Generación de fibrillas alfa-Synucleinas preformadas de monómeros y uso in vivo

Summary

El objetivo de este artículo es delinear los pasos requeridos para la generación de fibrillas a partir de alfa-synuclein monomérica, control de calidad subsiguiente y uso de las fibrillas preformadas in vivo.

Abstract

El uso del modelo in vivo de fibrina preformada (α-SYN PFF) de la sinnucleinopatía está ganando popularidad entre los investigadores con el objetivo de modelar la sinnucleinopatía y la degeneración nigroestriatal de la enfermedad de Parkinson. La estandarización de la generación α-SYN PFF y la aplicación in vivo es fundamental para garantizar una patología α-SYN consistente y robusta. Aquí presentamos un protocolo detallado para la generación de fibrillas a partir de los pasos de control de calidad monomérico α-SYN, post-fibrilización, y los parámetros sugeridos para la inyección neuroquirúrgica exitosa de PFFs α-SYN en ratas o ratones. Comenzando con α-SYN monomérica, la fibrlización se produce durante un período de incubación de 7 días mientras se agita en condiciones óptimas de amortiguación, concentración y temperatura. El control de calidad posterior a la fibrlización se evalúa mediante la presencia de fibrillas pelletables mediante un ensayo de sedimentación, la formación de conformación amiloide en las fibrillas con un ensayo de tioflavina T y la visualización microscópica electrónica de las fibrillas. Mientras que la validación exitosa utilizando estos ensayos es necesaria para el éxito, no son suficientes para garantizar que las PFFs sembrarán inclusiones α-SYN en las neuronas, ya que dicha actividad de agregación de cada lote PFF debe probarse en el cultivo celular o en cohortes de animales piloto. Antes de su uso, las PFFs deben ser sonicadas bajo condiciones estandarizadas con precisión, seguidas de un examen con microscopía electrónica o dispersión de luz dinámica para confirmar que las longitudes de fibrl están dentro del rango de tamaño óptimo, con una longitud media de 50 nm. Las PFFs pueden añadirse a los medios de cultivo celular o utilizarse en animales. La patología detectable por inmunostinamiento para la fosforilada α-SYN (psyn; serina 129) es aparente días o semanas más tarde en el cultivo celular y los modelos de roedores, respectivamente.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (PD) se caracteriza principalmente postmortem por dos principales características patológicas: la generalizada y progresiva alfa-sinuctosis (α-SYN) patología, y la degeneración nigroestriatal. Después de la inyección en ratones o ratas silvestres, las fibrillas α-SYN preformadas (PFFs) inducen la acumulación progresiva de α-SYN patológico, lo que puede resultar en una degeneración prolongada de las neuronas de la dopamina del del substantia nigra compacta (SNpc) en el transcurso de muchos meses, así como déficits sensoriósticos^1,2,3,4,5,6. Las neuronas se exponen a las fibrillas α-SYN, ya sea a través de inyección directa intracerebral o añadidas a los medios de las neuronas cultivadas. Cuando las PFFS se toman en las neuronas, las PFFS actúan para "sembrar" la formación de inclusiones a través de plantillas, y la acumulación de α-SYN endógena en inclusiones fosforiladas^{1,7,8, 9}. Las inclusiones comparten propiedades similares a los cuerpos de Lewy: conteniendo α-SYN fosforilado en serina 129 (pSyn), ubiquitin, y P62; poseer estructuras cuaternarias amiloides como se muestra con tinción de tioflavina positiva; y son resistentes a la digestión proteinasa K^{1,3,5,7,8,9,10,11, 12}. La exposición a la PFF conduce a la formación de la inclusión α-SYN en la primaria y algunas neuronas inmortalizadas en la cultura, así como ratones, ratas y primates no humanos in vivo^{1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13}. Es importante tener en cuenta que las PFFs no llevarán a la formación de la inclusión α-SYN en todos los modelos de cultivo celular y algunas neuronas cultivadas se semilla mejor que otras.

Otra característica importante del modelo in vivo α-SYN PFF son las distintas fases patológicas secuenciales que surgen durante varios meses. En roedores, después de la inyección intrastriatal, la formación de inclusión α-SYN generalmente alcanza picos dentro de la SNpc y muchas regiones corticales dentro de 1-2 meses. Este pico de agregación es seguido por la degeneración nigroestriatal ≈ 2-4 meses después^1,3,5. Estas distintas etapas patológicas proporcionan a los investigadores la plataforma con la que estudiar y desarrollar estrategias que 1) disminuyen la agregación α-SYN, 2) las inclusiones α-SYN ya formadas y/o 3) previenen la neurodegeneración subsiguiente. El modelo PFF ofrece claras ventajas y desventajas en comparación con los modelos de sobreexpresión de vector α-SYN mediado por vectores virales y neurotóxicos, como se ha revisado anteriormente⁶. La elección de qué modelo o enfoque tomar debe determinarse por qué modelo se ajusta mejor a la pregunta que los investigadores están pidiendo.

Aunque el modelo PFF ha sido utilizado con éxito por muchos laboratorios, todavía hay grupos que han experimentado inconsistencias con la generación de fibrillas y la producción de patología α-SYN consistente¹⁴. Ejemplos de inconsistencias van desde las PFFs que producen poca o ninguna patología α-SYN, la eficiencia de siembra de lote a lote, e incluso el fracaso de las fibrillas para formar. Por lo tanto, la estandarización de la generación α-SYN PFF y la aplicación in vivo es fundamental para permitir interpretaciones precisas sobre el impacto de las nuevas intervenciones terapéuticas. El siguiente protocolo describe los pasos requeridos para la generación de PFFs a partir de monómeros α-SYN, el control de calidad in vitro de los PFFs una vez formados, la sonicación y medición de PFFs antes de su uso, y sugerencias para facilitar la inyección exitosa in vivo de PFFs en ratas o ratones.

Protocol

Todos los métodos que involucran animales han sido aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC).

1. formación de fibrillas preformadas por α-sinnucleinas a partir de monómeros (figura 1)

1. Descongelar los monómeros α-synuclein en el hielo, resuspende suavemente moviendo el tubo, y centrifugar a 15.000 x g durante 10 min a 4 ° c.
   Nota: el monómero α-SYN debe formularse específicamente para la fibrlización. Los monómeros recombinantes se pueden comprar a partir de fuentes comerciales o generados por protocolos en el sitio^4,9,14,15. Si se adquiere a partir de fuentes comerciales, el producto debe indicar que el monómero α-SYN es específicamente para la generación de fibrillas. Independientemente de si los monómeros se compran o se generan en el sitio, los pasos de control de calidad descritos a continuación deben realizarse con cada lote para asegurar que las fibrillas se hayan formado y se semilla eficientemente antes de usarlos en experimentos.
2. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y registre la cantidad transferida.
   Nota: tenga cuidado de evitar el pellet, que, si está presente, será pequeño.
3. Mida la concentración proteica del sobrenadante transferido mediante un ensayo de ácido bicinchonínico estándar (BCA) o midiendo la absorbancia a 280 nm con un espectrofotómetro de microvolumen.
   Nota: el ensayo BCA no es tan preciso para la medición específica de α-SYN y puede producir resultados sobreestimar la concentración de proteínas. Como resultado, la medición de la absorbancia a 280 nm es el método recomendado para determinar la concentración de proteínas.
   1. Para medir con el ensayo BCA, siga los protocolos BCA estándar y realice con tres diluciones diferentes de monómero α-SYN. Las diluciones sugeridas son 1:25, 1:50 y 1:100.
   2. Para medir con el método A280, en blanco el lector con la solución salina amortiguada de fosfato (dPBS) estéril 1x Dulbecco sin calcio y magnesio, con una concentración de sal de aproximadamente 100 mM NaCl, y rango de pH 7.0-7.3 (tabla de materiales).
   3. Añadir 2 μL de muestra al lector y leer la absorbancia a 280 nm.
   4. Usa la ley cerveza-Lambert para determinar la concentración de los monómeros.
      
      Nota: el coeficiente de extinción ε para el α-SYN humano es 5.960 M^-1cm^-1 y para el ratón α-SYN es 7.450 m¹cm^-1. El pathlength se mide en cm. el peso molecular de α-SYN (14 kDa) se estima asumiendo 1 da = 1 g/mol.
4. Diluir los monómeros con 1x dPBS a una concentración final de 5 mg/mL. Utilice la siguiente ecuación para calcular la cantidad de 1x dPBS añadida para diluir los monómeros.
   
   Nota: todas las concentraciones están en mg/mL, y los volúmenes en μL. las diluciones de monómero se deben realizar con 1x dPBS. El volumen total utilizado para generar fibrillas debe estar entre 100 y 500 μL para lograr resultados reproducibles de fibrlización.
5. Brevemente vórtice para mezclar, y centrifugar para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo. Monómeros alícuotas para la comparación de control de calidad con fibrillas como se indica en los pasos 1.8.1-1.8.4.
6. Utilice una cerradura de tubo o una película de cera/plástico (tabla de materiales) para fijar la tapa del tubo de microcentrífuga cerrada.
7. Colocar el tubo en una termomezcladora orbital con una tapa de 7 días a 37 ° c, sacudiendo a 1.000 RPM (tabla de materiales).
   Nota: al final de los 7 días, el contenido del tubo debe aparecer turbia. La termomezcladora debe tener una tapa para evitar la formación de condensación en las tapas de los tubos.
8. Deslice suavemente el tubo para resuspender las fibrillas α-SYN. Fibrillas de alícuota para los siguientes pasos de control de calidad como se indica en los pasos 1.8.1-1.8.4.
   Nota: las fibrillas para los pasos de control de calidad pueden almacenarse en RT durante la noche.
   1. Alícuota 6 μL para el ensayo de sedimentación.
   2. Alícuota 5 μL para el ensayo de Unión tioflavina T.
   3. Alícuota 2 μL para la microscopía electrónica de transmisión para visualización de fibrl.
   4. Alícuota al menos 10 μL para el ensayo de endotoxina.
      Nota: para el ensayo de endotoxina, se utiliza un Limulus amebocyte lysate (LAL) comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante (tabla de materiales). Los niveles de endotoxina deben ser ≤ 0,5 unidades de endotoxina/mL para las fibrillas. Si no se cumple este criterio, se puede utilizar un kit de eliminación de endotoxinas.
9. Alícuota las fibrillas restantes y guárdela. Para almacenamiento a largo plazo (12-18 meses), congelar rápidamente en hielo seco, y almacenar a-80 ° c.
   Nota: la cantidad a alícuota depende de la aplicación descendente deseada. El uso in vivo normalmente requiere más fibrillas a concentraciones más altas que el uso in vitro, y los volúmenes de alícuota deben planificarse en consecuencia. Las fibrillas deben almacenarse hacia la parte posterior del congelador para evitar daños causados por la congelación/deshielo potencial. El protocolo se puede pausar aquí.

2. ensayo de sedimentación

1. En un tubo de microcentrífuga limpio, añadir 6 μL de PFF a 54 μL de dPBS para diluir las fibrillas 1:10, y Pipet para mezclar.
   1. En un tubo separado, añadir 6 μL de monómero a 54 μL de dPBS como un control adicional.
2. Centrifugar muestras a 10.000 x g durante 30 min en RT y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
3. Añadir 60 μL de dPBS al Pellet restante y vórtice para resuspend.
4. Añadir 30 μL de búfer de muestra 3x (140 μL de 50% glicerol/0,1% azul de bromofenol, 40 μL de SDS al 10% y 20 μL de β-mercaptoetanol) a cada tubo y vórtice para mezclar.
5. Incubar las muestras a 100 ° c durante 10 min y dejar enfriar durante 5 min sobre hielo.
6. Utilice un protocolo estándar de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) para separar la proteína por masa. Utilice una escalera de proteína con un rango que incluya 14 kDa (la banda de tamaño esperada para el α-SYN monomérico).
7. Transfiera el gel a un plato de tinción y cubra el gel con la mancha azul de Coomassie (0,1% azul brillante de Coomassie, 20% de metanol por volumen y 10% de ácido acético por volumen en ddH₂O). Incubar durante 3 h en RT mientras tiembla.
8. Vierta la mancha azul de Coomassie y añada suficiente desteñir (50% de metanol por volumen y 10% de ácido acético por volumen en DDH₂O) para cubrir el gel. Incubar durante 30 min en RT mientras tiembla.
9. Verter el desteñir y repetir el paso del desteñir hasta que el gel esté despejado y las bandas sean visibles.
10. Lavar el gel 3 veces durante 5 min cada uno agitando en ddH₂O e imagen del gel.

3. microscopía electrónica de transmisión para visualización de fibrl

1. Pesar 20 mg de acetato de uranilo en un tubo de microcentrífuga y añadir 1 ml de DDH₂O para hacer una solución acuosa al 2%. Vórtice hasta que el acetato de uranil esté en solución y permita que se siente durante la noche.
   Nota: el acetato de uranil debe hacerse el día antes de preparar las muestras para la microscopía electrónica de transmisión. La exposición a la luz o a la agitación puede provocar que el acetato de uranil se precipite, como tal, el tubo que contiene la solución de acetato de uranil debe cubrirse en papel de aluminio, mantenerse en un lugar oscuro y no agitarse después de que el acetato de uranil esté en solución.
2. Añadir 2 μL de PFF a 98 μL de dPBS para diluir las fibrillas 1:50, y luego Pipet para mezclar.
3. Prepare una superficie cubierta (de aproximadamente 50 mm x 50 mm) en la parte superior de la mesa para preparar una película limpia de cera/plástico (tabla de materiales). En la película limpia de cera/plástico (tabla de materiales), agregue lo siguiente (figura 2).
   1. Añadir 4 x 10 μL de gotas de ddH₂O.
   2. Añadir 1 x 10 μL de gota de fibrillas diluidas o de la muestra de monómero.
   3. Añadir 2 x 10 μl de gotas de acetato de uranilo al 2%.
4. Utilice fórceps de punta fina para recoger una rejilla de microscopía electrónica de transmisión de cobre con recubrimiento de forvar/carbono, de malla (tabla de materiales).
   Nota: Asegúrese de recoger sólo la rejilla por el borde, evitando la porción de malla en el centro (figura 2A). Si el fórceps toca la malla, la película revestida de Formvar/carbono se dañará, haciendo imposible la creación de imágenes en esa área de la red.
5. Flotar la rejilla Formvar/lado recubierto de carbono (lado brillante) hacia abajo en la primera gota de ddH₂o. utilice suavemente el fórceps para sujetar la rejilla y empuje hacia abajo para asegurar que toda la superficie recubierta esté en contacto con la DDH₂O. Deje que la rejilla flote durante 1 min.
6. Coge la rejilla, y sin tocar la parte de malla de la rejilla, quita la ddH₂O con papel de filtro.
7. Flotar la rejilla como arriba en la segunda gota de ddH₂o durante 1 min y quitar el DDH₂o.
8. Flotar la rejilla en la gota de fibrillas diluidas durante 1 min y quitar el exceso como arriba.
9. Flotar la rejilla en la primera gota de acetato de uranilo durante 1 min y quitar el exceso de la mecha.
10. Flotar la rejilla en la segunda gota de acetato de uranilo durante 1 min, quitar el exceso.
11. Flotar la rejilla como arriba en la tercera gota de ddH₂o brevemente y quitar la DDH₂o.
12. Flote la rejilla como arriba en la cuarta gota de ddH₂o brevemente y quite la DDH₂o, asegurándose de eliminar tanto DDH₂o como sea posible.
13. Transferencia a una caja de rejilla para almacenamiento hasta la toma de imágenes.
    Nota: las rejillas deben secarse durante al menos 5 minutos antes de la toma de imágenes. Las rejillas pueden ser fotografiadas durante al menos un año después de la preparación y deben mantenerse en un ambiente seco.

4. ensayo tioflavina T

1. En un tubo de microcentrífuga limpio, añadir 5 μL de PFF a 245 μL de dPBS para diluir las fibrillas 1:50, y Pipet para mezclar.
2. Añadir 250 μL de dPBS a un tubo de microcentrífuga separado para que sirva como control negativo.
3. Añadir 5 μL de monómero a 245 μL de dPBS para que sirvan de control monómero.
4. Añadir 250 μL de tioflavina T en tampón de glicina (25 μM de tioflavina T, 100 mM de glicina, 1% de Tritón X-100, pH 8,5) a cada muestra y mezclar suavemente.
5. Pipet 2 replica, 200 μL cada uno, en una placa de pozo de 96 negro. Mantener el plato en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo.
6. Incubar durante 1 h en RT y leer la placa utilizando una excitación de 450 nm y emisión de 510 nm.
   Nota: las lecturas de tioflavina T fluctuarán con el tiempo. Las muestras deben leerse en el mismo tiempo de incubación. Si se desea, se pueden tomar varias lecturas durante la incubación de la hora y trazar con el tiempo.

5. la sonicación de fibrillas preformadas α-sinnucleinas

PRECAUCIÓN: el sonicador y todos los pasos de sonicación se realizan en una campana de cultivo para evitar la exposición a las fibrillas que pueden vaporizar durante la sonicación. El personal que realiza los pasos de sonicación debe usar equipo de protección personal, incluyendo guantes, protección de la ropa en forma de una capa de laboratorio, y un escudo facial mientras se sonican. El riesgo de exposición a la fibrl se puede reducir mediante sonicación con un sonicador de cuerno de taza, permitiendo que el tubo que contiene fibrillas permanezca cerrado durante la sonicación.

Nota: los parámetros óptimos de sonicación de las fibrillas dependen del modelo de sonicador utilizado. Por este motivo, será necesario realizar alguna optimización para garantizar que las fibrillas tengan el tamaño correcto. El sonicador utilizado se puede encontrar en la tabla de materiales y los parámetros descritos se basan en resultados anteriores con este modelo de sonicador. Los siguientes parámetros funcionarán para 2-4 μg/μL de PFFs en 200-400 μL de solución. Prueba de sonicación con el instrumento debe realizarse y las fibrillas analizadas para asegurar los resultados deseados se logran antes de usar PFFs en experimentos.

1. Fije una sonda de 3,2 mm de diámetro (tabla de materiales) al convertidor, y fije los parámetros del sonicador como se indica a continuación en el paso 5.1.1-5.1.3.
   1. Ajuste la amplitud al 30%.
   2. Ajuste el pulso a 01 01 (1 s encendido; 1 s apagado).
   3. Establezca el tiempo en 0:01:00.
      Nota: 1 min de pulso equivale a 60 pulsos, y este modelo de sonicador (tabla de materiales) se detendrá automáticamente. Con otros modelos de sonicador, el número de pulsos tendrá que ser contado.
2. Descongelar las fibrillas en RT y diluir con dPBS estéril en una campana de cultivo.
   Nota: un tubo de microcentrífuga transparente de 0,6 mL funciona mejor para la sonicación y la concentración final de fibrl depende del uso previsto. Los resultados representativos mostrados provienen de una concentración final de fibrl de 4 μg/μL.
3. Limpie la sonda del sonicador con un tejido de laboratorio humedecido con etanol al 70% para limpiar la sonda. Sumerja la punta de la sonda en ddH₂O y pulse 10 veces para limpiar aún más la sonda y, a continuación, seque con un tejido de laboratorio.
4. Coloque la punta de la sonda en el tubo de las fibrillas diluidas y coloque la punta en la parte inferior del tubo.
5. Sonicar para 60 pulsos (1 s en; 1 s apagado). Mueva la sonda hacia arriba y hacia abajo durante cada pulso para asegurarse de que todas las fibrillas en el líquido se sonican. y limpias.
6. Después de 60 pulsos, extraiga la sonda de las PFFs y añada 2 μL de PFF a 98 μL de dPBS en un tubo de microcentrífuga limpio para diluir las fibrillas 1:50 para la medición de fibrina sonicada por microscopía electrónica.
   Nota: Idealmente, se debe medir un pequeño subconjunto de fibrillas antes de la inyección in vivo y una medición más exhaustiva de las fibrillas realizadas cuando el tiempo lo permite.
7. Después de la sonicación, centrifugar brevemente PFFs para 1 s a 2.000 x g para recoger todo el líquido de los lados del tubo.
   PRECAUCIÓN: Si el tubo se calienta al tacto, deje de Sonicar después de 30 pulsos, espere 1 min, y Sonicar para los 30 pulsos finales.
   Nota: mientras se somete a ultrasonidos, mantenga la punta de la sonda hacia la parte inferior del líquido al comienzo de cada pulso, demasiado cerca de la parte superior del líquido causará pérdida de la muestra.
8. Sumerja la punta de la sonda en 1% SDS y pulse 10 veces para limpiar la sonda. Quite la punta de la SDS, sumerja en ddH₂O y pulse 10 veces.
9. Limpie la sonda con un tejido de laboratorio humedecido con etanol al 70% y, a continuación, limpie la sonda con un tejido de laboratorio seco. Separe la sonda del convertidor y de la tienda.
10. Limpie todas las superficies del capó con un 1% de SDS, seguida de un 70% de etanol.
    Nota: la solución SDS al 1% se utiliza para disociar las fibrillas y las superficies y equipos limpios¹⁶.

6. microscopía electrónica de transmisión para la medición de las fibrillas sonicadas

Nota: Si la microscopía electrónica no es factible, se puede utilizar un ensayo de tioflavina T cinética y dispersión de luz dinámica como medidas indirectas de eficiencia de siembra y tamaño de fibrl^4,14.

1. Prepare muestras utilizando el protocolo de la sección "microscopía electrónica para la visualización de fibrl" anterior.
2. Utilice un microscopio electrónico de transmisión para tomar una imagen de las fibrillas de 6 a 10 aberturas de rejilla diferentes.
   Nota: las imágenes deben ser una ampliación lo suficientemente alta como para medir las fibrillas, pero lo suficientemente bajas como para visualizar múltiples fibrillas simultáneamente. Una ampliación final de aproximadamente 75.000 x debe ser suficiente.
3. Mida la longitud de un pequeño subconjunto de al menos 25 fibrillas antes de usar fibrillas en un experimento.
   Nota: estas mediciones se pueden realizar normalmente utilizando el software de imágenes asociado con el microscopio. Para la validación rápida, la persona que mide debe seleccionar las fibrillas representativas y calcular el tamaño medio. La longitud de fibrl debe promediar alrededor de 50 nm o menos, con una medición más precisa a seguir.
4. Mida las longitudes de más de 500 fibrillas para obtener resultados más completos.
   Nota: el software de imágenes asociado con el microscopio se puede utilizar para mediciones de fibrl. Alternativamente, las imágenes pueden ser abiertas y las fibrillas medidas con el software de procesamiento de imagen, usando la barra de escala asociada a cada imagen como una referencia de tamaño con la cual comparar las longitudes de la fibrl.

7. preparación de jeringas de aguja de vidrio personalizadas para inyecciones estereotácticas (figura 3)

1. Añadir aproximadamente 10 mL de reactivo siliconizante (tabla de materiales) a un vaso de precipitado limpio de 50 ml.
2. Colocar tubos capilares de vidrio (longitud de 54 mm; diámetro exterior: 0,86 mm; diámetro interior 0,59 mm) verticalmente en el vaso de reactivo siliconizante y permitir que la acción capilar dibuje el reactivo de siliconización en el tubo a través de la abertura del tubo inferior sumergida en el reactivo siliconizante.
3. Pipet reactivo siliconizante adicional en la abertura del tubo superior que no está sumergida en el reactivo siliconizante para llenar completamente el tubo capilar de vidrio.
4. Retire los tubos capilares del reactivo siliconizante y seque los extremos abiertos de los tubos en una toalla de papel para eliminar el reactivo de siliconización en los tubos. Deje secar los tubos capilares durante al menos 8 horas.
5. Coloque un tubo capilar de vidrio siliconado en un extractor de agujas de vidrio (tabla de materiales).
6. Encienda el elemento calefactor y permita que los pesos acoplados estiren el tubo capilar de vidrio calentado.
7. Corte el tubo capilar de vidrio tirado con tijeras en el punto más delgado en el medio y retire la aguja de vidrio del extractor de agujas de vidrio.
   Nota: el diámetro interior y exterior de la aguja extraída debe ser de aproximadamente 80 y 100 μm, respectivamente. Varias agujas de vidrio se pueden hacer a la vez y se almacenan hasta que estén listas para sujetarse a una jeringa de vidrio con aguja metálica adjunta (tabla de materiales).
8. Cortar una longitud de tubo de retractilado (diámetro interior medio 0,021 "y espesor medio de pared 0,001") a aproximadamente 40 mm con tijeras. Deslice el envoltorio retráctil sobre la aguja metálica de una jeringa biselada de 10 μL (tabla de materiales).
9. Use una llama abierta para calentar y adhiera la envoltura retráctil a la aguja mientras rota la aguja para aplicar el calor uniformemente.
10. Deslice el extremo más grande de la aguja de vidrio tirado cuidadosamente sobre la aguja metálica de la jeringa.
11. Corte una longitud de tubo de retractilado (diámetro interior medio 0,036 "y espesor medio de pared 0,005") a aproximadamente 40 mm con tijeras y Deslice cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa (tabla de Materiales). Utilice una llama abierta para calentar el envoltorio retráctil para sujetar la aguja de vidrio a la aguja metálica.
12. Agregue una capa adicional de envoltura retráctil para sujetar la aguja de vidrio. Corte una longitud de tubo de retractilado (diámetro interior medio 0,044 "y espesor medio de pared 0,005") a aproximadamente 40 mm con tijeras y Deslice cuidadosamente sobre la aguja de vidrio para superponer la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica de la jeringa (tabla de Materiales). Utilice una llama abierta para calentar el envoltorio retráctil para sujetar la aguja de vidrio a la aguja metálica.
13. Recortar la aguja de vidrio con tijeras para que la punta sea de aproximadamente 8 mm de largo.
    Nota: la aguja debe ser lo suficientemente larga como para apuntar a las regiones cerebrales deseadas (la longitud requerida depende de las coordenadas dorsal/ventral).
14. Utilice los pasos 7.14.1-7.14.3 para probar la aguja para asegurar que no haya fugas y que exista un caudal adecuado tanto en la retirada como en la dispensación del líquido de la aguja de vidrio.
    1. Llene una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 26 adjunta con dH₂O.
    2. Extraiga el émbolo metálico de la jeringa de aguja de vidrio personalizada e inserte la aguja de la jeringa de dH₂O rellena en la base de la jeringa. Aplicar presión para dosificar dH₂O de la aguja de cristal. Inspeccione la interfaz de la aguja de vidrio y la aguja metálica para obtener fugas y confirme un flujo de dH₂O constante.
       Nota: si es necesario, la aguja de vidrio se puede recortar para aumentar la facilidad de flujo y se añaden capas adicionales de retractilado para reparar cualquier fuga de la base de la aguja de vidrio.
    3. Llene un tubo de microcentrífuga con dH₂o. Utilice la jeringa de aguja de vidrio personalizada para dibujar en el DH₂o. Inspeccione la aguja para confirmar que se está llevando líquido a la jeringa y que no haya burbujas.
       Nota: si hay burbujas o dH₂o no está siendo dibujado en la aguja, recortar la aguja puede ayudar a aliviar la presión.
15. Guarde con cuidado la jeringa con agujas de vidrio adjuntas en las cajas de la jeringa hasta que sea necesario para las cirugías.
16. Utilizar métodos de cirugía estereotaxica estándar para la entrega intrastriatal de PFFs en coordenadas optimizadas en ratones (un sitio: AP + 0,2 mm y ML + 2,0 mm de bregma, DV-2,6 mm de dura) o en ratas (dos sitios: AP + 1,6 mm y ML + 2,0 mm de bregma, DV-4,0 de dura; AP + 0,1 mm y ml + 4,2 mm de bregma, DV-5,0 desde dura)^1,14,17.
    Nota: estas coordenadas se han utilizado en ratones C57BL6/C3H y Fischer 344 ratas. Al utilizar otras cepas, las coordenadas deben optimizarse.

Results

La generación de fibrillas a partir de monómeros α-SYN comienza con la determinación de la concentración de los monómeros. Tanto el ensayo de BCA como la medición de la absorbancia a 280 nm (A280) pueden utilizarse para medir el contenido de proteínas; los resultados del ensayo BCA, sin embargo, sugirieron una concentración más alta que el método A280. Las PFFs derivadas del monómero α-SYN del ratón tenían un valor BCA de 14,05 ± 0,22 y un A280 de 8,05 ± 0,03 μg/μL (figura 1). Asimismo, las PFFs derivadas del monómero α-SYN humano también parecían estar en una concentración más alta, con un valor de BCA de 12,95 ± 0,38 y un A280 de 7,83 ± 0,05 μg/μL (figura 1). Las mediciones de A280 son específicas de α-SYN en función de la inclusión de los coeficientes de extinción y estos resultados se utilizaron para diluir los monómeros antes de la incubación de 7 días.

Antes de la incubación, el líquido que contenía los monómeros α-SYN era claro, pero debería aparecer turbia después de la formación de fibrl. El examen con microscopía electrónica de transmisión confirmó la presencia de fibrillas largas, midiendo 10-20 Nm de ancho (figura 4). En comparación, los monómeros α-SYN apenas eran visibles sin una forma discernible aparente (figura 4). Con la confirmación visual de las estructuras fibrilares, la conformación amiloide de las fibrillas es la siguiente característica de las PFFs que deben confirmarse usando un ensayo de tioflavina T. Thioflavin T exhibe fluorescencia mejorada cuando se enlaza a amiloide; por lo tanto, el aumento de la señal fluorescente de las muestras indica presencia de amiloide. Como ejemplo, tioflavina en dPBS produjo una señal de 3.287 ± 580 unidades fluorescentes relativas (RFU), el monómero de ratón α-SYN produjo una señal de 4.174 ± 158 RFU, y los PFFs del ratón produjeron una señal de 59.754 ± 6.224 RFU (figura 5). En comparación, el monómero α-SYN humano produjo una señal similar de 4.158 ± 105 RFU al monómero del ratón, y las PFFs humanas produjeron una señal más alta de 1.235.967 ± 113.747 RFU en comparación con las PFFs del ratón (figura 5). Para evaluar la presencia de fibrillas pelletables, se realizó un ensayo de sedimentación. Las fibrillas se precipitarán con centrifugación. Tanto en el ratón como en las muestras humanas de PFF, la fracción sobrenadante debe tener más proteínas en el pellet que el sobrenadante (figura 6). En contraste, la mayor parte de la proteína del ratón y de los monómeros humanos estaba presente en el sobrenadante, con poco presente en el pellet (figura 6). Con las PFFs visiblemente presentes por la microscopía electrónica, las estructuras amiloides presentes y las fibrillas granuladas, las PFFs pasaron todos los pasos de control de calidad in vitro.

Tanto el ratón como las PFFS humanas se sonicaron para producir PFFS de longitudes apropiadas para la siembra de inclusiones α-SYN^4,18. Las PFFs se diluyeron a la concentración deseada de 4 μg/μL y se sonicaron. Inmediatamente antes de la cirugía, se fotografiaron 25 fibrillas representativas mediante microscopía electrónica y se midieron para comprobar el tamaño de la fibrl. Los PFFs de ratón sonicados miden 48,8 ± 3,1 nm, mientras que los PFFs humanos miden 52,1 ± 4,4 Nm de longitud; Las PFFs de ambas especies fueron por lo tanto la longitud apropiada (50 nm o menos) para inducir la actividad de siembra. Un examen más exhaustivo de aproximadamente 500 fibrillas reveló la distribución promedio de longitud y longitud de las fibrillas de ratón sonicadas. La longitud media fue de 44,4 ± 0,6 Nm, con un 86,6% de las PFFs que miden 60 nm o menos (figura 4). En comparación, los PFFs humanos promediaron 55,9 ± 1,1 nm con el 69,6% de las PFFs que miden 60 nm o menos (figura 4).

Después de la inyección intrastriatal de PFFS de ratón sonicados en ratas como se describió anteriormente^3,5, una serie de secciones de tejido fueron procesados en 2 meses después de la cirugía, cuando el número de inclusión que contiene neuronas se sabe que pico en el SNpc, para la confirmación de las inclusiones α-SYN fosforiladas⁵. La inclusión de las neuronas de rodamiento, según lo indicado por la tinción inmunohistoquímica para pSyn (anticuerpo en la tabla de materiales), está presente en el SNpc (figura 7), así como en otras regiones del cerebro que inervan el estriado (anterior núcleo olfativo, motor, cingulato, piriforme, prelimbic, somatosensorial, entorhinal, y cortices insulares, amígdala, striatum)^1,3,4,5,19. Estas inclusiones comparten propiedades similares con los cuerpos de Lewy, como la tioflavina de Unión y la resistencia del α-SYN total a la proteinasa K (figura 7), como se muestra en la tinción inmunohistoquímica (anticuerpo y proteinasa k en la tabla de materiales) . La confirmación de la siembra en el cerebro indica que se ha aprobado el control de calidad in vivo, y las alícuas de PFFs previamente congeladas y guardadas del mismo lote pueden ser sonicadas bajo parámetros idénticos, con longitudes validadas, en experimentos más grandes.

Figura 1 . Métodos para la generación de fibrillas α-SYN. Contorno de los pasos requeridos para producir fibrillas a partir de monómeros α-SYN. Los monómeros se centrifugados durante 10 min (15.000 x g, a 4 ° c). El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y la concentración de proteína se determina por la absorbancia a 280 nm, o un ensayo BCA. El gráfico muestra las concentraciones de los monómeros α-SYN humanos y del ratón. Las columnas indican los medios del grupo, las barras de error representan el error estándar ± 1 de la media. Después de determinar la concentración de proteínas, los monómeros α-SYN se diluyen, se vortexan brevemente y se incube durante 37 ° c durante 7 días, mientras se agita en un mezclador orbital fijado a 1.000 RPM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Métodos de tinción para microscopía electrónica de transmisión. Diagrama de tinción negativa para microscopía electrónica. A) imágenes que representan rejillas de muestras de microscopía electrónica. La rejilla tiene un lado opaco o ligero y un lado brillante u oscuro. El lado brillante/oscuro está recubierto con una película de soporte de Formvar/carbono. B) ilustración del procedimiento de tinción. La rejilla está flotando lado brillante/oscuro hacia abajo en la primera gota de ddH₂O durante 1 min y el exceso es malvado con papel de filtro. El proceso se repite con la segunda gota de ddH₂o, las PFFS diluidas o los monómeros, dos gotas de acetato de uranil, y dos gotas adicionales de DDH₂o. las rejillas se pueden almacenar en una caja de rejilla hasta que se haya creado una imagen. Barra de escala = 3 mm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Montaje de jeringas de aguja de vidrio personalizadas. Diagrama de los pasos necesarios para ensamblar jeringas de aguja de vidrio adjuntas. Tubos capilares de vidrio siliconado se extraen y se cortan en el medio para producir agujas de vidrio. El tubo de envoltura retráctil se utiliza para preparar la aguja metálica y formar un sello interior cuando la aguja de vidrio se desliza sobre la aguja metálica. Dos capas adicionales de tubo de envoltura retráctil que se superponen con la base de la aguja de vidrio y la aguja metálica se añaden consecutivamente y se aplica calor para asegurar la aguja de vidrio y formar un sello hermético al agua. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 . Visualización de monómeros α-SYN y fibrillas α-SYN mediante microscopía electrónica de transmisión. Micrografías representativas de monómeros y fibrillas α-SYN. Paneles superiores: ratón y monómero α-SYN humano. Paneles medios: ratón de longitud completa y PFFs humanos α-SYN. paneles inferiores: ratón y PFFs humanos α-SYN después de la sonicación. Gráfico inferior: distribución del ratón sonicado y longitudes de PFF α-SYN humanas. Barra de escala = 500 nm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 . Confirmación de estructuras amiloides por ensayo de tioflavina T. Medición de la señal fluorescente del ratón y del monómero α-SYN humano y de las muestras de PFF. Izquierda: resultados de los monómeros α-SYN del ratón y de las PFFs α-SYN. Derecha: resultados de monómeros α-SYN humanos y PFFs α-SYN. En cada gráfico se muestra un control negativo de dPBS. Todas las mediciones se expresan como unidades fluorescentes relativas (RFU). Las columnas indican los medios del grupo, las barras de error representan el error estándar ± 1 de la media. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 . Ensayo de sedimentación para granulable α-SYN. images de Coomassie teñidos. Las bandas mostradas son aproximadamente 14 kDa basadas en la escalera de proteína. Izquierda: monómero de ratón y PFFs. Derecha: monómeros humanos y PFFs. Para todas las muestras de monómero y PFF, se muestra el pellet resuspendido (P) y el sobrenadante (S). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 . Características de las inclusiones en el modelo de rata confirmando la patología α-SYN. Micrografías representativas de la del substantia nigra pars compacta a los 2 meses después de la inyección. Izquierda: neuronas que contienen pSyn y contra teñida con violeta cresilo. Medio: thioflavin S neuronas positivas. Derecha: inclusiones que contienen α-SYN resistentes a la proteinasa K. barra de escala = 50 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La producción de PFFs α-SYN capaces de sembrar neuronas y dar lugar a inclusiones como el cuerpo de Lewy depende de múltiples factores y pasos. Un factor crítico es que los monómeros utilizados para generar fibrillas necesitan ser formulados específicamente para la fibrlización^4,9,14,15. Si los monómeros no están formulados para la fibrlización, es posible que las fibrillas no se formen o que las fibrillas que forman la forma no produzcan patología α-SYN. Del mismo modo, el buffer en el que se encuentran los monómeros influye también en la fibrlización. Como tal, para obtener los mejores resultados, la concentración de sal debe ser de aproximadamente 100 mM NaCl y pH entre 7,0 y 7,3. Un paso inicial que introduce la variabilidad es el método por el cual se determina el contenido inicial de proteínas, con una medición en A280 que probablemente produzca resultados más precisos y por lo tanto es el método preferido. La discrepancia en la concentración de proteínas puede disminuir la eficacia del proceso de fibrlización, así como alterar la concentración de PFF asumida utilizada en los experimentos. Ambos podrían conducir a una disminución en la eficiencia de siembra y la variación de lotes entre los experimentos.

Los pasos de control de calidad iniciales confirmarán las características críticas de las PFFs, específicamente que tienen una conformación fibrilar (microscopía electrónica), contienen estructuras amiloides (ensayo tioflavina T) y son peleticos (ensayo de sedimentación). Es importante tener en cuenta que los resultados del ensayo de tioflavina T fluctuarán con el tiempo y no son una medida directa de la cantidad de estructuras amiloides presentes, más bien, el ensayo de tioflavina T debe utilizarse sólo como un indicador de la presencia de estructuras amiloides dentro la muestra. Tioflavina T se utiliza típicamente en ensayos in vitro, como el mencionado ensayo para mostrar que las fibrillas contienen estructuras amiloides. Alternativamente, tioflavina S se utiliza en el tejido para detectar estructuras amiloides, como se muestra en la figura 7. En lo que respecta al ensayo de sedimentación, los resultados sólo muestran que las PFFs se encuentran predominantemente en la fracción pelletable. A medida que las muestras se ejecutan en condiciones de desnaturalización, una sola banda prominente de aproximadamente 14 kDa, el tamaño de los monómeros α-SYN, está presente en los geles. Esto es diferente a las múltiples bandas presentes en pesos moleculares más altos que se esperarían con PFFs si se utilizaba un gel nativo o sin desnaturallamiento. Por último, el paso exitoso de todos estos pasos de control de calidad inicial no garantiza la actividad de siembra de inclusión α-SYN. Por esta razón, los experimentos de cultivo celular o una pequeña cohorte de animales inyectados quirúrgicamente deben utilizarse para probar la eficacia de las PFFs antes de su uso en experimentos más grandes.

La sonicación es un paso crucial en el proceso y los parámetros diferirán dependiendo del modelo de sonicador utilizado. Los parámetros de sonicación deben ser aplicados y verificados para mostrar que se han producido fragmentos cortos de PFF. El tamaño de fibrl tiene relación con la siembra, con la siembra de fibrillas más cortas de manera más eficiente. Aunque la semilla de fibrillas más cortas es más eficiente, este efecto mesetas y la longitud óptima del PFF es aproximadamente 50 nm^4,18. También es importante no Sonicar excesivamente las muestras y exponer las PFFs a calor excesivo, ya que esto puede disminuir la eficiencia de siembra. Estos PFFs sonicados deben ser probados para la eficacia en cultivo de células pequeñas o experimentos in vivo antes de su uso en experimentos a mayor escala. Como diferentes sesiones de sonicación tienen el potencial de introducir la variabilidad, los grupos de tratamiento experimental deben planificarse en consecuencia.

Cuando se entregan PFFS in vivo, la localización de los sitios de inyección y la cantidad total de PFFS utilizados puede afectar el número de neuronas que desarrollarán inclusiones, así como la extensión de la neurodegeneración^7,14. Las coordenadas en el protocolo proporcionan un lugar para comenzar, pero deben probarse dentro del laboratorio para garantizar que la región objetivo deseada desarrolle patología α-SYN antes de su uso en experimentos a gran escala. Si lo desea, puede utilizar un tinte de rastreo o perlas fluorescentes como una forma de probar la segmentación regional antes de usar PFFs. La cantidad de PFFS utilizadas en vivo varía entre grupos, con la mayoría de los grupos que utilizan un total de entre 5 a 20 μg de PFFS en uno o dividido entre dos sitios de inyección^{1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14}. como el número de sitios de inyección, ubicación de los sitios de inyección, y la cantidad de PFFS inyectados pueden efectos resultados y la progresión de la sinnucleinopatía, los resultados descendentes de los parámetros utilizados deben caracterizarse antes de utilizar el modelo para probar posibles intervenciones o examinar las características temporales del modelo.

Al seleccionar un modelo a utilizar para la prueba de la terapéutica o el estudio de la progresión de la enfermedad, el modelo utilizado debe ser seleccionado para responder mejor a la pregunta. No todos los modelos poseerán ciertas características de la enfermedad de PD, u ofrecerán el plazo necesario para probar posibles intervenciones. El modelo PFF recapitula características clave de la PD, como la patología α-SYN y la neurodegeneración, y puede conducir a deficiencias motoras modestas. El modelo ofrece un curso de tiempo predecible y prolongado, donde las inclusiones forman meses antes de la neurodegeneración. Esto permite a los investigadores examinar y explotar las diferentes fases a lo largo de la progresión prolongada de la sinnucleinopatía. Se espera que el uso actual y futuro del modelo en general sea beneficioso en el estudio de la progresión de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato Thermo	Fisher (Gibco)	14190144
Anticuerpo anti-alfa-sinucleína (fosforilada en serina 129)	Abcam	AB184674
Anticuerpo anti-alfa-sinucleína	Abcam	AB15530
Ácido bicinchónico	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Tubo retráctil médico transparente (diámetro interior de 0,036 pulgadas)	Nordson Medical	103-0143
Tubo retráctil médico transparente (diámetro interior de 0,044")	Nordson Medical	103-0296
Sulfato de cobre	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop tapa calefactada	Eppendorf	5308000003
Formvar/Recubierto de carbono Rejillas de microscopía electrónica	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Tubo capilar de vidrio (0,53 mm de diámetro exterior; 0,09 mm de diámetro interior; 54 mm de longitud)	Drummond	22-326223
Tirador de agujas de vidrio	Narishige	PC-10
Jeringa Hamilton		Hamilton 80000
Monómero de alfa-sinucleína humana para generar fibrillas	preformadasProteos	RP-003
Monómero de alfa-sinucleína de ratón para generar fibrillas preformadas	Proteos	RP-009
Tubo retráctil médico naranja (diámetro interior de 0,021")	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinasa K	Invitrogen	25530015
Qsonica punta	de 3,2 mmQsonica	4422
Sónico Qsonica Q125	Qsonica	Q125
Tioflavina S	Sigma-Aldrich	T1892
Tioflavina T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Cromogénico LAL Endotoxina Kit de ensayo Genscript		L00350C
Acetato de uranilo	Eletron Microscopy Sciences	22400