskjeller i hørsels parametre hos mennesker54,55 og mus56,57. ABRs til fri-feltet klikk (0,1 MS) og tone burst (1 – 42 kHz i 6 kHz trinn, 4,5 MS totalt med en 1,5 MS ramp tid) akustiske stimuli ble registrert som beskrevet i protokollen. Merk at Vertex-positive potensialer er plottet som oppadgående krengingen som avbildet i representative Klikk-fremkalt innspillinger for kvinnelig cav3,2+/+ (figur 1a), cav3,2+/- (figur 1B ) og cav3,2-/- mus (figur 1C). I denne innstillingen, foreslo representative ABRs i kvinner en økt Klikk-fremkalt ABR hørsel terskel og endret amplitude vekst funksjon i kvinnelige cav3,2-/- mus sammenlignet med cav3,2+/+ og cav 3,2+/- dyr. Den samme tendensen ble observert for menn som foreslo en økt Klikk-fremkalt ABR terskler og reduserte amplituder i cav2,3-/- sammenlignet med kontroller og heterozygot cav3,2+/- mus. Eksemplarisk tone burst-fremkalt ABRs er avbildet i figur 2 for kvinnelig Cav3,2+/+, cav3,2+/-, og cav3,3-/- mus (alle dyr var 20 ukers alder).

Som et første skritt i å analysere generell hørsel ytelse, klikk-fremkalt ABRs for ulike SPLs (0 – 90 dB) ble undersøkt ved hjelp av automatiserte ABR terskel deteksjon system beskrevet i punkt 5 i protokollen (Figur 3). De analyserte dyrene var alder matchet som aldring kan ha en dramatisk innvirkning på sensorineural hørselstap58,59. Deretter ble potensielle endringer i ABR terskel nivåer fremkalt av forskjellige tone burst frekvenser (1 – 42 kHz, Figur 4) analysert. I eksemplarisk mus linjer, cav2,3+/- og cav3,2-/- utstilt økt Klikk-og tone burst-relaterte hørsel terskler i forhold til kontrollene (alle dyrene var 20 ukers alder).

Ved hjelp av wavelet-basert tilnærming skissert ovenfor, klikk-fremkalt ABR amplitude vekst funksjon og ABR bølgeform latency analyse ble utført (fig . 5 og fig . 6, henholdsvis). Sistnevnte gir innsikt i mulig spatiotemporal påvirkning av genet av interesse på hørbar informasjonsbehandling i det indre øret og hjernestammen.

Figure 1
Figur 1: Klikk-fremkalt ABRs i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Representative ABRs innhentet fra (A) cav3,2+/+, (B) cav3,2+/-, og (C) cav3,2-/- kvinnelige mus ved klikk stimulering i den økende SPL-modus (fra 0 – 90 dB med 5 dB SPL-trinn). For snitt, hver stimulans foretaket ble brukt 300 ganger på 20 Hz. Utbruddet av den akustiske stimulans indikeres av en vertikal rød linje. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: tone burst-fremkalt ABRs i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Representative ABRs fra (A) cav3,2+/+, (B) cav3,2+/-, og (C) cav3,2- mus som følger tone pakker på 1 – 42 kHz (6 kHz trinn) på en SPL av 80 DB. For snitt, hver stimulans foretaket ble presentert 300 ganger ved 20 Hz. Utbruddet av den akustiske stimulans indikeres av en vertikal rød linje. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Klikk-fremkalt ABR-basert hørsel terskler i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Click-fremkalt Audiometriske hørsel terskel (A) kvinne og (B) hann cav3,2+/+ (kvinne: n = 12; hann: n = 13), cav3,2+/- (kvinne: n = 10; mann: n = 9), og cav3,2-/- mus (kvinne: n = 10; male: n = 9). Data er plottet som gjennomsnittet ± SEM. statistiske betydninger ble fastsatt ved bruk av α-nivå = 0,05 og p-verdier definert som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Tone burst-FREMKALT ABR-basert hørsels terskler i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). 1 – 42 kHz (6 kHz trinn) tone burst-fremkalt ABR-basert Audiometriske hørsels terskler for cav3,2+/+ (kvinne: n = 12; hann: n = 12; ▲), cav3,2+/- (hunn: n = 10; mann: n = 8; ■), og cav3,2-/- dyr (kvinne: n = 10; mann: n = 9; ○). Data er plottet som GJENNOMSNITTET ± SEM. statistiske betydninger ble bestemt ved bruk av α-nivå = 0,05 og p-verdier definert som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: amplitude vekst funksjon på klikk-baserte ABR innspillinger i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Wi-wIV amplitude (i mikrovolt) plottet mot en økende SPL (i desibel) for klikk-fremkalt ABR bølge analyse i cav3,2+/+ (kvinne: n = 12; mann: n = 11; svart linje som representerer tilnærmet kontroll kurve inkludert 95% sikkerhetsintervall i grått), cav3,2+/- (kvinne: n = 8; hann: n = 7; ■), og cav3,2-/- dyr (hunn: n = 7; mann: n = 9 ; ○). Både cav3,2-/- kvinnelige og mannlige mus utstillingen betydelig forsinket økning i amplitude vekst over den økende SPLs for (A og B) wi, (C og D) WII, og (G og H) WIV sammenlignet med cav3,2+/+ og cav3,2+/- mus. (E og F) For WIII, bare cav3,2-/- hann mus vist en betydelig forsinkelse i amplitude vekst over den økende SPL sammenlignet med kvinnelige cav3,2-/- dyr. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM. statistiske betydninger ble bestemt ved bruk av α-nivå = 0,05 og p-verdier definert som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: ventetid analyse ved klikk-fremkalt ABR innspillinger i kontroller og mutant mus (cav3,2+/-, cav3,2-/-). Latencies (i millisekunder) for hver ABR-bølge (WI–w IV) ved 65 dB SPL er avbildet for cav3,2+/+ (hunn: n = 12; hann: n = 11), cav3,2+/- (kvinne: n = 8; mann: n = 7), og Cav3,2-/- mus (kvinne: n = 8; hann: n = 9). Merk at latency analyse kan også utføres på bestemte sensasjon nivåer. Data er avbildet som gjennomsnittet ± SEM. statistiske betydninger ble fastsatt ved bruk av α-nivå = 0,05 og p-verdier definert som *p < 0,05; * *p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: ABR-arkitektur og elektrodeplassering. (A) representative ABR-opptak på 65 dB SPL. Den opprinnelige Baseline (TW1, 5 MS) ble etterfulgt av test stimulans (Klikk eller tone burst) og tw2 (10 ms) som inneholder de tidlige hjernestammen-vakte potensialer. TW2 ble etterfulgt av en annen BASELINE (tw3, 10 ms). De opprinnelige periodene ble brukt til å beregne SD-verdien for grunnlinje støyen. Når et individ ABR bølgen (WI-wIV) amplitude overskredet SD av Baseline støy i firedoblet, ble hørselen terskelen nådd. For bølge amplitude og latens sammenligning, en "meksikansk lue"-basert wavelet tilnærming ble gjennomført for å automatisk oppdage negative topper (blå-gul stripete linjer) og positive topper (rød-grå stripete linjer). Grønne kors indikerer absolutt maksimal ABR bølge amplituder og viser ikke tilnærmet verdier basert på wavelet tilnærming. (B) for ABR-opptakene ble subdermal elektroder i rustfritt stål med en krok formet tupp brukt. Referanse elektroden ble plassert ved venstre hofte, den positive (+) elektroden var plassert på toppunktet (aksial av pinnae), og den negative (-) elektroden ble satt inn ventrolateral av høyre høyde, avhengig av om en monaural eller binaural innspilling ble Utført. Dette tallet er modifisert fra Lundt et al.60. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en detaljert og integrerende beskrivelse av hvordan å spille inn hørbar fremkalt hjernestammen svar i mus. Det setter spesielt fokus på dyr forbehandling, anestesi, og potensielle metodisk forvirrende faktorer. Sistnevnte omfatter blant annet kjønn, muse linje, alder, og bolig forhold. Det bør bemerkes at alle disse faktorene kan ha innvirkning på sensorineural hørselstap og grunnleggende aspekter ved behandling av hørsels informasjon. Dermed er passende lagdeling av hørbar profilering studier obligatorisk.

Den instrumentering av AEP innspillinger har enormt utviklet seg i de siste 50-60 år, og i dag, kommersielle ABR opptaks systemer er tilgjengelige som har forbedret og forenklet anvendelse av teknikken, men har også innført nye fallgruver. Noen av disse aspektene er diskutert her. Først bør brukeren bli vant til ABR-systemet, det vil si, instrumentering består av stasjonære eller bærbare datamaskinen, forforsterker, forsterkeren, elektroden input boksen, og potensielle transdusere (f. eks høyttalere, sette inn øreplugger, Supra-aural hodetelefoner og bein oscillatorer). Spesielt, opptaksforholdene er av sentral betydning. På grunn av sin høye mottakelighet må ABR-innspillinger være skjermet for å beskytte dem mot forurensning med ekstern elektrisk støy og for å garantere et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold.

Et annet viktig aspekt er instrumentering selv (for eksempel stimulans generator, transdusere, og utløsere). De mest brukte typer stimuli i mus er 100 μs Klikk og kort varighet tone sprekker med en modulert amplitude og/eller frekvens egenskaper. Transdusere kan presentere en rekke akustiske stimuli enten til ett øre eller til begge ørene. Her har vi presentert ABR resultater ved hjelp av en enkelt høyttaler rostral til forsøks dyret. Men andre tilnærminger er også mulig, inkludert Tubal-stil sette øreplugger enten i ett øre eller begge ørene. Supra-aural hodetelefoner som brukes i mennesker er ikke gjennomførbart i mus. Som litteratur illustrerer, ulike tilnærminger kan være vellykket, og de bør tilpasses avhengig av eksperimentelle behov. Spesiell oppmerksomhet må vies til nøyaktig av avtrekkeren som er avgjørende for signal snitt som denne digitale pulsen bestemmer når hver enkelt stimulans blir presentert. For riktige innspillinger må utløseren og stimulans utbruddet være synkron, som representerer tidspunktet null. Kommersielt tilgjengelige ABR opptaks systemer normalt inkluderer selvstendige triggere når de enkelte stimuli presenteres. I mange systemer, det er eksterne innganger som tillater en tilkobling fra en ekstern stimulans generator og en tilhørende utløser. I begge tilfeller viste det seg å være verdifullt å kontrollere stimulans og utløse egenskaper ved hjelp av et eksternt oscilloskop. Spesiell oppmerksomhet må også vies til oppkjøpet parametre (f. eks differensial forsterkning, filtrering, analoge versus digitale filtre, filter design, og parametre for signal snitt). Spesielt parametere presentert i protokollen som presenteres her passer de eksperimentelle kravene til eksemplarisk resultatene avbildet ovenfor. Men tilpasninger, for eksempel i samplingsfrekvensen, antall stimuli søkt for snitt, og deres søknad frekvens, kan være nødvendig avhengig av eksperimentelle innstillingene.

Til slutt bør noen korte kommentarer gjøres på elektrode impedans, elektrodetyper og elektrodeplassering. Elektrodene opptre som antenner, plukke opp spenningsendringer fra under huden. Subkutan elektrodeplassering er obligatorisk som bare anvendelse av elektroder på huden eller hodebunnen er ikke egnet på grunn av motstanden i det ytre hud laget (dvs. stratum corneum). Mens hos mennesker den elektriske ledningsevne er normalt forbedret ved slipe døde hudceller og anvendelsen av en elektrolytt gel eller lim, dette er vanligvis ikke gjort og egnet i mus der subdermal elektroder brukes. Grensesnittet av elektroden og huden danner elektroden impedans som inkluderer de elektriske egenskapene til dirigenten totalt. Dirigenten egenskaper inkluderer materialets egenskaper av elektroden og arealet av kontakt elektroden, egenskapene til vevet inkludert rusk (olje, skitt, svette, etc.), og elektrolyttløsning... Elektrode materialet inkluderer sølv, gull, platina, bly, tinn og rustfritt stål med lav impedans og lav elektrode potensialer. Det må utvises forsiktighet for at elektrode materialet er inert under opptaksforholdene. Med sølv, dette oppnås ved hjelp av såkalte komplekse elektroder (dvs. sølv-sølv klorid [AG-AgCl] elektroder). I dette tilfellet gir det elektriske dobbelt laget en fri utveksling av ioner som ytterligere reduserer impedans. Det anbefales ofte at elektrode impedans ikke bør overstige 5 kΩ og at impedans på de enkelte elektrodene (minst tre) er sammenlignbare. Det anbefales også at interelectrode impedans bør være under 2 kΩ. Opptaks elektroden representerer en lang metalltråd med et isolerende belegg. Lednings elektroden kobles til opptaks utstyret via en plugg, i de fleste tilfeller forforsterker/forsterkeren. I mus, den andre enden av elektrode tråden er vanligvis oppbygging av en nål elektrode som kan stå rett eller-bedre-arcuated. Andre elektrodetyper, for eksempel disk-eller kopp-formede enere, uansett om de er for gjenbruk eller pregelled disponibel, er begrenset til bruk hos mennesker og gjelder ikke for mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Christina Kolb (German Center for nevrodegenerative sykdommer [DZNE]) og Dr. Robert Stark (DZNE) for deres assistanse i dyreoppdrett og dyr helsevesenet. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, Bonn, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AEP/OAE Software for RZ6 (BioSigRZ software) Tucker-Davis Technologies (TDT) BioSigRZ
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 2000 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Cages (Macrolon) Techniplast 1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg/ml Virbac Tierarzneimittel GmbH PZN 11149509
Cold light source Schott KL2500 LCD 9.705 202
Cotton tip applicators (sterile) Carl Roth EH12.1
Custom made meshed metal Faraday cage (stainless steel, 2 mm thickness, 1 cm mesh size) custom made custom made
5% Dexpanthenole (Bepanthen eye and nose creme) Bayer Vital GmbH PZN: 01578681
Disposable Subdermal stainless steel Needle
electrodes, 27GA, 12mm		 Rochester Electro-Medical, Inc. S03366-18
Surgical drape sheets (sterile) Hartmann PZN 0366787
Ethanol, 70% Carl Roth 9065.5
1/4'' Free Field Measure Calibration Mic Kit Tucker-Davis Technologies (TDT) PCB-378C0
Gloves (sterile) Unigloves 1570
Graefe Forceps-curved, serrated FST 11052-10
GraphPad Prism 6 Software, V6.07 GraphPad Prism Software, Inc. https://www.graphpad.com/
Heat-based surgical instrument sterilizer FST 18000-50
Homeothermic
heating blanked		 ThermoLux 461265 / -67
Ketanest S (Ketamine), 25mg/ml Pfizer PZN 08707288
Ringer’s solution (sterile) B.Braun PZN 01471434
Matlab software MathWorks, Inc. https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4-Channel Low Imped. Headstage Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4LI
Medusa 4-Channel Pre-Amp/Digitizer Tucker-Davis Technologies (TDT) RA4PA
Microphone PCB Pieztronics 378C01
Multi Field Speaker- Stereo Tucker-Davis Technologies (TDT) MF1-S
Oscilloscope Tektronix DPO3012
Optical PC1 express card for Optibit Interface) Tucker-Davis Systems (TDT) PO5e
Askina Braucel pads (cellulose absorbet pads) B.Braun PZN 8473637
Preamplifier PCB Pieztronics 480C02
RZ6 Multi I/O Processor system (BioSigRZ) Tucker-Davis Technologies (TDT) RZ6-A-PI
0.9% saline (NaCl, sterile) B.Braun PZN:8609255
SigGenRZ software Tucker-Davis Technologies (TDT) https://www.tdt.com/
Software R (version 3.2.1) + Reshape 2 (Version 1.4.1) + ggplot 2 (version 1.0.1) + datatable (version 1.9.4), + gdata (version 2.13.3), + pastecs (version 1.3.18), + waveslim (version 1.7.5), + MassSpecWavelet (version 1.30.0) The R Foundation, R Core Team 2015 Open Source Software (freely distributable)
Sound attenuating cubicle Med Associates Inc. ENV-018V
Standard Pattern Forceps, 12cm and 14.5 cm length FST 11000-12, 11000-14
Leukosilk tape BSN medical GmbH & Co. KG PZN 00397109
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm FST 11021-12
Uniprotect ventilated cabinet Bioscape THF3378
Ventilated cabinet Tecniplast 9AV125P
Xylazine (Rompun), 2% Bayer Vital GmbH PZN 1320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sporns, O., Tononi, G., Kotter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLOS Computational Biology. 1 (4), e42 (2005).
  2. Bebarova, M. Advances in patch clamp technique: towards higher quality and quantity. General Physiology and Biophysics. 31 (2), 131-140 (2012).
  3. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  4. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  5. Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
  6. Heuschkel, M. O., Fejtl, M., Raggenbass, M., Bertrand, D., Renaud, P. A three-dimensional multi-electrode array for multi-site stimulation and recording in acute brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 135-148 (2002).
  7. Kimiskidis, V. K. Transcranial magnetic stimulation (TMS) coupled with electroencephalography (EEG): Biomarker of the future. Reviews in Neurology. 172 (2), 123-126 (2016).
  8. Nunez, P. L. Toward a quantitative description of large-scale neocortical dynamic function and EEG. Behavioral Brain Science. 23 (3), 371-437 (2000).
  9. Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plasticity. 2016, 8213878 (2016).
  10. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), e54216 (2016).
  11. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
  12. Kallstrand, J., Nehlstedt, S. F., Skold, M. L., Nielzen, S. Lateral asymmetry and reduced forward masking effect in early brainstem auditory evoked responses in schizophrenia. Psychiatry Research. 196 (2-3), 188-193 (2012).
  13. Muller, R., et al. Automatic Detection of Highly Organized Theta Oscillations in the Murine EEG. Journal of Visualized Experiments. (121), e55089 (2017).
  14. Papazoglou, A., et al. Gender specific hippocampal whole genome transcriptome data from mice lacking the Cav2.3 R-type or Cav3.2 T-type voltage-gated calcium channel. Data in Brief. 12, 81-86 (2017).
  15. Papazoglou, A., et al. Gender-Specific Hippocampal Dysrhythmia and Aberrant Hippocampal and Cortical Excitability in the APPswePS1dE9 Model of Alzheimer's Disease. Neural Plasticity. 2016, 7167358 (2016).
  16. Papazoglou, A., et al. Motor Cortex Theta and Gamma Architecture in Young Adult APPswePS1dE9 Alzheimer Mice. PLOS ONE. 12 (1), e0169654 (2017).
  17. Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plasticity. , 781731 (2015).
  18. Welch, T. M., Church, M. W., Shucard, D. W. A method for chronically recording brain-stem and cortical auditory evoked potentials from unanesthetized mice. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 60 (1), 78-83 (1985).
  19. Church, M. W., Gritzke, R. Effects of ketamine anesthesia on the rat brain-stem auditory evoked potential as a function of dose and stimulus intensity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 67 (6), 570-583 (1987).
  20. van Looij, M. A., et al. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing Research. 193 (1-2), 75-82 (2004).
  21. Schomer, D. L., da Silva, F. L. Niedermeyer's Electroencephalography: Basic Principles, Clinical Applications, and Related Fields. , Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  22. De Cosmo, G., Aceto, P., Clemente, A., Congedo, E. Auditory evoked potentials. Minerva Anestesiology. 70 (5), 293-297 (2004).
  23. Rosburg, T. Auditory N100 gating in patients with schizophrenia: A systematic meta-analysis. Clinical Neurophysiology. 129 (10), 2099-2111 (2018).
  24. DiLalla, L. F., McCrary, M., Diaz, E. A review of endophenotypes in schizophrenia and autism: The next phase for understanding genetic etiologies. American Journal of Medical Genetics Part C Seminar in Medical Genetics. 175 (3), 354-361 (2017).
  25. Walsh, P., Kane, N., Butler, S. The clinical role of evoked potentials. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 76 Suppl 2, ii16-ii22 (2005).
  26. Opgen-Rhein, C., Neuhaus, A., Urbanek, C., Dettling, M. New strategies in schizophrenia: impact of endophentotypes. Psychiatrische Praxis. 31 Suppl 2, S194-S199 (2004).
  27. Knipper, M., Van Dijk, P., Nunes, I., Ruttiger, L., Zimmermann, U. Advances in the neurobiology of hearing disorders: recent developments regarding the basis of tinnitus and hyperacusis. Progress in Neurobiology. 111, 17-33 (2013).
  28. Miller, C. A., Brown, C. J., Abbas, P. J., Chi, S. L. The clinical application of potentials evoked from the peripheral auditory system. Hearing Research. 242 (1-2), 184-197 (2008).
  29. Manouilenko, I., Humble, M. B., Georgieva, J., Bejerot, S. Brainstem Auditory Evoked Potentials for diagnosing Autism Spectrum Disorder, ADHD and Schizophrenia Spectrum Disorders in adults. A blinded study. Psychiatry Research. 257, 21-26 (2017).
  30. Talge, N. M., Tudor, B. M., Kileny, P. R. Click-evoked auditory brainstem responses and autism spectrum disorder: A meta-analytic review. Autism Research. 11 (6), 916-927 (2018).
  31. Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion in Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
  32. Ismi, O., et al. The Effect of Methylphenidate on the Hearing of Children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder. International Archive in Otorhinolaryngology. 22 (3), 220-224 (2018).
  33. Michna, M., et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice. Journal of Physiology. 553 (Pt 3), 747-758 (2003).
  34. Platzer, J., et al. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102 (1), 89-97 (2000).
  35. Willaredt, M. A., Ebbers, L., Nothwang, H. G. Central auditory function of deafness genes. Hearing Research. 312, 9-20 (2014).
  36. Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Research. 354 (1), 221-246 (2013).
  37. Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mammalian Genome. 24 (3-4), 89-94 (2013).
  38. Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Progress in Neurobiology. 96 (2), 220-241 (2012).
  39. Turner, J. G., Parrish, J. L., Hughes, L. F., Toth, L. A., Caspary, D. M. Hearing in laboratory animals: strain differences and nonauditory effects of noise. Computational Medicine. 55 (1), 12-23 (2005).
  40. Neumann, P. E., Collins, R. L. Genetic dissection of susceptibility to audiogenic seizures in inbred mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5408-5412 (1991).
  41. Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. European Journal of Anaesthesiology. 25 (2), 113-117 (2008).
  42. Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Dependence. 92 (1-3), 217-227 (2008).
  43. Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
  44. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
  45. Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (8), 811-825 (2005).
  46. Prendergast, B. J., Onishi, K. G., Zucker, I. Female mice liberated for inclusion in neuroscience and biomedical research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 40, 1-5 (2014).
  47. Ingham, N. J., Pearson, S., Steel, K. P. Using the Auditory Brainstem Response (ABR) to Determine Sensitivity of Hearing in Mutant Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1 (2), 279-287 (2011).
  48. Tucker-Davis Technologies. SigGenRZ Manual. , Available from: https://www.tdt.com/files/manuals/SigGenRZ_Manual.pdf (2012).
  49. Bogaerts, S., Clements, J. D., Sullivan, J. M., Oleskevich, S. Automated threshold detection for auditory brainstem responses: comparison with visual estimation in a stem cell transplantation study. BMC Neuroscience. 10, 104 (2009).
  50. Probst, F. J., et al. A point mutation in the gene for asparagine-linked glycosylation 10B (Alg10b) causes nonsyndromic hearing impairment in mice (Mus musculus). PLOS ONE. 8 (11), e80408 (2013).
  51. Alvarado, J. C., Fuentes-Santamaria, V., Gabaldon-Ull, M. C., Blanco, J. L., Juiz, J. M. Wistar rats: a forgotten model of age-related hearing loss. Frontiers in Aging Neuroscience. 6, 29 (2014).
  52. Du, P., Kibbe, W. A., Lin, S. M. Improved peak detection in mass spectrum by incorporating continuous wavelet transform-based pattern matching. Bioinformatics. 22 (17), 2059-2065 (2006).
  53. Daubechies, I. Ten lectures on wavelets. , Society for Industrial and Applied Mathematics. Philadelphia, PA. (1992).
  54. Pearson, J. D., et al. Gender differences in a longitudinal study of age-associated hearing loss. Journal of the Acoustical Society of America. 97 (2), 1196-1205 (1995).
  55. Murphy, M. P., Gates, G. A. Hearing Loss: Does Gender Play a Role? Medscape Womens Health. 2 (10), 2 (1997).
  56. Henry, K. R. Males lose hearing earlier in mouse models of late-onset age-related hearing loss; females lose hearing earlier in mouse models of early-onset hearing loss. Hearing Research. 190 (1-2), 141-148 (2004).
  57. Ison, J. R., Allen, P. D., O’Neill, W. E. Age-related hearing loss in C57BL/6J mice has both frequency-specific and non-frequency-specific components that produce a hyperacusis-like exaggeration of the acoustic startle reflex. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 8 (4), 539-550 (2007).
  58. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing Research. 130 (1-2), 94-107 (1999).
  59. Zhou, X., Jen, P. H., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  60. Lundt, A., et al. Cav3.2 T-Type Calcium Channels Are Physiologically Mandatory For The Auditory System. Neuroscience. , In Press (2019).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 147 amplitude hørselssystem gjennomsnitt binaural hjernestammen klikk hørsel terskel latency monaural systemisk nevrofysiologi tone burst wavelet
Data innsamling og analyse i hjernestammen fremkalt respons Audiometri i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C.,… More

Lundt, A., Soos, J., Henseler, C., Arshaad, M. I., Müller, R., Ehninger, D., Hescheler, J., Sachinidis, A., Broich, K., Wormuth, C., Papazoglou, A., Weiergräber, M. Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice. J. Vis. Exp. (147), e59200, doi:10.3791/59200 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter