Burada, bir CRISPR/Cas9 sistemi üzerinden araç-T hücrelerini genetik olarak düzenlemek için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
CAR-T hücrelerinde GM-CSF ' ı Knock Out için CRISPR/Cas9 kullanma
Bu makalede
Özet
Özet
Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi, kanser için bir kesme kenarı ve potansiyel olarak devrimci yeni tedavi seçeneğidir. Ancak, kanser tedavisinde yaygın kullanımı için önemli sınırlamalar vardır. Bu sınırlamalar, sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve nörotoksisite (NT) ve sınırlı genişleme, efektör fonksiyonları ve katı tümörlerde anti-tümör aktivitesi gibi benzersiz toksisitelerin gelişmesini içerir. Bir strateji Car-t etkinliğini artırmak için ve/veya CAR-t hücrelerinin kontrol toksisiteleri Car-t hücre üretimi sırasında kendilerini CAR-k hücrelerinin genomu düzenlemek için. Burada, araç-T hücrelerinde CRISPR/Cas9 gen düzenlemenin, granülocayt makrophaj kolonisi uyarıcı faktörüne (GM-CSF) ve Cas9 için bir kılavuz RNA içeren bir lentiviral yapı ile dönüştürücü yoluyla kullanımını tarif ediyoruz. Örnek olarak, biz GM-CSF CRISPR/Cas9 aracılı nakavt açıklanmaktadır. Biz bu GM-CSFk/o Car-t hücrelerinin etkili daha az GM-CSF kritik T hücre fonksiyonu koruyarak ve gelişmiş anti-tümör aktivite içinde vivo VAHŞI tip Car-T hücrelere kıyasla sonuç ürettiğimiz göstermiştir.
Giriş
Chimerik antijen reseptör T (CAR-T) hücre tedavisi kanser tedavisinde büyük söz sergiler. 1 , CD19 (CART19) hedefleyen 2 adet Car-T hücre terapisi, son zamanlarda Birleşik belirtilen ve Avrupa 'da çok merkezli klinik çalışmalarda çarpıcı sonuçlar gösterdikten sonra B hücreli malignite kullanımı için onaylanmıştır. 3 ' ü , 4 , CAR-T hücrelerinin daha yaygın kullanımına yönelik 5 bariyer, katı tümörlerde ve sitokin serbest bırakma Sendromu (CRS) ve NÖROTOKSISITE (NT) dahil olmak üzere ilişkili toksisitelerde sınırlıdır.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol Mayo Clinic 'in kurumsal Inceleme Kurulu (ıRB) ve kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (ıBC) yönergelerini takip eder.
1. CART19 hücre üretimi
- T hücresi yalıtımı, stimülasyon ve ex-vivo kültürü
- Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir hücre kültürü kaputu tüm hücre kültürü çalışmalarını gerçekleştirin. Periferik kan mononükleer hücreleri hasat (pbmcs) bu pbmcs uygun bir kaynak olduğu bilinmektedir gibi Aferez sırasında toplanan de-teşhis normal donör kan konileri.13
- PBMCs yalıtmak için, bir 50 mL yoğunluk degrade ayırma tüpü bir yoğunluk degrade orta 15 mL ekleyin. Hücre bindi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 GM-CSFk/o CART19 HÜCRELERINDE GM-CSF azaltılması gösterir. T hücrelerinin genomunun, GM-CSF ' d e değiştirildiğini doğrulamak için, GM-CSFk/o CART19 hücrelerinde (ŞEKIL 1a) tid sıralaması kullanılmıştır. CAR-T hücre yüzeyi boyama, T hücrelerinin canlı CD3 + hücrelerde (Şekil 1B) gating tarafından araç yüzey reseptörü in vitro başarıyla ifade ettiğini doğrular. GM-CSF akı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu raporda, CAR-T hücrelerinde ikincil modifikasyonları teşvik etmek için CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanmak üzere bir metodoloji açıklanmaktadır. Özellikle, bu gRNA faiz gen hedefleme ve GM-CSFk/o CART19 hücreleri oluşturmak için Cas9 içeren bir viral vektör ile lentiviral dönüştürücü kullanılarak gösterilmiştir. Daha önce GM-CSF nötralizasyonu bir xenograft modelinde CRS ve NT iyileştirir göstermiştir. 12 daha önce açıklandığı gıbı, GM-CSFk/o Car-T hücreler ÜRETIM sürecind.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
SSK, Novartis 'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasında bir anlaşma kapsamında) lisanslı araç T-Cell terapisi alanında patent üzerine bir mucidi. Bu çalışmalar Humanigen (SSK) bir hibe tarafından kısmen finanse edildi. RMS, MJC, RS ve SSK bu iş ile ilgili patentler üzerinde mucitler vardır. Laboratuar (SSK) tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys ve actinium 'dan fon alır.
Teşekkürler
Bu çalışma K12CA090628 (SSK), Ulusal kapsamlı kanser ağı (SSK), Mayo Clinic Center bireyselleştirilmiş Tıp (SSK), Predolin Vakfı (SSK), Mayo Clinic Office çeviri uygulama (SSK) gelen hibe yoluyla destekleniyordu ve Mayo Clinic tıp bilimcisi eğitim programı Robert L. Howell hekim-bilim adamı Bursu (RMS).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CD3 Monoklonal Antikor (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoklonal Antikor (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Seçim Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Hücre Tedavi Sistemleri) Dynabeads CD3 / CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX Sistemi B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | akış sitometresi |
| dimetil sülfoksit | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu | Gibco | 14190-144 & | |
| Dynabeads MPC-S (Manyetik Parçacık Konsantratörü) | Uygulamalı Biyosistemler | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Mıknatıs | STEMCELL Teknolojileri | 18002 | |
| EasySep İnsan T Hücresi İzolasyon Kiti | KÖK HÜCRE Teknolojileri | 17951 | negatif seçim manyetik boncuklar; 17951RF, uçlar ve tampon içerir |
| Fetal sığır serumu | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Fare Anti-İnsan CD107a ve nbsp; | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fiksasyon Ortamı (Orta A) | GAS001S100 | ||
| GenCRISPR gRNA Yapısı: Adı: CSF2 CRISPR kılavuzu RNA 1; Tür: İnsan, Vektör: pLentiCRISPR v2; Direnç: ampisilin; Kopya numarası: Yüksek; Plazmid hazırlama: Standart teslimat: 4 μ g (Ücretsiz ücretli) | GenScript | N/A | özel sipariş |
| Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Masaüstü Genetik İnsan AB Serumu | ||
| ; Erkek Bağışçılar; AB tipi; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gama Monoklonal Antikoru (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti, 405 nm uyarma için | Invitrogen | L34966 | |
| Lenforep | KÖK HÜCRE Teknolojileri | 07851 | |
| Monensin Solüsyonu, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Fare Anti-İnsan CD28 Klonu CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Fare Anti-İnsan CD49d Klonu 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Fare Anti-İnsan MIP-1 ve beta; PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Dondurma Kabı | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, klon G5 | ATCC | CRL-3273 | akut lenfoblastik lösemi hücre hattı |
| Nükleaz İçermeyen Su | Promega | P119C | |
| Olympus Vakum Filtre Sistemleri, 500 mL, PES Membran, 0.22uM, steril | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene CN Membranlı Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri 0.45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I İndirgenmiş Serum Orta (1X), Sıvı | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Fare Anti-İnsan IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X), Sıvı | Gibco | 10378-016 | |
| Geçirgenlik Ortamı (Orta B) | Canlandırıcı | GAS002S100 | |
| PureLink Genomik DNA Mini Kiti | Canlandırıcı | K182001 | |
| Puromisin Dihidroklorür | MP Biyomedikal, Inc. | ||
| QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti | QIAGEN | 28704 | |
| Sıçan Anti-İnsan GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Teknolojileri | 21000 | Tam Otomatik Hücre Ayırıcı |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Teknolojileri | 85450 | |
| Sodyum Azide, %5 (a/h) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serumsuz Hematopoetik Hücre Ortamı | Lonza | 04-418Q |
Kaynaklar
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
